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MHCⅠ类分子BF2*0201递呈ALV-J表位结构和递呈机制解析

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畜牧兽医学报 2024年第7期55卷 3132-3142页

作者：贾玉生李易霖马露露廖明代曼曼华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广州510642

MHC B2单倍型鸡对禽白血病病毒感染有较强抗性,这种抗病性可能与被MHC分子递呈的表位刺激活化的T细胞产生的免疫应答有关。本研究拟阐明MHCⅠ类分子BF2*0201递呈ALV-J表位结构和递呈机制。利用凝胶过滤层析筛选出能与MHCⅠ稳定结合的肽... 详细信息

MHC B2单倍型鸡对禽白血病病毒感染有较强抗性,这种抗病性可能与被MHC分子递呈的表位刺激活化的T细胞产生的免疫应答有关。本研究拟阐明MHCⅠ类分子BF2*0201递呈ALV-J表位结构和递呈机制。利用凝胶过滤层析筛选出能与MHCⅠ稳定结合的肽。利用晶体初筛试剂盒在体外培育肽和MHCⅠ的二元复合物晶体,并利用COOT、CCP4和PYMOL等软件对该晶体结构进行解析和分析。在这项研究中,作者发现二个与BF2*0201稳定结合的ALV-J CTL表位FVDFANRLI和SALQAFREV。得到一个优质晶体BF2*0201-SALQAFREV(SV9),其生长条件为1.0 mol·L^(-1)丁二酸(pH 7.0),0.1 mol·L^(-1)HEPES(pH 7.0),1%聚乙二醇单甲醚2000。解析高分辨率(1.72?)的BF2*0201-SV9复合物结构后发现BF2*0201抗原结合槽整体呈现弱负电性。保守的残基多位于抗原结合槽的两端,特异性氨基酸赋予BF2*0201中等大小的抗原结合槽。B、C和F口袋起着较重要的锚定作用,口袋残基和水分子与抗原多肽形成氢键作用,将其固定在抗原结合槽中。SV9表位构象中突出的P4-Gln和P7-Arg残基的构象特征表明该位点有被特异性TCR潜在识别的特性。BF2*0201-SV9复合物晶体结构特征有助于阐明B2单倍型MHCⅠ类分子BF2*0201递呈ALV-J表位的机制,有助于解释B2单倍型鸡对ALV存在抗性的原因,为抗病育种工作奠定理论基础。

关键词： MHC BF2*0201 ALV-J 递呈机制晶体结构

与鸡内皮血管瘤病例相关的禽白血病病毒K亚群分离及其gp85基因演化分析

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畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1127-1136页

作者：梁灿新郑小雪舒雪利周婉怡廖明曹伟胜华南农业大学兽医学院广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业部兽用疫苗创制重点实验室广州510642

本研究在华南地区某规模化种禽场调查中发现其部分花鸡品系头部鸡冠下缘及眼睑上缘部位出现白色、质地坚硬且形状不规则的肿块,为了解患病鸡的发病特征及致病因子而开展了实验室诊断及相关病原研究。结果表明该规模化养殖场主要发病鸡... 详细信息

本研究在华南地区某规模化种禽场调查中发现其部分花鸡品系头部鸡冠下缘及眼睑上缘部位出现白色、质地坚硬且形状不规则的肿块,为了解患病鸡的发病特征及致病因子而开展了实验室诊断及相关病原研究。结果表明该规模化养殖场主要发病鸡群为父母代花鸡,发病率约为2%,剖检无其他肉眼表观病变,病理组织学诊断为内皮血管瘤。RT-PCR检测肿瘤组织表明为K亚群禽白血病病毒(ALV-K)感染,无其他禽肿瘤性病毒感染。对患病鸡的血浆样品(32份)、肿瘤组织匀浆(6份)及脑组织匀浆(6份)进行病毒的分离鉴定,成功从脑组织样品中分离到4个ALV-K毒株(GXJL01~GXJL04)。使用特异性引物扩增GXJL01~GXJL04的env基因并测序,在与华南地区其他5个规模化种禽场中分离获得的7个ALV-K流行株的gp85基因的遗传演化分析中表明,GXJL01~GXJL04与日本的Km5844、Sp53等神经胶质瘤毒株(fowl glioma-inducing virus, FGV)及具有神经组织嗜性的ALV-K毒株JS15SG01同一进化分支上,与本研究其他7个ALV-K分离株的遗传进化关系较远。同时在针对ALV-K的gp85蛋白氨基酸位点突变分析中发现,GXJL01~GXJL04存在多个与FGV和JS15SG01参考株相似的氨基酸位点突变。本研究首次把地方黄羽鸡品种花鸡头部的肿块诊断为内皮血管瘤,且ALV-K为内皮血管瘤的主要相关病原,分离株GXJL01~GXJL04区别于现行华南地区ALV-K流行株且与FGV、JS15SG01等神经组织嗜性的毒株高度同源。

关键词：黄羽肉鸡鸡内皮血管瘤 K亚群禽白血病病毒遗传进化分析

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J亚群禽白血病病毒血液核酸筛查技术的建立

畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 1115-1126页

作者：董欣怡李锦群陈钦玺廖明曹伟胜华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业部兽用疫苗创制重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广州510642

为缩短J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)检测周期,进一步加快禽白血病净化进程,本研究结合SYBR GreenⅠqPCR和混样检测,建立了一种适用于低ALV-J流行率场景下的快速筛检ALV-J的血液核酸筛查技术(ALV-J blood ... 详细信息

为缩短J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)检测周期,进一步加快禽白血病净化进程,本研究结合SYBR GreenⅠqPCR和混样检测,建立了一种适用于低ALV-J流行率场景下的快速筛检ALV-J的血液核酸筛查技术(ALV-J blood quantitative polymerase chain reaction, ALV-J-B-qPCR)。根据GenBank中ALV-J pol及env基因序列,设计ALV-J的特异性引物,并优化反应条件,建立了ALV-J SYBR GreenⅠqPCR检测方法。以ALV-J病毒分离为阳性的鸡抗凝血为实验材料,分别制备抗凝血DNA、血细胞DNA、外周血淋巴细胞DNA、外周血淋巴细胞cDNA和血浆cDNA 5类血液检测模板进行ALV-J的PCR检测,筛选最佳检测模板;进一步比较蒸馏水破裂红细胞法提取混合血液DNA的混样方法,血液混样总体积为200μL的混样方法,血液混样总体积为10μL的混样方法共3种混样方法的检测准确性,筛选最佳混样方法。综合上述qPCR方法、检测模板与混样方法,成功建立了ALV-J-B-qPCR。运用ALV-J-B-qPCR分别进行预期流行率为1%~2%、4%~5%场景下的模拟筛查试验,并与病毒分离法比较。qPCR方法的特异性、灵敏性和重复性试验显示,该方法仅特异性扩增ALV-J,对标准质粒的最低检测限度为1×10^(2)copies·μL^(-1),批内与批间变异系数均性最高,为最佳混样方法。在样本数为400份,预期流行率为4%~5%场景的模拟筛查中,ALV-J-B-qPCR检出率为6.25%,比病毒分离法高2.00%;在样本数为400份,预期流行率为1%~2%场景的模拟筛查中,ALV-J-B-qPCR检出率为2.25%,比病毒分离法高0.75%。本研究建立的ALV-J-B-qPCR技术具有灵敏性高、检测快速和节约成本的优势,为种禽场加快ALV净化进程提供了新的思路和方法。

关键词： J亚群禽白血病病毒实时荧光定量PCR 混样检测筛查技术

2018—2022年我国H5亚型禽流感的流行特点及防控

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中国家禽 2024年第1期46卷 90-96页

作者：尤博文陈禧悦廖明代曼曼华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东广州510642

H5亚型高致病性禽流感在我国频繁发生,对我国养禽业造成严重危害,同时亦对我国公共卫生带来了巨大挑战。近年来,随着H5亚型禽流感病毒的不断进化,其在我国的流行情况也发生了一定变化。文章对2018年1月—2022年11月我国暴发的H5亚型禽... 详细信息

H5亚型高致病性禽流感在我国频繁发生,对我国养禽业造成严重危害,同时亦对我国公共卫生带来了巨大挑战。近年来,随着H5亚型禽流感病毒的不断进化,其在我国的流行情况也发生了一定变化。文章对2018年1月—2022年11月我国暴发的H5亚型禽流感相关公共数据进行分析,并结合血清学和病原学的监测数据,阐述了H5亚型禽流感病毒传播与进化过程、流行情况和特点,以期为我国H5亚型禽流感的防控提供理论依据。

关键词： H5亚型禽流感流行特点防控

STM2503调控鼠伤寒沙门菌的生物被膜形成和压力适应性

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中国农业科学 2024年第16期57卷 3294-3304页

作者：王南威李莉莉陈凯风周洲平潘鹏关晋徐成刚廖明张建民华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室/农业农村部人兽共患病重点实验室/农业农村部兽用疫苗创制重点实验室/广东省动物源性人兽共患病重点实验室

【目的】通过揭示c-di-GMP通路基因STM2503调控鼠伤寒沙门菌生物被膜形成，进而影响其环境应激能力的机制，以期挖掘调控鼠伤寒沙门菌压力适应性的关键因子，为防控策略的制定提供理论依据。【方法】以λ-Red同源重组方法构建STM2503缺... 详细信息

【目的】通过揭示c-di-GMP通路基因STM2503调控鼠伤寒沙门菌生物被膜形成，进而影响其环境应激能力的机制，以期挖掘调控鼠伤寒沙门菌压力适应性的关键因子，为防控策略的制定提供理论依据。【方法】以λ-Red同源重组方法构建STM2503缺失株，并利用质粒PBAD表达STM2503来构建相应的基因回补株。然后通过检测不同STM2503表达水平菌株中信号分子c-di-GMP的含量揭示STM2503对菌株胞内c-di-GMP水平的影响。接下来，利用细菌运动性检测、结晶紫染色等试验检测了STM2503对菌株运动性和生物被膜形成能力的影响，并利用实时荧光定量PCR从基因层面揭示其对菌株运动性和生物被膜形成的调控机制。最后，通过抗生素处理、氧化应激、消毒剂应激等试验探究了STM2503对鼠伤寒沙门菌压力适应性的影响。【结果】与野生株（WT269）相比，STM2503的缺失使菌株胞内c-di-GMP含量升高了37.51%(P性降低1—3倍，且在氧胁迫和SDS消毒剂胁迫下表现出了更强的适应能力。【结论】STM2503参与信号分子c-di-GMP的降解，并通过抑制胞外基质的合成降低鼠伤寒沙门菌的生物被膜形成能力，通过上调鞭毛合成基因的表达增强菌株的运动性，进而降低菌株的耐药性和环境压力适应能力，本研究为鼠伤寒沙门菌关键防控靶点的挖掘提供了理论基础。

关键词：鼠伤寒沙门菌 c-di-GMP STM2503 生物被膜运动性

广东某种鸡场鸡白痢沙门菌的分离鉴定及耐药性、毒力基因检测

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中国畜牧兽医 2024年 5033-5042页

作者：周迪魏科段千禧曹伟胜华南农业大学兽医学院广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业农村部兽用疫苗创制重点实验室

【目的】了解某种鸡场鸡白痢沙门菌感染情况,并对其耐药性及毒力基因情况进行分析,旨在为鸡白痢防控提供依据。【方法】试验采集疑似患鸡白痢的病鸡肝脏病料进行沙门菌的分离培养,利用特异性引物通过PCR扩增对分离株进行菌种鉴别。使用... 详细信息

【目的】了解某种鸡场鸡白痢沙门菌感染情况,并对其耐药性及毒力基因情况进行分析,旨在为鸡白痢防控提供依据。【方法】试验采集疑似患鸡白痢的病鸡肝脏病料进行沙门菌的分离培养,利用特异性引物通过PCR扩增对分离株进行菌种鉴别。使用多位点序列分型(MLST)技术获得其分子分型,利用琼脂稀释法测定分离株的最小抑菌浓度;运用二代基因测序技术分析分离株的耐药性与毒力基因特征。【结果】本研究共分离获得5株鸡白痢沙门菌分离株,分别命名为SPNH05-1～SPNH05-5。MLST分型结果显示,5株分离株均为ST92型。药敏试验结果显示,分离株均为多重耐药,共存在2种耐药谱:氨苄西林+萘啶酸+磺胺异噁唑和氨苄西林+萘啶酸+磺胺异噁唑+多黏菌素B。对分离株SPNH05-1、SPNH05-2进行二代基因测序,结果显示,2株分离株存在β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类、多肽类等28种耐药基因,存在151种毒力基因,主要与沙门菌黏附、三型分泌系统、应激、毒素等有关。【结论】本研究结果表明该种鸡场存在多重耐药鸡白痢沙门菌感染,分离株携带多种耐药和毒力基因,试验结果为该种鸡场鸡白痢净化提供参考。

关键词：鸡白痢沙门菌分离鉴定耐药性毒力基因

猪轮状病毒G9P[7]型云南株的分离鉴定及VP4和VP7基因测序分析

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动物医学进展 2024年第8期45卷 1-7页

作者：王修武邓可辉马沐林关金连韩淑杰郭智轩孙守湖贺东生岭南现代农业科学与技术、广东省实验室肇庆分中心广东肇庆526238 华南农业大学兽医学院、广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东广州510640

为确定云南省某猪场仔猪腹泻的病原,对送检腹泻病仔猪小肠组织样品进行猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)RT-PCR检测,将PoRV检测阳性... 详细信息

为确定云南省某猪场仔猪腹泻的病原,对送检腹泻病仔猪小肠组织样品进行猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)RT-PCR检测,将PoRV检测阳性样品处理后接种至MA-104细胞进行PoRV分离;对分离毒株进行间接免疫荧光、电镜观察、胶体金检测和VP4、VP6、VP7基因测序及遗传进化分析。结果显示,仔猪肠道组织样品经终浓度20μg/mL的胰酶在37℃孵育2 h,能在MA-104细胞上增殖传代,第3代出现稳定的细胞病变,盲传20代,每隔5代进行PoRV的检测;间接免疫荧光试验可见特异性荧光,胶体金和RT-PCR检测均为PoRV阳性,电镜观察可见病毒粒子直径约为65 nm,呈车轮状,符合PoRV粒子典型形态特征,将该分离株命名为PoRV YN-A株。基因同源性比较和遗传进化树分析显示,YN-A株的VP6基因序列与国内A群GD株的同源性为99.93%,VP7与中国G9型NJ2012株的同源性为99.12%,VP4与美国P[7]型OSU株的同源性为98.91%,确定该分离株为猪A群轮状病毒G9P[7]型。YN-A株VP7序列在9个氨基酸位点存在点突变,即aa9(I→V)、aa16(V/T→I)、aa44(A→V)、aa100(D/E→N)、aa212(T/A→K)、aa221(N→S)、aa225(V→A)、aa271(I→V)、aa267(D→E)。首次从云南地区的腹泻仔猪小肠组织中成功分离到1株G9P[7]型的新基因型PoRV毒株,为PoRV的致病性、分子生物学特性研究及PoRV G9优势基因型新疫苗研发奠定了基础。

关键词：猪A群轮状病毒分离鉴定 G9基因型基因测序电镜观察

欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GD2022株的分离鉴定及遗传进化分析

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动物医学进展 2024年第3期45卷 34-41页

作者：邓可辉王修武郭智轩韩淑杰孙守湖贺东生岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心广东肇庆526238 华南农业大学兽医学院/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东广州510640

为了解广东省欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-1)流行情况,将RT-PCR检测PRRSV-1阳性的病料(肺脏和淋巴结)接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs)进行病原分离鉴定,以分离毒株核酸作为模板,对分离的PRRSV-1进行全基因克隆和测序,并与国内外PRRSV-... 详细信息

为了解广东省欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-1)流行情况,将RT-PCR检测PRRSV-1阳性的病料(肺脏和淋巴结)接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs)进行病原分离鉴定,以分离毒株核酸作为模板,对分离的PRRSV-1进行全基因克隆和测序,并与国内外PRRSV-1和PRRSV-2参考毒株序列进行同源性及遗传进化分析。结果显示,成功分离1株PRRSV-1,命名为GD2022株,其接种PAMs可引起典型的细胞病变,从出现病变的F5细胞中提取核酸,用PCR分段扩增出PRRSV-1 GD2022株10个基因组片段,分别连接到pCE2 TA/Blunt-Zero载体进行测序,拼接后获得PRRSV-1 GD2022株全基因组长15058个核苷酸(不包含polyA尾)。同源性分析显示,该分离株全基因组序列与PRRSV-1参考毒株(LV株)和PRRSV-2参考毒株(VR2333株)核苷酸序列同源性分别为87%和59.7%。遗传进化树分析显示,全基因序列和ORF5基因与国内外PRRSV-1毒株为同一进化分支,且与疫苗毒分支较远,推断分离株为1株PRRSV-1,属于基因亚型1。氨基酸序列比对分析显示,ORF3和ORF4重叠区域缺失3个核苷酸,导致GP3蛋白和GP4蛋白分别在第245和第65氨基酸位点缺失了1个氨基酸,且与LV株比对,GD2022毒株GP5的氨基酸序列在中和抗原表位第33氨基酸位点(D→A)出现点突变,在高变区第56氨基酸位点(D→A)和第63氨基酸位点(G→D)出现两处突变。重组分析显示,GD2022毒株未发生重组事件。成功分离鉴定1株PRRSV-1毒株,为国内PRRSV-1生物学特性研究提供了材料,也为了解广东省内PRRSV-1流行情况及变异特点提供参考依据。

关键词：欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定全基因组测序遗传进化分析

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5株H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化分析

中国动物传染病学报 2024年

作者：宋苏美关蕴卢军黄小武张俊生赵璐翔袁世超王英英杨素焦培荣华南农业大学兽医学院岭南现代农业科学与技术广东省实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室柳州市动物疫病预防控制中心拱北海关

为了解分离自广东的5株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的分子特征和遗传进化，本研究对分离株进行全基因组测序、分子特征分析和进化树构建。结果显示：5株H9N2亚型AIV的HA蛋白裂解位点基序为RASR↓GLF或RSSR↓GLF，均仅含有一个碱性氨基酸... 详细信息

为了解分离自广东的5株H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的分子特征和遗传进化，本研究对分离株进行全基因组测序、分子特征分析和进化树构建。结果显示：5株H9N2亚型AIV的HA蛋白裂解位点基序为RASR↓GLF或RSSR↓GLF，均仅含有一个碱性氨基酸，符合低致病性禽流感病毒特征；除S183毒株外，其余4株病毒HA蛋白第234位（H9编码）氨基酸均为L，具有结合α-2，6-唾液酸受体偏好性；HA蛋白第236位氨基酸均为G；5株病毒的PB2蛋白第627、701位氨基酸分别为E、D，属于典型禽源禽流感病毒的分子特征。遗传进化分析结果显示，5株H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA基因均属于Y280-like分支；PB2和M基因均属于G1-like分支；PB1、PA和NP基因均属于F/98-like分支。本研究为了解该亚型病毒的遗传进化和流行情况提供科学依据。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒分子特征遗传进化