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细胞外信号调节激酶1／2信号通路在慢性哮喘模型大鼠支气管平滑肌细胞迁移功能变化中的调控作用

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生理学报 2007年第1期59卷 94-102页

作者：谢敏刘先胜徐永健张珍祥白晶倪望陈士新华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科武汉430030

本研究旨在探讨细胞外信号调节激酶1／2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)信号通路在慢性哮喘模型大鼠支气管平滑肌细胞(bronchial smooth muscle cells,BSMCs)迁移能力改变中的调控作用。应用卵清蛋白致敏和雾化方法制... 详细信息

本研究旨在探讨细胞外信号调节激酶1／2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)信号通路在慢性哮喘模型大鼠支气管平滑肌细胞(bronchial smooth muscle cells,BSMCs)迁移能力改变中的调控作用。应用卵清蛋白致敏和雾化方法制备大鼠慢性哮喘模型,体外培养大鼠BSMCs,采用免疫荧光细胞化学、Western blot和RT-PCR方法检测ERK1／2信号通路的表达,分别用平面迁移实验和跨膜迁移实验来评价BSMCs的活动和趋向迁移能力,并比较用和不用ERK1／2信号通路干预剂的差异。Western blot结果显示慢性哮喘模型大鼠BSMCs中总ERK1／2(9．13±0．87)较对照组(4．68±0．59)明显增加,磷酸化ERK1／2(p-ERK1/2)占总ERK1／2的比值(0．55±0．05)较对照组(0．48±0．04)显著提高(n=10,P<0．01)。慢性哮喘组ERK1和ERK2 mRNA的表达(1．83±0．24和1．07±0．11)较对照组(0．58±0．14和0．51±0．12)明显增高(n=10,P<0．01)。在平面迁移实验中,慢性哮喘大鼠BSMCs的迁移最远距离是对照组的(2．9±0．1)倍,在ERK1／2激动剂表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)刺激下增加到(5．0±0．2)倍,而在30μmol／L PD98059的作用后下降到(1．7±0．2)倍。正常对照大鼠BSMCs平面迁移能力对PD98059的反应较慢性哮喘组弱,仅在100μmol／L PD98059的作用下下降到(0．8±0．1)倍。跨膜迁移实验中,慢性哮喘大鼠BSMCs的跨膜迁移细胞是对照组的(1．9±0．1)倍,在EGF刺激下增加到(3．1±0．2)倍,而在30μmol/L PD98059作用后下降到(1.45±0.2)倍。这些结果表明慢性哮喘模型大鼠BSMCs的迁移能力明显增强,ERK1／2信号通路在该功能变化的调控中可能发挥了重要作用。

关键词：细胞外信号调节激酶哮喘支气管平滑肌细胞迁移

MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86及对混合淋巴细胞反应的影响

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中华医学杂志 2007年第10期87卷 710-713页

作者：周咏明郭伟薛克营周浩程艳香郭天南李慧玉黄士昂华中科技大学同济医学院附属协和医院干细胞应用与研究中心武汉430022 华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌科华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸科华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科

目的研究蛋白酶体抑制剂 MG132诱导 HL-60细胞表达共刺激分子 CD80、CD86及其对混合淋巴细胞反应的作用。方法流式细胞仪检测 MG132诱导 HL-60细胞表达共刺激分子CD80、CD86及细胞活力;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析 CD80和 CD86 mRNA... 详细信息

目的研究蛋白酶体抑制剂 MG132诱导 HL-60细胞表达共刺激分子 CD80、CD86及其对混合淋巴细胞反应的作用。方法流式细胞仪检测 MG132诱导 HL-60细胞表达共刺激分子CD80、CD86及细胞活力;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析 CD80和 CD86 mRNA 表达情况;75 Gy照射 MG132诱导的 HL-60细胞后,用 CCK-8检测提高共刺激分子表达后,HL-60细胞对健康人单个核细胞的增殖作用。结果 MG132上调 HL-60细胞表达 CD86,高浓度的 MG132对 HL-60细胞有直接杀灭作用,MG132诱导 HL-60细胞表达共刺激分子 CD86后,对健康人单个核细胞起增殖作用。结论 MG132诱导 HL-60细胞表达共刺激分子 CD86,促进对健康人单个核细胞的增殖作用。

关键词：蛋白酶抑制药抗原 CD86 淋巴细胞培养试验混合

蛋白激酶C对慢性缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞电压门控钾通道的作用

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中华结核和呼吸杂志 2003年第6期26卷 379-380页

作者：张永昶倪望甄国华张珍祥徐永健华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸疾病研究室武汉430030

蛋白激酶C(PKC)在缺氧性肺动脉高压的发病机制中起着重要的作用.但PKC对正常和慢性缺氧肺动脉平滑肌细胞(PASMC)上电压门控钾离子通道(Kv通道)的影响尚少报道.我们的研究旨在探讨PKC对慢性缺氧PASMC膜上Kv通道的作用,以进一步阐明缺氧... 详细信息

蛋白激酶C(PKC)在缺氧性肺动脉高压的发病机制中起着重要的作用.但PKC对正常和慢性缺氧肺动脉平滑肌细胞(PASMC)上电压门控钾离子通道(Kv通道)的影响尚少报道.我们的研究旨在探讨PKC对慢性缺氧PASMC膜上Kv通道的作用,以进一步阐明缺氧性肺动脉高压的发病机制.

关键词：蛋白激酶C 慢性缺氧肺动脉平滑肌细胞电压门控钾通道肺动脉高压发病机制

木瓜蛋白酶致大鼠肺气肿中碱性成纤维细胞生长因子mRNA的表达

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中华结核和呼吸杂志 2001年第4期24卷 241-242,I004页

作者：傅娟徐永健张珍祥华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸疾病研究室武汉430030

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种具有促进细胞生长增殖作用的多肽类生长因子，在维持机体的生长发育及促进多种组织的损伤修复中起着十分重要的作用。我们通过对木瓜蛋白酶（Papain）致大鼠肺气肿模型肺组织和肺泡巨噬细胞bFGF m... 详细信息

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种具有促进细胞生长增殖作用的多肽类生长因子，在维持机体的生长发育及促进多种组织的损伤修复中起着十分重要的作用。我们通过对木瓜蛋白酶（Papain）致大鼠肺气肿模型肺组织和肺泡巨噬细胞bFGF mRNA表达的研究，来探讨其在肺气肿形成过程中与肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原增长的关系。材料与方法（1）肺气肿动物模型的制备与分组：健康Wistar大鼠42只，体重200～250 g，雌雄不拘（由同济医科大学实验动物中心提供），随机分为肺气肿模型1，3，5，7，15，30天组和正常对照组，每组6只。以2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉动物后，实验组气管内注射8%木瓜蛋白酶(美国Sigma公司)0.05 ml/100 g，对照组以同样方法注入相应量的生理盐水。（2）组织细胞标本制作：以2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，行气管插管，向肺内灌注生理盐水，每次5～10 ml，共8次，回收支气管肺泡灌洗液，离心，弃上清，同法用RPMI1640（美国Gibco产品）培养液洗涤细胞1次，用含10%新生小牛血清（Gibco产品）的RPMI1640调细胞浓度至1×106/ml，加入铺有盖玻片的6孔培养板中，置37℃，5% CO2培养箱（Hera Cell德国产）培养24 h后，肺泡巨噬细胞贴壁，取出长有细胞的盖玻片，用4%多聚甲醛固定20～30 min，再用酒精梯度脱水后，置-70℃冰箱保存备用。灌洗肺后取下双肺，向肺内注入4%多聚甲醛，直至肺膨胀边缘变锐、胸膜展平，结扎气管，浸泡于4%多聚甲醛中固定10 h。取左下肺叶常规石蜡包埋、切片、HE染色。（3）免疫组织化学染色：用即用型链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex，SABC)免疫组织化学染色试剂盒和兔抗鼠collagen Ⅰ及collagen Ⅲ多克隆抗体及DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）进行免疫组织化学染色。（4）bFGFmRNA原位杂交：用bFGF寡核苷酸探针和敏感加强型原位杂交检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）对组织细胞标本原位杂交。

关键词：肺气肿木瓜蛋白酶碱性成纤维细胞生长因子 mRNA表达

线粒体膜电位对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞内细胞色素C分布及细胞增殖的影响

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华中科技大学学报（医学版） 2008年第2期37卷 166-169,280页

作者：胡红玲张珍祥汪涛赵建平徐永健华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸疾病研究室武汉430030

目的从线粒体ATP敏感性钾通道(MitoKATP)入手,研究在缺氧影响大鼠肺动脉平滑肌细胞内细胞色素C的分布及其引起细胞增殖变化中线粒体膜电位(Δψm)的作用。方法获取大鼠正常肺组织,分离出肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)进行常氧或慢性缺氧培... 详细信息

目的从线粒体ATP敏感性钾通道(MitoKATP)入手,研究在缺氧影响大鼠肺动脉平滑肌细胞内细胞色素C的分布及其引起细胞增殖变化中线粒体膜电位(Δψm)的作用。方法获取大鼠正常肺组织,分离出肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)进行常氧或慢性缺氧培养。将标本分为6组:①正常对照组;②MitoKATP开放剂Diazoxide组;③MitoKATP阻断剂5-hydroxydecanoate(5-HD)组;④慢性缺氧(CH)组;⑤CH+Diazoxide组;⑥CH+5-HD组。利用激光共聚焦显微镜成像检测线粒体膜电位,Western blot法检测线粒体和细胞质中细胞色素C蛋白含量,流式细胞仪检测细胞周期,MTT法检测细胞增殖情况。结果①Diazoxide作用24 h后,细胞R-123荧光强度明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞胞质与线粒体细胞色素C的比值明显降低,细胞明显增殖,凋亡减少,与正常对照组比较均P0.05;②慢性缺氧24 h,结果与Diazoxide组相似,各项指标与正常对照组比较均P<0.05;CH+Diazoxide组与CH组比较,细胞R-123荧光强度明显增强,线粒体膜电位去极化,细胞胞质与线粒体细胞色素C的比值明显降低,细胞明显增殖,凋亡减少,与CH组比较均P<0.05;CH+5-HD组与CH组比较,细胞R-123荧光强度明显减弱,线粒体膜电位部分消失,细胞胞质与线粒体细胞色素C的比值明显升高,细胞增殖减少,凋亡增多,与CH组比较均P<0.05。结论缺氧可以引起MitoKATP的开放以及线粒体膜电位去极化,进而抑制了细胞色素C从细胞线粒体释放到细胞质,抑制线粒体凋亡途径,从而参与并影响了肺动脉高压的发生发展。

关键词：肺动脉平滑肌细胞缺氧钾通道线粒体膜电位细胞色素C

吸烟大鼠肺组织中基质金属蛋白酶2 mRNA及其蛋白的表达

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中华结核和呼吸杂志 2001年第12期24卷 759-760,I003页

作者：傅娟徐永健张珍祥华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸疾病研究室武汉430030

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一类具有金属(锌,钙)离子依赖性的、结构上高度同源性的内肽酶家族.我们采用免疫组织化学、逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹试验(Western Blot)技术,半定量观察肺组织Ⅳ型胶原、... 详细信息

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一类具有金属(锌,钙)离子依赖性的、结构上高度同源性的内肽酶家族.我们采用免疫组织化学、逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹试验(Western Blot)技术,半定量观察肺组织Ⅳ型胶原、MMP-2 mRNA及MMP-2蛋白表达的变化,来探讨吸烟所致肺气肿的发病机制.材料与方法 (1)动物模型的制作与分组:健康Wistar大鼠42只,体重150～200 g,雌雄不拘(由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供),随机分为不吸烟组,吸烟1、2、3、4、5、6月组,每组6只.实验用香烟为武汉市售红双喜牌过滤嘴香烟(武汉卷烟厂制).

关键词：吸烟肺组织基质金属蛋白酶2 mRNA 免疫组织化学逆转录多聚酶链反应

慢性低氧对大鼠膈肌细胞L型钙通道电流的影响

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华中科技大学学报（医学版） 2003年第3期32卷 250-252页

作者：赵丽敏熊盛道牛汝楫徐永健张珍祥华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸疾病研究室武汉430030

目的　研究慢性低氧对急性分离的大鼠膈肌细胞L型钙通道电流的影响。方法　采用标准的全细胞膜片钳 (wholecellpatchclamp)技术 ,记录并比较正常对照组与慢性低氧组大鼠单个膈肌细胞的膜电容 ,L型钙电流的峰值和电流电压关系曲线。结... 详细信息

目的　研究慢性低氧对急性分离的大鼠膈肌细胞L型钙通道电流的影响。方法　采用标准的全细胞膜片钳 (wholecellpatchclamp)技术 ,记录并比较正常对照组与慢性低氧组大鼠单个膈肌细胞的膜电容 ,L型钙电流的峰值和电流电压关系曲线。结果　正常对照组与慢性低氧组大鼠单个膈肌细胞的膜电容分别为 (15 0 0± 12 6 )pF和(174 0± 13 3)pF ,低氧组显著大于正常对照组 (P <0 0 5 ,n =6 ) ;L型钙电流的峰值分别为 (- 1 0 5± 0 19)nA和(- 0 97± 0 16 )nA ,两组之间无显著差异。当膜电位处于 - 2 0～ +40mV时 ,慢性低氧组大鼠单个膈肌细胞的L型钙电流密度 [(- 5 6± 0 8)pA/pF]较正常对照组 [(- 7 0± 1 4 )pA/pF]显著下降 (P <0 0 5 ,n =6 )。结论　慢性低氧能使大鼠单个膈肌细胞的膜电容增加 ,L型钙电流的幅度不变 ,因此L型钙电流密度下降。

关键词：慢性低氧膈肌细胞 L型钙通道膜片钳

脂多糖对慢性阻塞性肺疾病患者气道上皮细胞Toll样受体4表达的影响

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中华结核和呼吸杂志 2006年第7期29卷 448-451页

作者：李雯徐永健浙江大学医学院附属第二医院呼吸内科-浙江大学呼吸疾病研究所杭州310009 华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科

目的探讨脂多糖(LPS)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者原代培养的气道上皮细胞Toll样受体4(TLR4)介导的炎症反应及其作用机制。方法华中科技大学同济医学院同济医院胸外科2004年1月至10月因肺部肿瘤而行肺叶切除术的患者24例,体外分离其肺... 详细信息

目的探讨脂多糖(LPS)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者原代培养的气道上皮细胞Toll样受体4(TLR4)介导的炎症反应及其作用机制。方法华中科技大学同济医学院同济医院胸外科2004年1月至10月因肺部肿瘤而行肺叶切除术的患者24例,体外分离其肺标本并培养气道上皮细胞,根据肺功能检查结果及有无吸烟史分为COPD组、非COPD吸烟对照组及非COPD不吸烟对照组,每组8例。用100μg／L LPS刺激原代培养的气道上皮细胞;采用流式细胞仪(FCM)检测原代培养的气道上皮细胞表面的TLR4,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测其TLR4 mRNA表达。结果FCM检测显示,COPD组的气道上皮细胞表面TLR4荧光阳性细胞数[(10．23±0．58)％]与非COPD吸烟对照组及非COPD不吸烟对照组比较差异均有统计学意义[(1．52±0．06)％、(1．78±0．06)％, q=5．61、5．38,P均0．05]。LPS刺激前,COPD组气道上皮细胞TLR4 mRNA(吸光度值)水平(0．359±0．032)与非COPD吸烟对照组及非COPD不吸烟对照组比较差异均有统计学意义(0．147±0．008、0．152±0．013,q=5．12、4．99,P均0．05)。结论慢性炎症和LPS刺激导致原代培养的COPD患者气道上皮细胞表面TLR4和TLR4 mRNA水平升高可能是COPD发病的一个关键因素。

关键词：肺疾病,慢性阻塞性脂多糖类上皮细胞 Toll样受体4

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华中科技大学学报（医学版） 2002年第3期31卷 287-289,312页

作者：陈仕新王孝养方慧娟徐永健华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸疾病研究室武汉430030

用逆转录 PCR(RT- PCR)法对手术切除的 4 0例肺癌组织 ,9例肺部良性实质性病变和 2 2例癌旁正常组织的端粒酶逆转录酶 (h TERT)、 RNA成分 (h TR)和相关蛋白 1(h TEP1) m RNA表达进行了检测 ,并与肺癌的病理分型、TNM分期进行了比较。... 详细信息

用逆转录 PCR(RT- PCR)法对手术切除的 4 0例肺癌组织 ,9例肺部良性实质性病变和 2 2例癌旁正常组织的端粒酶逆转录酶 (h TERT)、 RNA成分 (h TR)和相关蛋白 1(h TEP1) m RNA表达进行了检测 ,并与肺癌的病理分型、TNM分期进行了比较。发现肺癌组织、肺部良性实质性病变、癌旁正常组织的 h TR、h TEP1普遍呈阳性表达 ,3组间阳性率比较差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ,而 h TERT基因表达肺癌组织 (32 / 4 0 ,80 % )高于良性实质性病变 (5 / 9,5 6 % ) ,也高于癌旁正常组织 (3/ 2 2 ,13% ) ,3组间差异有极显著性 (P<0 .0 0 1)。h TERT在肺癌组织中的表达率期 (14 / 14 ,10 0 % )高于期 (11/ 14 ,78% ) , 期高于期 (7/ 12 ,5 8% )。鳞、腺癌间 h TERT m RNA表达无显著差异。结果表明 :端粒酶基因表达上调在肺癌发生发展中起重要作用 ,端粒酶也参与部分肺部良性实质性病变发病机制 ;用 RT- PCR检测 h TERT m RNA表达有助于肺癌恶性程度的判断和肺部良。

关键词：端粒酶逆转录酶 RNA 相关蛋白1基因临床意义端粒酶肺癌逆转录聚合酶链反应