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桃仁及苦杏仁DNA检测试剂盒的研制与评价

中国药学杂志 2022年第6期57卷 478-485页

作者：宋顺佳姜菲菲关奕泽赵远贾慧建邵学超艾金霞孙丽媛北华大学医学技术学院吉林吉林132013

目的本研究旨在研制一种快速检测试剂盒,鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,并对其进行性能评价。方法建立DNA提取方法,确保有效提取桃仁及苦杏仁基因组DNA,紫外分光光度法测其浓度及纯度。美国国立生物技术信息中心(NCBI)查询并比对桃仁及苦杏仁... 详细信息

目的本研究旨在研制一种快速检测试剂盒,鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,并对其进行性能评价。方法建立DNA提取方法,确保有效提取桃仁及苦杏仁基因组DNA,紫外分光光度法测其浓度及纯度。美国国立生物技术信息中心(NCBI)查询并比对桃仁及苦杏仁的ITS序列,针对特异性位点,NCBI Primer-Blast设计种属特异性引物。建立并优化聚合酶链式反应(PCR)检测体系,DH5α感受态细胞克隆特异性片段,测序验证体系准确性,制备阳性对照。组装DNA检测试剂盒,对其特异性、稳定性及重复性进行评价,并对市售桃仁和苦杏仁样品进行检测。结果所建立DNA提取方法,提取效率高,DNA质量浓度高于100 ng·μL^(-1),A_(260/280)处于1.80~2.10之间。该试剂盒可准确鉴定桃仁及苦杏仁DNA成分,检测灵敏度高,特异性强,最低检测限为1 ng·μL^(-1)。反复冻融20次后仍可有效检测,可于-20℃保存1年。20个市售样品中检出1个桃仁伪品及2个苦杏仁伪品,其余均为正品。结论桃仁及苦杏仁DNA检测试剂盒特异性强、灵敏性高、稳定性好,具有良好重复性,可快速鉴定桃仁及苦杏仁,为桃仁中药材市场质量安全管理提供有力支持。

关键词：桃仁苦杏仁 ITS 试剂盒聚合酶链式反应

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PCR-核酸试纸条快速鉴定皮氏罗尔斯顿菌

南方医科大学学报 2022年第12期42卷 1867-1874页

作者：王丹赵潇颖姜菲菲孙丽颖许萌宿建胜赵云冬北华大学医学技术学院吉林吉林132013

目的基于PCR-核酸试纸条技术,建立快速检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌的方法。方法利用煮沸法提取皮氏罗尔斯顿菌基因组DNA,以皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA为靶基因使用NCBI primer-BLAST 5.0设计一对特异性引物,经克隆转入大肠杆菌感受态细胞... 详细信息

目的基于PCR-核酸试纸条技术,建立快速检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌的方法。方法利用煮沸法提取皮氏罗尔斯顿菌基因组DNA,以皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA为靶基因使用NCBI primer-BLAST 5.0设计一对特异性引物,经克隆转入大肠杆菌感受态细胞DH5α,鉴定PCR产物;分别在引物的5’端标记FITC与Biotin;组装核酸试纸条,建立PCR-核酸试纸条的方法;优化反应体系中胶体金标记的链霉亲和素与抗体浓度的最佳工作量;并对试纸条进行反应原理验证及灵敏度、特异性、稳定性评价;对某生物科技有限公司制药用水检测出的7株皮氏罗尔斯顿菌进行实验并利用MEGA构建进化树,对污染溯源进行分析。结果煮沸法提取基因组浓度较好,纯度1.8~2.0;PCR产物经克隆转化、测序比对,与GenBank已登记的皮氏罗尔斯顿菌16S rDNA相似度为100%;利用胶体金放大原理,每100μL胶体金溶液中,加入3.5μL链霉亲和素进行标记,硝酸纤维素膜上检测线为2.0 mg/mL抗FITC抗体,质控线为1.2 mg/mL生物素化BSA,与阳性扩增产物结合产生红色条带;按照优化条件进行试纸条组装,每100μL样品展开液中加入8μL PCR产物,反应5 min后观察结果;核酸试纸条特异性结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致,仅有皮氏罗尔斯顿菌为阳性结果,不动杆菌、气单胞菌、假单胞菌、非脱羧勒克氏菌均为阴性结果;核酸试纸条灵敏度评价,将DNA浓度降至10-5ng/μL时,试纸条检测线仍有条带,较琼脂糖凝胶电泳结果灵敏度高1000倍;核酸试纸条稳定性评价,将试纸条在3、6、9、12月进行检测,稳定性较好。结论建立PCR-核酸试纸条技术检测制药用水中皮氏罗尔斯顿菌,具有简单快速、特异性强、灵敏度高、成本较低等优点,适用于制药企业对制药用水的日常检测。

关键词：皮氏罗尔斯顿菌制药用水 PCR-核酸试纸条药品污染菌

应用多重PCR技术鉴别3种肾源性中药的实验研究

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中国药学杂志 2022年第12期57卷 1015-1020页

作者：邵博宇杨畅徐宁于文莹迟凯月高丽君夏薇张亚丽艾金霞高锋北华大学医学技术学院吉林吉林132013

目的建立一种应用多重聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别3种肾源性药品的方法。方法提取梅花鹿、驴、犬3个物种肾组织的基因组DNA,通过多重PCR对梅花鹿、驴、犬的特异性片段进行扩增,鉴别样品中是否含有梅花鹿、驴、犬3种动物源性成分。结果... 详细信息

目的建立一种应用多重聚合酶链式反应(PCR)技术鉴别3种肾源性药品的方法。方法提取梅花鹿、驴、犬3个物种肾组织的基因组DNA,通过多重PCR对梅花鹿、驴、犬的特异性片段进行扩增,鉴别样品中是否含有梅花鹿、驴、犬3种动物源性成分。结果通过对特异性片段的PCR扩增,可同时将梅花鹿、驴、狗的肾与其他物种进行区分。结论本研究建立了一种基于多重PCR技术的快速、准确的同时鉴别梅花鹿、驴、犬3个物种肾源性药品方法,为解决药用性产品易混、难以鉴定的问题提供了又一个新方法。

关键词：多重聚合酶链式反应种属鉴别肾源性中药

中药材三斑海马DNA指纹鉴定方法及检测试剂的研究

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药物分析杂志 2023年第6期43卷 1053-1060页

作者：吴楠孟媛周童张宇彤李洋洋刘琳李亚茹艾金霞高丽君母润红北华大学医学技术学院吉林132013

目的:建立中药材三斑海马DNA指纹鉴定方法,研制三斑海马DNA检测试剂盒。方法:利用生物信息学对海马种属的Cytb基因进行分析,以该基因作为靶基因,设计特异性引物,研制三斑海马DNA提取及PCR快速检测试剂,应用分子克隆及测序技术,克隆三斑... 详细信息

目的:建立中药材三斑海马DNA指纹鉴定方法,研制三斑海马DNA检测试剂盒。方法:利用生物信息学对海马种属的Cytb基因进行分析,以该基因作为靶基因,设计特异性引物,研制三斑海马DNA提取及PCR快速检测试剂,应用分子克隆及测序技术,克隆三斑海马阳性对照药材,并对快速检测试剂盒的特异性、稳定性、重复性及灵敏度进行考察,对市售三斑海马样品进行真伪鉴定。结果:基于Cytb序列可对三斑海马及其混伪品进行区分。自主研发的三斑海马快速检测试剂提取的海马DNA纯度和浓度均可达到PCR的要求,在退火温度为61.5℃时引物特异性最强;克隆测序后三斑海马DNA序列与海马mtDNA Cytb特异指纹区段序列一致;自主研制的试剂重现性、稳定性良好,检测浓度最低限为10^(-3)ng·μL^(-1);对17个市售样品进行检测,合格率为88.2%。结论:建立了一种特异、准确的检测中药材三斑海马DNA指纹鉴定方法;研制的三斑海马DNA检测试剂盒操作简便,灵敏度高,检测结果稳定。

关键词：三斑海马 DNA指纹鉴定 Cytb 检测试剂 DNA提取方法聚合酶链式反应分子克隆

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MicroRNA体外检测的研究进展

化学通报 2023年第4期86卷 444-450页

作者：汪香君李迎刘墨祎汪洺卉刘丽梅北华大学医学技术学院吉林市132013

MicroRNA (miRNA)是一类内源性、进化高度保守的小分子非编码RNA,通过识别同源序列及干扰转录、翻译或表观遗传以调节基因的表达。研究发现,某些miRNA的异常表达与疾病相关,可作为生物标志物或药物靶点为疾病诊断、治疗及预后提供新思路... 详细信息

MicroRNA (miRNA)是一类内源性、进化高度保守的小分子非编码RNA,通过识别同源序列及干扰转录、翻译或表观遗传以调节基因的表达。研究发现,某些miRNA的异常表达与疾病相关,可作为生物标志物或药物靶点为疾病诊断、治疗及预后提供新思路,而准确测定miRNA的表达是其应用于临床的关键。本文结合近年来研究成果对传统检测方法及其改进和等温核酸扩增的新技术进行概述,分析这些方法的优势与不足。

关键词： miRNA 传统检测方法等温核酸扩增技术

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新型杂合肽DY-CA的构建及抑菌活性评价

药物分析杂志 2022年第12期42卷 2082-2091页

作者：邵学超赵潇颖王丹马嘉辉赵远宋顺佳贾慧建孙丽媛赵云冬北华大学医学技术学院吉林132013

目的:构建高活性、低毒性的新型杂合肽,对其抗肺炎克雷伯菌活性进行评价,探讨其在防治肺炎克雷伯菌引起的呼吸道感染的潜在应用价值。方法:通过生物信息学软件分析亲本肽dyskinbow-1ST的理化性质,预测杂合肽活性区域,确定与天蚕素Cecrop... 详细信息

目的:构建高活性、低毒性的新型杂合肽,对其抗肺炎克雷伯菌活性进行评价,探讨其在防治肺炎克雷伯菌引起的呼吸道感染的潜在应用价值。方法:通过生物信息学软件分析亲本肽dyskinbow-1ST的理化性质,预测杂合肽活性区域,确定与天蚕素Cecropin A的构建策略;应用生物信息学软件分预测杂合肽的理化性质及抑菌活性;通过固相法合成杂合肽DY-CA,用杂合肽对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(MIC)试验,杂合肽对肺炎克雷伯菌的时间生长曲线,羊血红细胞溶血试验,分析DY-CA的抑菌活性及生物相容性;通过结晶紫染色定量法观察生物膜的改变,研究杂合肽对肺炎克雷伯菌生物膜的抑制与清除效率。结果:经在线软件预测分析,杂合肽DY-CA为稳定的带正电荷疏水性抗菌肽,试验测得杂合肽的MIC为64μg·mL^(-1);对肺炎克雷伯菌的抑菌作用具有时间和浓度依赖性,杂合肽在3 h后表现出明显的抑制作用,2MIC、1MIC的杂合肽A基本上没有变化,肺炎克雷伯菌的生长完全被抑制;在有效浓度下,羊血红细胞溶血率为4.23%(<5%)为阴性;0.5MIC(t_(0.5MIC)=11.10,P<0.05)、1MIC(t_(1MIC)=17.96,P<0.05)、2MIC(t_(2MIC)=14.18,P<0.05)的杂合肽DY-CA均可抑制肺炎克雷伯菌生物膜的形成;0.5MIC(t_(0.5MIC)=11.10,P<0.05)的杂合肽DY-CA对肺炎克雷伯菌成熟生物膜清除效果不明显,1MIC(t_(1MIC)=17.96,P<0.05,)、2MIC(t_(2MIC)=14.18,P<0.05)的杂合肽DY-CA可显著破坏肺炎克雷伯菌成熟生物膜。结论:本试验设计构建并筛选了具有高活性、低毒性的新型杂合肽DY-CA,对肺炎克雷伯菌具有高效、快速的抑菌作用,有望成为防治肺炎克雷伯菌引起的呼吸道疾病的新型药物。

关键词： dyskinbow-1ST 天蚕素杂合肽生物信息学抑菌活性生物膜

临床免疫学检验技术课堂教学与课程思政相结合的教学展示——以胶体金免疫层析技术为例

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中国免疫学杂志 2023年第6期39卷 1211-1213页

作者：杨巍艾金霞王雪松王刚王淼孙丽媛北华大学医学技术学院吉林132013

本文以“胶体金免疫层析技术”的课堂教学为例,介绍了在新型冠状病毒感染疫情防控背景下,教师如何把专业知识与课程思政有效融合,在完成教学目标的同时,实现对学生的思想道德素质的提升,落实立德树人综合教育理念的探索和实践。

关键词：临床免疫学检验技术课程思政胶体金免疫层析技术

基于重组减毒沙门氏菌载体递送疫苗及药物的肿瘤免疫治疗研究新进展

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中国免疫学杂志 2023年第3期39卷 670-672,F0003,F0004页

作者：李琦陈多多王弘瑞胡迪杨明孙丽媛(指导) 北华大学医学技术学院吉林132013

沙门氏菌介导的肿瘤免疫治疗方法已经成为抗肿瘤研究领域的热点之一。首先,沙门氏菌作为兼性厌氧菌,能够特异性地定植在肿瘤区域,直接杀伤肿瘤细胞或诱导机体产生免疫反应,介导包括巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞等在内的免疫细胞浸润从... 详细信息

沙门氏菌介导的肿瘤免疫治疗方法已经成为抗肿瘤研究领域的热点之一。首先,沙门氏菌作为兼性厌氧菌,能够特异性地定植在肿瘤区域,直接杀伤肿瘤细胞或诱导机体产生免疫反应,介导包括巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞等在内的免疫细胞浸润从而发挥抗肿瘤效应。其次,沙门氏菌具有高度遗传修饰性,可被改造为毒力减低或精准靶向的重组沙门氏菌。此外,重组沙门氏菌还可作为疫苗、细胞毒性药物、RNAi和纳米颗粒递送的有效平台,在治疗的同时还可预防肿瘤的复发和转移。如重组沙门氏菌载体活疫苗裂解系统,能够加强肿瘤抗原呈递,促进T细胞发挥杀伤效应。本文介绍了减毒沙门氏菌载体的抗肿瘤免疫特性和肿瘤靶向性,并对以重组减毒沙门氏菌为递送系统进行肿瘤免疫治疗的研究进展进行综述。

关键词：沙门氏菌肿瘤疫苗细胞毒性药物 RNAi

东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的结构预测及生物学活性分析

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生物工程学报 2021年第8期37卷 2890-2902页

作者：刘悦邵学超王天添王鑫莹李南赵云冬夏薇孙丽媛北华大学医学技术学院吉林吉林132013

运用生物信息学方法进行东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的进化、结构及抗原表位预测,分析其抑菌机理及结构性质,应用小鼠伤口愈合实验及体外抑菌实验进行活性验证。同时为改良亲本肽、进行新型衍生肽的研发提供理论基础。使用软件MEGAX对d... 详细信息

运用生物信息学方法进行东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的进化、结构及抗原表位预测,分析其抑菌机理及结构性质,应用小鼠伤口愈合实验及体外抑菌实验进行活性验证。同时为改良亲本肽、进行新型衍生肽的研发提供理论基础。使用软件MEGAX对dybowskin-1ST及其他蛙类抗菌肽进行同源性比对并绘制系统进化树;通过在线软件ProtParam、ProtScale、PeptideCutter、SignalP、TMHMM Server分别预测抗菌肽dybowskin-1ST的理化参数、亲/疏水性、剪切位点、信号肽及跨膜区域;分别应用SOPMA、Jpred4及DNAstar Protean软件多重分析预测dybowskin-1ST的二级结构,利用SWISS-MODEL和I-TASSER软件进行三级结构预测。通过在线软件ABCpred和SYFPEITHI进行T/B抗原表位预测。构建小鼠伤口模型,观察dybowskin-1ST促进伤口愈合活性。应用纸片法及96孔板法,确定dybowskin-1ST的抑菌活性。抗菌肽dybowskin-1ST含有59个氨基酸,其中亮氨酸占16.9%,分子式为C_(318)H_(510)N_(80)O_(93)S_(2),理论等电点为5.10,电荷量为-2。抗菌肽dybowskin-1ST与东北林蛙抗菌肽dybowskin-1CDYa亲缘较近。三种方法二级结构预测结果相似,dybowskin-1ST中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规卷曲,所占比例分别为44.07%、16.95%、3.39%、35.39%。三级结构预测中显示该抗菌肽大部分为α-螺旋结构,抗菌肽dybowskin-1ST总体预测为亲水性蛋白,具有信号肽序列。亚细胞定位分析显示,其分泌线粒体靶向肽的可能性为0.944。该蛋白属于膜外蛋白,无跨膜结构区,有7个磷酸化位点,3个T细胞抗原表位和8个B细胞抗原表位。dybowskin-1ST具有促进伤口愈合的作用,能够有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性,但对真菌及耐药菌的抑菌活性有限。dybowskin-1ST结构中虽富含α-螺旋,但验证实验表明其抑菌能力仍有待加强,原因可能是由于其带负电荷且为亲水性蛋白,以提高正电荷数及改变疏水性为基本思路进行氨基酸改造可获得活性升级的衍生肽。

关键词：林蛙抗菌肽生物信息学伤口愈合抑菌作用