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抗人红细胞抗体和HIV抗原融合蛋白的构建及活性鉴定

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中华实验和临床病毒学杂志 2007年第1期21卷 76-78页

作者：胡燕杨健洋朱雷侯俊沈宏辉貌盼勇解放军第三0二医院传染病研究所病毒研究室北京100039

目的构建及表达抗红细胞（RBC）单链抗体（ScFv）和HIV抗原的融合蛋白，并做活性测试。方法将鼠抗人红细胞单链抗体可变区重链、轻链基因与HIV抗原基因相连，重组于高效表达载体中，并在大肠埃希菌中表达。结果经ELISA检测和红细胞... 详细信息

目的构建及表达抗红细胞（RBC）单链抗体（ScFv）和HIV抗原的融合蛋白，并做活性测试。方法将鼠抗人红细胞单链抗体可变区重链、轻链基因与HIV抗原基因相连，重组于高效表达载体中，并在大肠埃希菌中表达。结果经ELISA检测和红细胞凝集检测，证明表达的融合蛋白具有HIV抗原和抗人红细胞的双重活性，可使含有HIV抗体的红细胞悬液凝集。结论融合蛋白构建成功，可用于HIV的快速检测。

关键词：融合蛋白 HIV 凝集试验

HBV感染患儿外周血NK及NKT细胞分析与临床意义

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中华实验和临床病毒学杂志 2009年第1期23卷 59-61页

作者：杨斌陈黎明叶文华张鸿飞程云解放军第三○二医院传染病研究所北京100039

目的探讨慢性乙型肝炎（CHB）患儿外周血NK及NKT细胞变化特点及与肝病病情的关系。方法采用流式细胞术对CHB患儿42例、正常儿童15例的外周血NK细胞及NKT细胞进行检测，并结合血清转氨酶（ALT）和病毒载量水平进行统计学分析。结果CHB患... 详细信息

目的探讨慢性乙型肝炎（CHB）患儿外周血NK及NKT细胞变化特点及与肝病病情的关系。方法采用流式细胞术对CHB患儿42例、正常儿童15例的外周血NK细胞及NKT细胞进行检测，并结合血清转氨酶（ALT）和病毒载量水平进行统计学分析。结果CHB患儿外周血NK细胞与正常儿童相应的细胞群比较，差异有统计学意义（P〈0．05），而NKT细胞则无统计学（P〈0．05）。结论CHB患儿外周血NK细胞频数较正常儿童明显升高。

关键词：儿童保健服务肝炎病毒乙型杀伤细胞天然流式细胞术

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端粒和端粒酶与肝细胞的永生化

中国临床康复 2006年第41期10卷 143-145页

作者：赵擎辛绍杰貌盼勇解放军总医院军医进修学院解放军第三○二医院传染病研究所病毒室北京市100039 解放军第三○二医院传染病研究所病毒室

目的:端粒是位于真核细胞染色体末端的蛋白-DNA复合体,保护染色体完整性和稳定性。端粒酶是一种特殊的细胞核蛋白反转录酶,能以自身的RNA为模板,反转录合成端粒DNA序列,添加到染色体末端。端粒酶介导的端粒延长作为细胞中端粒缩短的主... 详细信息

目的:端粒是位于真核细胞染色体末端的蛋白-DNA复合体,保护染色体完整性和稳定性。端粒酶是一种特殊的细胞核蛋白反转录酶,能以自身的RNA为模板,反转录合成端粒DNA序列,添加到染色体末端。端粒酶介导的端粒延长作为细胞中端粒缩短的主要补偿机制,对正常细胞以及肿瘤细胞延长分裂代数起着重要作用。分化良好并具有肝脏正常合成代谢功能的永生化肝细胞在生物医学研究,尤其是肝细胞移植、生物人工肝支持治疗以及药理学和毒理学研究方面具有广泛的应用前景。资料来源:应用计算机检索Pubmed数据库1990-01/2005-12有关端粒、端粒酶和肝细胞永生化的文章,检索词“telomere,telomerase,hepatocyte,immortalization”,限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库、万方数据库1994-01/2005-12期间的相关文章,检索词“端粒、端粒酶、永生化、肝细胞”,限定文章语言种类为中文。资料选择:纳入标准:①有关端粒和端粒酶结构和功能的研究文献。②有关端粒、端粒酶与肝细胞永生化相关性的文献。排除标准:重复研究。资料提炼:共收集到32篇有关端粒、端粒酶与肝细胞永生化相关性的文献,查找全文,从中选取14篇作为主要参考文献。资料综合:将所选文献资料按照以下顺序归纳总结:①端粒的结构和功能:端粒是指位于真核细胞染色体末端的一种特殊结构,由富含G的DNA重复序列与端粒结合蛋白所构成的一种蛋白-DNA复合体,它既可保护染色体不受核酸酶的破坏,又避免了因DNA粘性末端的裸露而发生的染色体融合。②端粒酶的结构和功能:端粒酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶,能以自身的RNA为模板,反转录合成端粒DNA序列,添加到染色体末端,以补偿细胞分裂时端粒DNA缩短,使细胞克服危机期,成为永生化细胞。③端粒、端粒酶在肝细胞永生化:将端粒酶基因转染正常的人体细胞能使一部分细胞的寿命延长,这一技术目前已成功用于延缓组织工程细胞的衰老。结论:端粒酶的活化和端粒长度的维持与肝细胞永生化密切相关,端粒酶介导的永生化肝细胞为生物人工肝脏、肝细胞移植等临床治疗提供了细胞学基础。

关键词：端粒端粒,末端转移酶肝细胞文献综述

新型肠道病毒分离株（BJ302）全基因组序列测定及分析

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中华实验和临床病毒学杂志 2008年第2期22卷 110-112页

作者：侯俊胡燕沈宏辉白冰珂王志杰貌盼勇解放军第三О二医院传染病研究所病毒室北京100039

目的测定并分析新分离肠道病毒基因组序列，从病毒的分子生物学角度研究其分类学位置。方法从1例不明病因的急性肝炎患者粪便标本中提取病毒RNA，以随机引物逆转录PCR法及5′、3′RACE扩增病毒全基因序列。将拼接得到的核苷酸序列及推... 详细信息

目的测定并分析新分离肠道病毒基因组序列，从病毒的分子生物学角度研究其分类学位置。方法从1例不明病因的急性肝炎患者粪便标本中提取病毒RNA，以随机引物逆转录PCR法及5′、3′RACE扩增病毒全基因序列。将拼接得到的核苷酸序列及推断的氨基酸序列与GenBank数据库中序列进行比较并建立系统进化树。结果分离病毒基因与肠道病毒76、89型有较高的同源性，尤其是与肠道病毒89型，相应片段的核苷酸序列同源性达83％-94％，推断相应氨基酸序列同源性高达91％-100％，而与其他病毒不存在有意义的同源性；系统进化树分析显示新分离肠道病毒株属于肠道病毒属中新型肠道病毒89型一簇。结论新分离病毒属肠道病毒89型，可能为89型的一个新亚型。

关键词：肠道病毒属基因组基因结构病毒

抑制性消减杂交技术筛选重组IFNβ下调HepG2细胞靶基因

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中华实验和临床病毒学杂志 2006年第3期20卷 273-275页

作者：钟彦伟成军曲建慧张黎颖郭江李晓东徐东平解放军第三○二医院传染病研究所病毒性肝炎研究室北京100039 北京地坛医院传染病研究所

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对... 详细信息

目的利用抑制性消减杂交（SSH）技术构建重组干扰素β（IFNβ）刺激人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库，筛选IFNβ下凋HepG2相关基因。方法重组IFNβ2000U／ml刺激对数生长期HepG2细胞，以生理盐水作用的HepG2细胞为阴性对照；制备细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录为cDNA，经Rsa Ⅰ酶切后将实验组cDNA分成两份，分别与两种不同的接头连接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建重组IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后，得到58个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。随机挑选其中35个插入片段测序，并通过生物信息学分析，结果共获得12种编码基因。结论应用SSH技术成功构建了IFNβ刺激HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库，为进一步了解IFNβ在肝细胞内的免疫调节机制提供了依据。

关键词：干扰素β 杂交减量调节

中国不同人群的抗TTV血清流行病学及TTV基因不同区段的分子流行病学研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2002年第1期16卷 79-81页

作者：李伯安程云侯俊高蓉李靖郑宇苏琴付体权解放军第三○二医院传染病研究所免疫研究室北京100039 解放军第三○二医院传染病研究所病毒研究室北京100039

目的　了解不同人群血清中抗 TTV抗体及ORF1 、ORF2 区段基因的分布状况 ,并分析其间的关系。方法　根据TTV的ORF1 、ORF2 区段的基因序列分别合成巢式PCR引物 ,扩增 2 46例血清标本中的TTV部分基因片段 ;采用TTVORF2 部分基因原核表... 详细信息

目的　了解不同人群血清中抗 TTV抗体及ORF1 、ORF2 区段基因的分布状况 ,并分析其间的关系。方法　根据TTV的ORF1 、ORF2 区段的基因序列分别合成巢式PCR引物 ,扩增 2 46例血清标本中的TTV部分基因片段 ;采用TTVORF2 部分基因原核表达抗原 ,应用酶联免疫吸附试验(ELISA) ,检测相同血清标本中TTV抗体。结果　不同人群TTVORF1 、ORF2 基因及抗体检测的阳性率分别为 :有偿献血者 16 0 % (12 75 ) ,10 7% (8 75 )和 2 5 3% (19 75 ) ,甲型肝炎患者 10 0 % (3 30 ) ,16 7% (5 30 )和 16 7% (5 30 ) ;乙型肝炎患者 47 5 % (19 40 ) ,42 5 % (17 40 )和 2 2 5 % (9 40 ) ,丙型肝炎患者 42 9% (15 35 ) ,37 1% (13 35 )和 2 8 6 % (10 35 ) ;丁型肝炎患者 2 0 0 % (3 15 ) ,2 6 7% (4 15 )和13 3% (2 15 ) ;戊型肝炎患者 16 7% (2 12 )、16 7% (2 12 )、33 3% (4 12 ) ;庚型肝炎患者 2 3 8% (5 2 1) ,38 1% (8 2 1)和 2 3 8% (5 2 1) ;非甲～庚型肝炎患者 6 1 1% (11 18) ,5 0 0 % (9 18)和 44 4% (8 18)。统计分析TTVORF1 与ORF2 基因的检出率相关有统计学意义 (P =0 0 0 0 <0 0 1) ;不同人群间基因检出率相差有统计学意义 (P <0 0 1) ;

关键词：输血传播病毒病毒抗体酶联免疫吸附测定聚合酶链反应血清流行病学

乙型肝炎病毒e抗原基因作为酵母双杂交体系结合域载体的构建及表达

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中华实验和临床病毒学杂志 2004年第2期18卷 158-161页

作者：李伯安戚扬舒翠利刘岩陈昊李靖高蓉侯俊程云解放军第三○二医院传染病研究所免疫研究室北京100039

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过... 详细信息

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过PCR方法分离HBeAg全基因片段 ,克隆入T载体 ,酶切鉴定及序列测定后 ,克隆入酵母双杂交体系结合域载体pGBKT7,构建pGBKT7 eAg载体。再次酶切鉴定阳性克隆后转入酵母 ,验证毒性作用 ;通过Western blot实验证实外源基因在酵母中的表达 ;并进一步验证自身激活作用。结果　由血清中分离的及 2次酶切鉴定的片段大小分别为 6 5 7bp和 6 39bp ,与预期大小一致 ;序列测定与报道的HBV分离株核酸及氨基酸同源性分别为96 %和 10 0 % ;转人酵母后无毒性及自身激活作用 ;Western blot实验出现阳性与预期大小 (2 4 .3× 10 3)一致的条带。结论　pGBKT7 eAg载体在酵母细胞中表达出融合蛋白 ,进一步验证无自身激活及毒性作用 ,此载体构建成功 ,适用于酵母双杂交体系。

关键词：乙型肝炎病毒e抗原基因表达酵母双杂交体系结合域载体

用RACE技术对一株肠道病毒3′端进行扩增和序列分析

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中华实验和临床病毒学杂志 2006年第4期20卷 410-412页

作者：侯俊沈宏辉胡燕朱雷王志杰雷厉貌盼勇解放军第三○二医院传染病研究所病毒研究室北京100039

目的应用3′RACE技术对一株本室分离肠道病毒基因组3′末端进行扩增,并对其核苷酸序列进行比较分析。方法提取病毒总RNA,以锚定oligdT(17)引物进行逆转录,用特异引物及锚定引物进行3′RACE扩增,将PCR产物进行克隆、测序和序列分析。结... 详细信息

目的应用3′RACE技术对一株本室分离肠道病毒基因组3′末端进行扩增,并对其核苷酸序列进行比较分析。方法提取病毒总RNA,以锚定oligdT(17)引物进行逆转录,用特异引物及锚定引物进行3′RACE扩增,将PCR产物进行克隆、测序和序列分析。结果获得了该病毒的3′端核苷酸序列,同源性分析结果显示该肠道病毒的核苷酸序列与肠道病毒76、89、90、91型的同源性最高为90%左右,而与其他型别的肠道病毒的同源性均小于80%;推导的氨基酸同源性与肠道病毒76、89、90、91型均在90%以上。结论用RACE技术对肠道病毒3′端进行扩增及序列分析,证明该病毒属新型肠道病毒类,为进一步研究该病毒的分子生物学特性奠定了基础。

关键词：肠道病毒属 DNA 序列分析

乙型肝炎病毒复制调控元件对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答

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中华传染病杂志 2006年第5期24卷 311-315页

作者：赫兢辛绍杰毛远丽王海滨周讯杨健洋孔维貌盼勇解放军第三○二医院传染病研究所病毒研究室北京100039

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)复制调控元件增强子I(ENH I)及前S2(Pre-S2)抗原基因对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答的影响。方法采用常规聚合酶链反应(PCR)从HBV adr亚型全基因DNA序列中分别扩增HBsAg、PreS2-HBsAg、HBsAg-ENH I和PreS2-HBsAg... 详细信息

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)复制调控元件增强子I(ENH I)及前S2(Pre-S2)抗原基因对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答的影响。方法采用常规聚合酶链反应(PCR)从HBV adr亚型全基因DNA序列中分别扩增HBsAg、PreS2-HBsAg、HBsAg-ENH I和PreS2-HBsAg-ENH I基因片段,重组到VR1012载体中,构建4种HBV DNA疫苗,转染HepG2细胞并免疫Balb/C小鼠。通过细胞免疫化学、酶联免疫分析(ELISA)、酶联免疫斑点试验(ELISPOT)等方法检测其在HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答。结果转染的HepG2细胞表达相应的目的蛋白,ENH I及Pre-S2抗原基因均可增强HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg；免疫接种小鼠后第2周产生抗-HBs及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),Pre-S2抗原基因可增强HBV DNA疫苗免疫Balb/C小鼠诱导的抗-HBs及HBsAg特异性CTL的产生,ENH I基因对免疫应答无影响。结论ENH I及Pre-S2抗原基因均可增强HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg,Pre-S2抗原基因可增强HBV DNA疫苗免疫Balb/C小鼠引起的免疫应答。

关键词：肝炎,乙型疫苗 DNA 肝炎抗原,乙型增强子元件(遗传学)