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结核分枝杆菌休眠复苏期与活跃期的差异表达基因分析

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中华结核和呼吸杂志 2008年第6期31卷 442-447页

作者：刘忠泉张宗德邢爱英陈曦李自慧古淑香贾红艳杜博平马玙北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室 101149

目的寻找休眠结核分枝杆菌复苏的关键基因，探讨结核分枝杆菌复苏的机制。方法取改良7H9培养基培养20d的结核分枝杆菌标准株H37Rv作为对数生长期的活跃结核分枝杆菌，提取其RNA。将一部分该菌株在37℃密封无氧培养45d左右，加入亚甲蓝... 详细信息

目的寻找休眠结核分枝杆菌复苏的关键基因，探讨结核分枝杆菌复苏的机制。方法取改良7H9培养基培养20d的结核分枝杆菌标准株H37Rv作为对数生长期的活跃结核分枝杆菌，提取其RNA。将一部分该菌株在37℃密封无氧培养45d左右，加入亚甲蓝作为无氧标志，即获得休眠菌。向休眠菌中加入复苏促进因子，37℃有氧培养3d，提取休眠复苏期结核分枝杆菌的基因组RNA。用DNA酶处理RNA并回收RNA，用mRNA纯化试剂盒纯化RNA。利用抑制性消减杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技术分析休眠复苏期和活跃期结核分枝杆菌的基因组mRNA的表达差异，并通过基因克隆、测序和序列分析，寻找差异表达基因。实时荧光定量PCR鉴定差异表达基因。结果以活跃期结核分枝杆菌cDNA为检测子的正相杂交和以休眠复苏期结核分枝杆菌cDNA为检测子的反相杂交各自高表达或特异性表达的片段都得到了选择性扩增，杂交产物经连接pTA2载体、转化至大肠杆菌DH5α和蓝白斑筛选，正相杂交获得78个阳性菌落，反相杂交获得46个阳性菌落。阳性单个菌落经液体LB培养基培养，以菌液为模板，T7、M13为引物，扩增插入片段，能扩增到明显的条带，且〉350bp的条带为阳性。正相杂交得到66个阳性扩增带，反相杂交得到39个阳性扩增带。这105个阳性扩增带的菌液经测序分析，则正相有30个特异性序列，反相有21个特异性序列。将这51个序列通过Genbank检索，因有不同序列对应同一基因，最后正相获得了20个活跃结核分枝杆菌特异性表达或高表达的功能基因，反相获得了7个休眠复苏期结核分枝杆菌特异性表达或高表达的功能基因，根据其功能不同分为8大类。经实时荧光定量PCR分析，7个休眠复苏期结核分枝杆菌特异性表达或高表达功能基因的表达量均为活跃结核分枝杆菌的该基因表达量的4倍以上。结论利用SSH技术可以筛选到休眠复苏期结核分枝杆菌和活跃期结核分枝杆菌的差异表达基因，为寻找休眠结核分枝杆菌复苏的关键基因奠定了基础。

关键词：分枝杆菌,结核基因抑制性消减杂交

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结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

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中国医学科学院学报 2009年第4期31卷 396-402页

作者：陈曦古淑香贾红彦李自慧郑晓静刘忠泉邢爱英杜博平张继增张宗德北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室北京101149

目的构建结核分枝杆菌rv1837c、rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性。方法PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv rv1837c、rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv1837c、p... 详细信息

目的构建结核分枝杆菌rv1837c、rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性。方法PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv rv1837c、rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体。然后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经0.4mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导;分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白。经镍离子螯和氮川乙酸-组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,取兔血清与纯化蛋白通过Western blot方法,检测家兔血清中的抗体。结果pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30%及50%。获得纯度为90%的重组蛋白。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。

关键词：结核分枝杆菌 rv1837c基因 rv3803c基因 Rv1837c重组蛋白 Rv3803c重组蛋白

结核分枝杆菌RD1区编码蛋白在结核病诊断中的潜在价值

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中国医学科学院学报 2009年第4期31卷 511-515页

作者：杜凤娇陈曦刘菲张宗德北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室北京101149

RD1区编码的9个蛋白,是结核分枝杆菌在长期传代过程中丢失的重要保护性抗原,仅存在于致病性分枝杆菌中,在卡介苗及环境分枝杆菌中缺失;其有较强的免疫原性,在结核病的诊断中发挥重要作用。本文主要介绍应用RD1区编码蛋白作为抗原在活动... 详细信息

RD1区编码的9个蛋白,是结核分枝杆菌在长期传代过程中丢失的重要保护性抗原,仅存在于致病性分枝杆菌中,在卡介苗及环境分枝杆菌中缺失;其有较强的免疫原性,在结核病的诊断中发挥重要作用。本文主要介绍应用RD1区编码蛋白作为抗原在活动性肺结核病和结核性胸膜炎诊断中的潜在价值。

关键词： RD1区结核分枝杆菌活动性肺结核结核性胸膜炎

不同抗原的酶联免疫斑点检测技术对结核病的辅助诊断价值比较

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中华结核和呼吸杂志 2009年第11期32卷 838-841页

作者：刘菲张宗德高孟秋马丽萍王庆枫吴晓光贾红彦古淑香马玙北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室 101149

目的比较不同MTB抗原的酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT），探索其对活动性结核病的辅助诊断价值。方法对结核组132例和对照组90例观察对象应用PPD、克隆表达的早期分泌抗原靶6000（ESAT-6）和ESAT-6／培养滤液蛋白10000（CFP-10）融合... 详细信息

目的比较不同MTB抗原的酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT），探索其对活动性结核病的辅助诊断价值。方法对结核组132例和对照组90例观察对象应用PPD、克隆表达的早期分泌抗原靶6000（ESAT-6）和ESAT-6／培养滤液蛋白10000（CFP-10）融合蛋白（简称E／C）进行酶联免疫斑点检测（ELISPOT），检测外周血单个核细胞（PBMC）中经3种抗原刺激后斑点形成细胞（SFC）的数量；对照组同时进行PPD试验。计量资料用中位数（四分位间距）表示，计量资料的比较采用Mann—WhitneyM检验，计数资料的比较采用x^2检验。结果结核组PPD—ELISPOT、E／C—ELISPOT、ESAT-6-ELISPOT形成的SFC数分别为255（93—526）、148（40～354）和28（10—116），均明显高于对照组的10（5。41）、10（0～20）和5（0～15），差异均有统计学意义（u值为1390．5～2510．5，均P〈0．01）；E／C—ELISPOT和PPD—ELISPOT的敏感度分别为90．3％和84．8％，均明显高于ESAT-6-ELISPOT（62．1％），差异均有统计学意义（x^2值分别为17．496和28．541，均P〈0．01）；E／C—***和ESAT-6-ELISPOT的特异度分别为84．4％和88．9％，均明显高于PPD—ELISPOT（68．9％），差异均有统计学意义（x。值分别为6．087和10．808，P〈0．05和P〈0．01）。结论E／C—ELISPOT有可能作为辅助诊断结核病的方法，但其特异度易受MTB潜伏感染的影响。

关键词：结核酶联免疫吸附测定结核菌素试验诊断

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噬菌体硝酸盐还原实验方法的建立与评估

中国医学科学院学报 2009年第4期31卷 413-416,I0001页

作者：邢爱英刘忠泉贾红彦古淑香张宗德北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室北京101149

目的采用噬菌体与硝酸盐还原实验结合的技术,以期建立一种新的快速、简易、廉价的结核杆菌药敏检测方法。方法对49株结核杆菌的临床分离株以噬菌体硝酸盐还原实验(PhaB-NRA法)与改良罗氏绝对浓度法对结核杆菌进行利福平、异烟肼药物敏... 详细信息

目的采用噬菌体与硝酸盐还原实验结合的技术,以期建立一种新的快速、简易、廉价的结核杆菌药敏检测方法。方法对49株结核杆菌的临床分离株以噬菌体硝酸盐还原实验(PhaB-NRA法)与改良罗氏绝对浓度法对结核杆菌进行利福平、异烟肼药物敏感性测定,以绝对浓度法作为参照标准判定PhaB-NRA法的敏感性、特异性、准确性及其可行性。结果PhaB-NRA法对利福平进行药物敏感性测定的敏感性、特异性、准确性分别为89.1%、91.67%、89.8%;对异烟肼进行药物敏感性测定的敏感性、特异性、准确性分别为86.21%、90.0%、87.8%。它们与绝对浓度法的符合率分别为利福平:0.746;异烟肼:0.750。结论PhaB-NRA法简化了实验步骤、缩短了药敏检测时间,且无需昂贵的仪器,有望成为快速结核杆菌药物敏感性测定的初筛方法。

关键词：结核分枝杆菌分枝杆菌噬菌体硝酸盐还原实验抗结核药物药物敏感性实验

对氨水杨酸钠耐药与结核分枝杆菌胸苷酸合成酶基因突变的研究

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中华结核和呼吸杂志 2007年第9期30卷 683-685页

作者：张宗德赵雁林李自慧贾红艳刘宇红陈曦刘忠泉杜博平邢爱英马玙北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室 101149

目的检测结核分枝杆菌临床分离株对氨水杨酸钠(PAS)耐药和胸苷酸合成酶(thyA)基因突变的关系,探讨结核分枝杆菌 PAS 耐药的分子机制。方法 95株结核分枝杆菌临床分离株中的51株 PAS 敏感株和44株 PAS 耐药株的 PAS 耐药相关基因 thyA ... 详细信息

目的检测结核分枝杆菌临床分离株对氨水杨酸钠(PAS)耐药和胸苷酸合成酶(thyA)基因突变的关系,探讨结核分枝杆菌 PAS 耐药的分子机制。方法 95株结核分枝杆菌临床分离株中的51株 PAS 敏感株和44株 PAS 耐药株的 PAS 耐药相关基因 thyA 基因进行 PCR 扩增,扩增产物纯化后进行序列测定,与结核分枝杆菌标准株 H_(37)Rv 的野生型 thyA 基因序列进行比对,判断这些临床分离株 thyA 基因有无突变。结果 51株 PAS 敏感株 thyA 基因未检出突变,44株 PAS 耐药株中有16个临床分离株的 thyA 基因检测到突变,突变检出率为36.4%(16/44)。突变类型包括置换、颠换、插入、缺失,均为单碱基改变或单碱基缺失,其中2株为 thyA 基因2个位点联合突变。结论结核分枝杆菌 thyA 基因突变是其产生 PAS 耐药的重要原因之一。结核分枝杆菌胸苷酸合成酶是PAS 作用的重要靶位。

关键词： P-氨基水杨酸胸苷酸合酶抗药性

结核分枝杆菌休眠菌的复苏培养与初始菌量的关系

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中国医学科学院学报 2009年第4期31卷 423-426页

作者：刘忠泉邢爱英古淑香贾红彦张宗德北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室北京101149

目的探讨复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌复苏作用与初始菌量的关系。方法取培养100d的陈旧结核分枝杆菌(休眠菌),用7H9稀释成麦氏比浊1mg/ml,之后倍比稀释成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/ml。取12支无菌培养管,加入5ml7H9培养基... 详细信息

目的探讨复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌复苏作用与初始菌量的关系。方法取培养100d的陈旧结核分枝杆菌(休眠菌),用7H9稀释成麦氏比浊1mg/ml,之后倍比稀释成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/ml。取12支无菌培养管,加入5ml7H9培养基并分为2组,每组依次加入上述各浓度结核分枝杆菌,第1组加入复苏因子蛋白质,第2组作为对照加入等体积7H9,37℃培养,分别在15、25、30、35d检测光密度值,并取1μl培养液涂7H11平板培养,进行菌落计数。重复上述实验。结果0、15、25、30、35d分光光度计检测光密度(OD)值结果显示:各浓度组间细菌增殖呈直线正相关性(P结核分枝杆菌休眠菌的复苏作用与初始菌量无关。

关键词：结核分枝杆菌复苏因子培养

细胞转录组学和代谢组学整合策略表征突变影响谷氨酰胺合成酶酶活的关键代谢通路

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色谱 2025年第3期43卷 207-219页

作者：凌婷石京冯婷泽裴劭君李思怿朴海龙中国科学院大连化学物理研究所中国科学院分离分析重点实验室辽宁大连116023 中国医科大学附属肿瘤医院胸外科肿瘤研究所辽宁省肿瘤医院暨研究所辽宁沈阳110042 中国医科大学生命科学学院生物化学和分子生物学教研室辽宁沈阳110122 中国科学院大学北京100049

谷氨酰胺合成酶(GS)是细胞中唯一可以从头合成谷氨酰胺的酶,在癌症代谢中扮演着重要角色。GS酶活缺陷突变往往导致严重的代谢疾病甚至是死亡。理解GS酶活降低对生理功能的影响可能为靶向治疗提供新的方向,同时对其内在机制的探索可以为... 详细信息

谷氨酰胺合成酶(GS)是细胞中唯一可以从头合成谷氨酰胺的酶,在癌症代谢中扮演着重要角色。GS酶活缺陷突变往往导致严重的代谢疾病甚至是死亡。理解GS酶活降低对生理功能的影响可能为靶向治疗提供新的方向,同时对其内在机制的探索可以为治疗干预开辟新的途径。已报道的GS酶活缺陷突变包括R324C(第324位精氨酸突变为半胱氨酸)和R341C(第341位精氨酸突变为半胱氨酸)等,本研究新发现了GS的另一个酶活缺陷突变位点K241(第241位赖氨酸)。为了探究GS酶活缺陷突变带来的影响,本研究利用双组学技术对GS的酶活缺陷突变R324C和K241R(第241位赖氨酸突变为精氨酸)在肺癌细胞中的功能进行研究,通过对转录组和代谢组数据的整合揭示了GS酶活缺陷突变对一些重要生物过程的显著影响。GS的缺陷突变阻碍了细胞周期和多种氨基酸代谢途径。除了谷氨酰胺合成受到抑制,精氨酸-脯氨酸代谢、甘氨酸-丝氨酸-酪氨酸代谢以及天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸代谢在GS突变的细胞中表现出更强的活力,同时,氨酰-tRNA的生物合成途径也显著被激活。进一步的研究发现,GS酶活缺陷带来氨基酸代谢的改变源自谷氨酸的重新定向和相关代谢酶的表达变化,同时,氨酰-tRNA生物合成的激活源自谷氨酰胺在GS酶活缺陷细胞中带来的能量应激激活了特定蛋白的表达,如转录因子4(ATF4)。此外,细胞表型实验表明,GS酶活缺陷细胞的迁移能力低于野生型细胞。以上结果揭示了GS酶活缺陷突变体细胞中的代谢重编程现象,突出了癌细胞代谢的复杂性和适应性。

关键词：谷氨酰胺合成酶突变转录组学代谢组学肺癌谷氨酰胺

肺癌前病变、肺癌中FHIT基因表达的临床研究

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中国肺癌杂志 2006年第4期9卷 320-324页

作者：常秀军杨声张海青汪惠姜颖北京市结核病胸部肿瘤研究所胸外科 101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所病理科 101149 北京市结核病胸部肿瘤研究所肺癌分子生物研究室 101149

背景与目的FHIT基因为近年发现的新的候选抑癌基因,位于3p14.2,跨越FRA3B易脆点,在包括肺癌在内的多种人类肿瘤中均存在异常表达。本研究旨在观察FHIT基因在人肺癌前病变、肺癌中的表达情况,探讨FHIT基因在肺癌发生、发展过程中的可能... 详细信息

背景与目的FHIT基因为近年发现的新的候选抑癌基因,位于3p14.2,跨越FRA3B易脆点,在包括肺癌在内的多种人类肿瘤中均存在异常表达。本研究旨在观察FHIT基因在人肺癌前病变、肺癌中的表达情况,探讨FHIT基因在肺癌发生、发展过程中的可能作用。方法采用免疫组化方法检测298例甲醛固定、石蜡包埋的标本(包括161例肺癌、51例肺癌前病变、30例正常肺组织、23例肺良性病变和33例肺癌转移淋巴结)中FHIT蛋白表达情况。结果FHIT蛋白在正常肺组织及肺良性病变组织中均无失表达,癌前病变组织和肺癌组织中失表达率分别为54.9%(28/51)和59.0%(95/161),肺癌转移淋巴结组织中失表达率为78.8%(26/33);肺癌前病变、肺癌及转移淋巴结组织中FHIT蛋白失表达率显著高于正常肺组织及肺良性病变组织(P肺癌组织中FHIT基因表达水平与肺癌组织学类型、肿瘤细胞分化程度、患者pTNM分期、淋巴结转移有密切关系(P肺癌患者的术后5年生存率显著低于表达组(P肺癌发生过程中的早期分子事件,与肺癌的发生、发展及预后有关;吸烟导致FHIT蛋白表达下降可能是诱发肺癌的原因之一。

关键词：肺癌前病变肺肿瘤 FHIT基因免疫组织化学