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基于RPA-CRISPR/Cas12a的番茄花叶病毒可视化检测方法的建立

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植物保护 2024年第4期50卷 235-241页

作者：董铮赵振兴范奇璇王思元周涛张永江中国检验检疫科学研究院北京100176 中国农业大学植物保护学院北京100193

番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)属于植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒属Tobamovirus成员,主要危害番茄和辣椒,多数茄科植物易感染,严重影响果实的品质和产量。本研究根据ToMV编码的外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶... 详细信息

番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)属于植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒属Tobamovirus成员,主要危害番茄和辣椒,多数茄科植物易感染,严重影响果实的品质和产量。本研究根据ToMV编码的外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)特异性引物和簇状规则间隔短链重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白12a(CRISPR-associated 12a,Cas12a)的crRNA并挑选报告基因。通过优化反应体系建立了ToMV的快速可视化检测方法,当荧光报告基因FQ终浓度为400 nmol/L、Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol·L^(-1)/1000 nmol·L^(-1)时检测信号最强,只需RPA和CRISPR/Cas12a分别反应15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号。该方法可特异性检测ToMV,对携带ToMV样品的RNA检测灵敏度可以达到172 ag/μL,是普通RT-PCR检测灵敏度的10000倍,可用于ToMV快速灵敏的可视化检测。

关键词：番茄花叶病毒 RPA CRISPR/Cas12a 可视化检测

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春玉米间作豆科绿肥作物害虫和天敌种群的发生动态

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草业科学 2024年第3期41卷 731-738页

作者：赵发福郭建国谢晓丽张旭明薛应钰金社林甘肃农业大学植物保护学院甘肃兰州730070 甘肃省农业科学院植物保护研究所甘肃兰州730070

为明确甘肃省河西走廊春玉米(Zea mays)间作豆科绿肥作物害虫和天敌种群的发生动态,建立优良的种植模式以控制玉米害虫,于2019年监测了春玉米间作针叶豌豆(Pisum sativum)、春玉米间作箭筈豌豆(Vicia sativa)和春玉米单作种植模式下害... 详细信息

为明确甘肃省河西走廊春玉米(Zea mays)间作豆科绿肥作物害虫和天敌种群的发生动态,建立优良的种植模式以控制玉米害虫,于2019年监测了春玉米间作针叶豌豆(Pisum sativum)、春玉米间作箭筈豌豆(Vicia sativa)和春玉米单作种植模式下害虫和天敌种群的发生动态。结果表明:在整个生长季节内,间作针叶豌豆的春玉米上二斑叶螨(Tetranychus urticae)和玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)种群数量分别高达每100株8300.00和1611.33头,棉铃虫(Helicoverpa armigera)种群数量低至每100株40.00头;间作箭筈豌豆的春玉米虽然无二斑叶螨和玉米蚜发生,但棉铃虫种群数量高达每100株66.67头;并且,间作针叶豌豆或箭筈豌豆的春玉米上寄生蜂始见期早、种群数量高。甘肃省河西走廊春玉米间作箭筈豌豆有利于控制二斑叶螨和玉米蚜,但应注意防治棉铃虫;春玉米间作针叶豌豆有利于降低棉铃虫种群数量,但需注意防治二斑叶螨和玉米蚜。

关键词：春玉米间作箭筈豌豆针叶豌豆害虫天敌发生动态

转录因子NbMYB1R1通过促进活性氧积累抑制病毒侵染

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中国农业科学 2024年第8期57卷 1490-1505页

作者：姜兴林于连伟付涵艾妞崔荧钧李好海夏子豪袁虹霞李洪连杨雪施艳河南农业大学植物保护学院河南省植物保护新技术推广协会河南省植物保护检疫站沈阳农业大学植物保护学院河南省粮食作物协同创新中心小麦玉米作物学国家重点实验室河南农业大学作物学博士后流动站

【背景】黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）是我国重要的检疫性植物病毒，严重降低了世界范围内蔬菜以及瓜类的产量。MYB蛋白家族庞大，功能多样，存在于所有真核生物中。大多数MYB作为转录因子控制植物... 详细信息

【背景】黄瓜绿斑驳花叶病毒（cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）是我国重要的检疫性植物病毒，严重降低了世界范围内蔬菜以及瓜类的产量。MYB蛋白家族庞大，功能多样，存在于所有真核生物中。大多数MYB作为转录因子控制植物的发育和代谢，并对植物应对生物和非生物胁迫反应起重要的调控作用。前期研究显示CGMMV侵染后可以显著上调寄主转录因子基因NbMYB1R1的表达。【目的】明确NbMYB1R1参与CGMMV侵染的机制，为CGMMV病害防控提供理论依据。【方法】运用MEGA 7.0构建系统进化树，对NbMYB1R1的氨基酸序列进行系统进化分析；通过构建NbMYB1R1的荧光表达载体，转化GV3101农杆菌后浸润本氏烟叶片，激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位；利用qRT-PCR技术分析NbMYB1R1在CGMMV侵染不同时期的转录水平及NbMYB1R1沉默烟草植株中活性氧（reactive oxygen species,ROS）相关基因的转录变化；通过沉默NbMYB1R1及下游调控基因NbAOX1a和NbAOX1b，分析NbMYB1R1及下游调控基因NbAOX1a和NbAOX1b在CGMMV侵染过程中的作用；瞬时过表达NbMYB1R1和NbMYB1R1关键氨基酸突变体，分析NbMYB1R1对CGMMV侵染的影响；使用台盼蓝染色以及DAB染色观察瞬时过表达NbMYB1R1造成的细胞死亡是否与程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）以及ROS的积累有关；运用酵母双杂交技术验证NbMYB1R1是否与CGMMV相关蛋白互作。【结果】系统进化树分析表明，NbMYB1R1属于1R MYB大类并与多种烟草的MYB转录因子同源性极高；亚细胞定位结果显示NbMYB1R1定位于细胞核；在CGMMV侵染的烟草植株中，NbMYB1R1的转录水平对比健康植株有明显变化，在CGMMV侵染8、12 d时NbMYB1R1的转录水平显著上调；在沉默内源基因NbMYB1R1的植株上接种CGMMV,3 d后NbMYB1R1沉默植株系统叶出现斑驳、卷曲症状，而对照植株在3.5 d时才出现症状；同时CGMMV CP mRNA水平和蛋白水平检测结果也表明沉默NbMYB1R1可以有效促进CGMMV的积累；在本氏烟叶片瞬时过表达NbMYB1R1及其突变体3 d时检测CGMMV蛋白水平表达量，结果显示过表达NbMYB1R1可以有效抑制CGMMV的侵染，DNA结合结构域缺失后会减轻NbMYB1R1对CGMMV的抑制；台盼蓝和DAB染色结果表明，在瞬时过表达NbMYB1R1蛋白后导致ROS积累并引起细胞死亡；在沉默内源基因NbMYB1R1的植株叶片上检测ROS相关基因的转录水平，发现交替氧化酶基因AOX1a、AOX1b转录水平显著上调；在沉默内源基因NbAOX1a和NbAOX1b的植株上接种CGMMV,4 d后NbAOX1a和NbAOX1b沉默植株系统叶出现斑驳、卷曲症状，而对照植株在3.5 d时就出现症状；同时CGMMV CP mRNA水平和蛋白水平检测结果也表明沉默NbAOX1a和NbAOX1b可以有效抑制CGMMV的积累；酵母双杂交结果显示NbMYB1R1不与CGMMV编码蛋白直接相互作用。【结论】随着CGMMV侵染，防御相关基因NbMYB1R1表达上调，从而抑制下游基因AOX1a、AOX1b的表达并激活细胞内产生ROS抑制病毒侵染，但NbMYB1R1不是通过与CGMMV病毒蛋白直接互作而产生此作用。由此可见，NbMYB1R1在CGMMV侵染过程中发挥了重要作用。

关键词：黄瓜绿斑驳花叶病毒 Nb MYB1R1 转录因子致病机制活性氧

漆酶:一种新型靶标在农业杀菌剂开发中的潜在应用

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农药学学报 2024年第2期26卷 290-300页

作者：路星星孙腾达徐欢杨新玲刘西莉张晓鸣凌云中国农业大学理学院应用化学系农药创新中心北京100193 中国农业大学植物保护学院北京100193

目前杀菌剂分子设计多依赖于已知的靶标蛋白,但重复针对相同靶标使用杀菌剂,无疑会增大有害生物对药剂的交互抗性风险。因此,基于新的作用靶标开发新型作用机制的杀菌剂,可以有效解决病原菌对现有杀菌剂的抗性难题。漆酶是二羟基萘黑色... 详细信息

目前杀菌剂分子设计多依赖于已知的靶标蛋白,但重复针对相同靶标使用杀菌剂,无疑会增大有害生物对药剂的交互抗性风险。因此,基于新的作用靶标开发新型作用机制的杀菌剂,可以有效解决病原菌对现有杀菌剂的抗性难题。漆酶是二羟基萘黑色素生物合成途径中的关键酶,目前许多研究表明其缺失可使真菌生长发育及致病侵染受到影响,可作为农用杀菌剂潜在靶标进行系统研究。本文介绍了漆酶的结构与功能,并着重介绍了近几年有漆酶抑制活性的化合物作为潜在杀菌剂的研究进展,可为更多新型漆酶抑制剂作为杀菌剂的研究提供指导。

关键词：漆酶杀菌剂靶标漆酶抑制剂抑菌活性氨基硫脲衍生物

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叉角厉蝽丝氨酸蛋白酶及抑制剂基因的克隆与表达分析

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环境昆虫学报 2024年第3期46卷 659-669页

作者：张曼高平陈晓梁晨汤永玉秦得强吴国星高熹云南农业大学植物保护学院昆明650201

为明确叉角厉蝽Eocanthecona furcellata(Wolff)丝氨酸蛋白酶基因EfSP1及抑制剂基因EfSPI20的基因序列特征和时空转录特征,为其生理功能研究奠定基础。利用PCR克隆技术获得叉角厉蝽唾液腺EfSPI20和EfSP1的完整开放阅读框(Open reading f... 详细信息

为明确叉角厉蝽Eocanthecona furcellata(Wolff)丝氨酸蛋白酶基因EfSP1及抑制剂基因EfSPI20的基因序列特征和时空转录特征,为其生理功能研究奠定基础。利用PCR克隆技术获得叉角厉蝽唾液腺EfSPI20和EfSP1的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列,使用生物信息学软件进行序列分析以及系统进化分析,采用实时荧光定量PCR(Real time quantitativate PCR,RT-qPCR)分析两个基因分别在叉角厉蝽不同发育时期和组织中的表达特征。结果表明,EfSPI20与EfSP1基因完整开放阅读框长度分别为378 bp和921 bp,分别编码125个氨基酸和306个氨基酸,预测均为亲水蛋白质,理论分子量分别为13.48 kDa和33.82 kDa,等电点分别为6.68和5.80,分别有30个和23个氨基酸残基的信号肽序列,EfSPI20有跨膜结构域,EfSP1无跨膜结构域。序列比对显示叉角厉蝽EfSPI20与茶翅蝽Halyomorpha halys PPI同源性最高,氨基酸序列一致性达58%;EfSP1与稻绿蝽Nezara viridula SP同源性最高,氨基酸序列一致性达66%;系统发育树显示叉角厉蝽与同为蝽科的茶翅蝽和稻绿蝽物种亲缘关系近。EfSPI20基因在雌雄成虫和唾液腺中高表达,推测EfSPI20可能具有抑制胰蛋白酶活性的功能和与叉角厉蝽的捕食消化相关;EfSP1基因在卵期、卵巢和肠道中高表达,推测EfSP1可能与叉角厉蝽的生殖功能和蛋白消化相关。

关键词：叉角厉蝽丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶抑制剂表达特征

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光眉刺蛾的线粒体基因组研究及系统发育分析

生物学杂志 2024年第1期41卷 54-60页

作者：林兴雨宋南河南农业大学植物保护学院郑州450002

为探究光眉刺蛾Narosa fulgens(Leech,1889)的线粒体基因组结构及刺蛾科的系统发育关系,利用下一代测序方法获得光眉刺蛾线粒体全基因组序列。系统发育分析中使用斑蛾总科16个物种作为内群,并选择木蠹蛾科和网蛾科各1个物种作为外群,利... 详细信息

为探究光眉刺蛾Narosa fulgens(Leech,1889)的线粒体基因组结构及刺蛾科的系统发育关系,利用下一代测序方法获得光眉刺蛾线粒体全基因组序列。系统发育分析中使用斑蛾总科16个物种作为内群,并选择木蠹蛾科和网蛾科各1个物种作为外群,利用最大似然法和贝叶斯法重建刺蛾科的系统发育关系。光眉刺蛾的线粒体基因组包含37个基因(13个蛋白质编码基因、22个转运RNA基因和2个核糖体RNA基因)和1个非编码控制区,全长为15296 bp(GenBank登录号:OP919326)。光眉刺蛾线粒体基因组的13个蛋白质编码基因的起始密码子除cox1利用CGA开头外,其余蛋白质编码基因都是以ATN开头,终止密码子除cox2和nad4以不完整的T结尾外,其余蛋白质编码基因都是以TAA和TAG结尾。除trnS1因缺少DHU臂而形成一个简单的环,无法形成稳定的三叶草结构外,其余转运RNA基因均能形成典型的三叶草结构。rrnL的全长为1335 bp,A+T含量为85.24%。rrnS的全长为732 bp,A+T含量为84.70%。两个方法构建的系统发育树的结果均表明:斑蛾科和刺蛾科为单系群,光眉刺蛾与龟形小刺蛾Narosa nigrisigna为姐妹群。

关键词：鳞翅目刺蛾科光眉刺蛾线粒体基因组系统发育

二穗短柄草BdGATA2基因的表达及其功能分析

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分子植物育种 2024年第9期22卷 2916-2922页

作者：严明雄彭伟业李魏宋娜段康乐李佳欣戴良英王冰湖南农业大学植物保护学院长沙410128

植物GATA基因广泛调控生长发育、环境胁迫和次生代谢等生理功能,但是其作用机制尚不清晰。本研究克隆了二穗短柄草(Brachypodium distachyon)GATA转录因子BdGATA2基因,并进行亚细胞定位和表达分析,为深入研究GATA基因的功能机制提供理... 详细信息

植物GATA基因广泛调控生长发育、环境胁迫和次生代谢等生理功能,但是其作用机制尚不清晰。本研究克隆了二穗短柄草(Brachypodium distachyon)GATA转录因子BdGATA2基因,并进行亚细胞定位和表达分析,为深入研究GATA基因的功能机制提供理论参考。通过无缝克隆试剂盒从二穗短柄草cDNA中克隆BdGATA2基因;使用农杆菌介导烟草瞬时表达系统进行BdGATA2蛋白的亚细胞定位;利用酵母系统验证BdGATA2的转录激活作用;使用RT-qPCR检测在高温和低温胁迫下二穗短柄草体内的BdGATA2基因转录水平变化;利用STRING数据库构建BdGATA2蛋白互作网络。结果表明,BdGATA2与大麦(Hordeum vulgare)GATA基因AC256257.1相似度最高,达到98.32%,表明其具有高度的保守性;BdGATA2蛋白在细胞核中表达,且具有自激活作用;在低温胁迫下,BdGATA2基因表达上调;蛋白互作预测结果显示,BdGATA2蛋白分别与JAZ4(茉莉酸通路)和PYDK1(植物生长素合成途径)互作。结果说明,BdGATA2基因具有典型GATA结构域,发挥转录激活功能;在二穗短柄草受到高温和低温胁迫时,BdGATA2基因差异表达;互作网络分析推测BdGATA2蛋白可能参与抗病和生长等多种生理过程。

关键词：二穗短柄草 BdGATA2 逆境胁迫表达分析

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绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

环境昆虫学报 2024年第1期46卷 174-183页

作者：张敏李子鹏赵欣然张仙红郑海霞山西农业大学植物保护学院山西太谷030801

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献... 详细信息

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。

关键词：绿豆象实时荧光定量PCR 内参基因不同发育阶段组织基因稳定表达

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我国二化螟抗药性发展及其抗性机制研究进展

吉林农业大学学报 2024年第4期46卷 523-530页

作者：官道杰王建军孟祥坤扬州大学植物保护学院扬州225009 吉林农业大学植物保护学院长春130118

二化螟是水稻作物上的主要害虫之一,每年给我国水稻生产造成严重损失。目前,二化螟的防治主要依靠化学杀虫剂。近年来,由于杀虫剂的不合理使用,我国不同地区二化螟种群已对包括有机磷类、大环内酯类和双酰胺类的多种杀虫剂产生了不同水... 详细信息

二化螟是水稻作物上的主要害虫之一,每年给我国水稻生产造成严重损失。目前,二化螟的防治主要依靠化学杀虫剂。近年来,由于杀虫剂的不合理使用,我国不同地区二化螟种群已对包括有机磷类、大环内酯类和双酰胺类的多种杀虫剂产生了不同水平的抗药性。关于二化螟抗性机制的研究发现,二化螟P450s、ESTs等解毒代谢酶的酶活性提高,AChEs、RyRs等靶标位点突变及ABC转运蛋白转运能力的增强是造成二化螟对杀虫剂产生抗药性的主要原因。对近年我国不同地区二化螟种群的抗药性发展及其抗药性机制研究进行总结,以期为我国水稻二化螟的化学防治提供用药指导。

关键词：二化螟杀虫剂抗药性抗性机制解毒代谢靶标突变

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