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2021-2022年华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查

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中国兽医科学 2024年第4期54卷 519-525页

作者：张杰张路捷周昊然刘星白娟姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为初步了解我国华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行特点,2021-2022年采集华东地区480份临床疑似PRRSV样品,采用RT-PCR方法检测是否存在PRRSV,统计显示阳性为175份,阳性检出率为38.89%。对来自不同猪场的24个阳性样品的病毒ORF... 详细信息

为初步了解我国华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行特点,2021-2022年采集华东地区480份临床疑似PRRSV样品,采用RT-PCR方法检测是否存在PRRSV,统计显示阳性为175份,阳性检出率为38.89%。对来自不同猪场的24个阳性样品的病毒ORF5基因测序,所有检测的毒株均属美洲型,共可以分为4个亚型,其中11个毒株属于高致病性PRRSV(HP-PRRSV)(Sublineage 8.7);6个毒株属于类NADC30毒株亚型(Sublineage 1.8);4个毒株属于类NADC34亚型(Sublineage 1.5)。病毒GP5蛋白基因测序结果显示,流行毒株GP5蛋白aa3-39及aa185-200两个高变区出现变异。该研究表明我国该地区PRRSV流行毒株存在遗传多样性,基因型复杂,需要引起我们的重视。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5 NADC34 NADC30 遗传变异

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

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畜牧兽医学报 2023年第8期54卷 3424-3434页

作者：袁丽孙杨杨张路捷张杰孙海凤白娟姜平南京农业大学农业农村部动物细菌学重点实验室南京210095

旨在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白单克隆抗体及解析其抗原表位。本研究构建了PRRSV类NADC30毒株FJ1402的GP3大肠杆菌表达质粒,制备获得重组GP3蛋白。经过免疫BALB/c小鼠和间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。利用间接... 详细信息

旨在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白单克隆抗体及解析其抗原表位。本研究构建了PRRSV类NADC30毒株FJ1402的GP3大肠杆菌表达质粒,制备获得重组GP3蛋白。经过免疫BALB/c小鼠和间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。利用间接免疫荧光试验和蛋白印迹鉴定单克隆抗体特异性。通过构建GP3蛋白基因截短体和合成多肽ELISA鉴定单克隆抗体识别的表位区域。结果显示,成功筛选了7株稳定分泌GP3蛋白抗体的杂交瘤细胞株,7株单克隆抗体均可与PRRSV FJ1402产生特异性反应。鉴定出GP3蛋白4个抗原表位,分别为^(55)PLCPTRQAAAEILE^(68)、^(69)PGKSFWCRI^(77)、^(78)GHDRCSESDH^(87)和^(88)DELGFMVPPGLSS^(100)。2E12单抗与FJ1402、BB0907和S1三个谱系毒株均可发生IFA和Western blot特异反应,4H9、9F3和6B3单抗只与FJ1402毒株反应,而不与BB0907和S1毒株反应。本研究研制成功7株GP3蛋白单克隆抗体,并鉴定出4个GP3蛋白抗原表位,为PRRSV检测和GP3蛋白功能研究提供了重要工具。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP3蛋白单克隆抗体抗原表位

猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2023年

作者：张宝戈黄雅琴蔡金双朱晨光李玉峰南京农业大学动物医学院农业农村部动物细菌学重点实验室

为建立检测猪圆环病毒3型（PCV3）抗体的阻断ELISA方法，（方法）本研究利用原核表达的PCV3 Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原，以辣根过氧化物酶（HRP）标记... 详细信息

为建立检测猪圆环病毒3型（PCV3）抗体的阻断ELISA方法，（方法）本研究利用原核表达的PCV3 Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体，经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清，计算阻断率（PI）的临界值，以此来确定该方法的判定标准：当PI≤28.30%时，判定结果为阴性；当PI≥35.05%时，判定结果为阳性；当28.30%＜PI＜35.05%时，判定为可疑，重复一次试验后如果结果仍为可疑，则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）以及猪瘟病毒（CSFV）的阳性血清均无交叉反应；敏感性试验表明其检测效价可达到1:128；重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%；符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）比对的Kappa值达0.9，具有高度的一致性。综上所述，本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率，可用于后期进行PCV3抗体的检测，为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供了技术支持。

关键词：猪圆环病毒3型 Cap重组蛋白单克隆抗体阻断ELISA

表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定

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病毒学报 2015年第1期31卷 65-73页

作者：张挺杰刘星孙涛朱雪蛟范宝超白娟姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室南京210095

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是目前危害世界养猪业的两种重要病原。本研究采用PCR方法构建PRRSV疫苗株TJM-F92全长cDNA克隆载体pCMV-TJM,并在其ORF7和3′UTR之间插入AflⅡ/MluⅠ酶切位点和转录调控序列TRS6,构建获得pCMV-TJM-TRS表达载体。将PCV2ORF2基因插入该载体AflⅡ/MluⅠ位点,获得重组质粒pCMV-TJM-Cap。将pCMV-TJM、pCMV-TJM-TRS和pCMV-TJM-Cap分别转染Marc-145细胞,拯救获得3种重组病毒rTJM、rTJM/TRS和rTJM/Cap。基因测序列、酶切鉴定、Western blot、间接免疫荧光和病毒生长特性结果显示,3种重组PRRSV病毒都含有特征性分子标记,在Marc-145细胞增殖特性与亲本病毒相似;rTJM/Cap传至第8代,仍含有外源Cap基因,病毒感染细胞能有效表达PCV2Cap蛋白,从而为PRRSV致病机制和PRRSV-PCV2疫苗研究奠定了重要基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型反向遗传重组病毒

猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA的建立与应用

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中国兽医科学 2018年第6期48卷 712-716页

作者：孙海凤徐旋董静孙涛白娟姜平南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室

利用伪狂犬病病毒（PRV）ZJ01毒株重组gB蛋白及其对应的HRP标记的单克隆抗体,旨在建立一种检测伪狂犬病病毒gB抗体的阻断ELISA。对ELISA反应条件进行了优化,具体为：包被抗原的质量浓度为0.5 g/mL;待检血清的稀释比例为1∶1,孵育条件是3... 详细信息

利用伪狂犬病病毒（PRV）ZJ01毒株重组gB蛋白及其对应的HRP标记的单克隆抗体,旨在建立一种检测伪狂犬病病毒gB抗体的阻断ELISA。对ELISA反应条件进行了优化,具体为：包被抗原的质量浓度为0.5 g/mL;待检血清的稀释比例为1∶1,孵育条件是37℃作用1 h;酶标单抗的稀释度为1∶15 000,作用时间为37℃0.5 h。ELISA结果的判定标准为：血清样品阻断率PI≥28.67%时判为阳性;PI≤18.27%时判为阴性;18.27%〈PI〈28.67%时判为可疑。该ELISA能特异性地识别PRV阳性血清,而与PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV阳性血清无交叉反应性。ELISA的重复性试验表明,批间和批内的变异系数均小于10%。比较试验结果表明,该ELISA的相对敏感性和特异性分别为80.9%和96.4%,与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率为85.1%。用建立的此ELISA对田间采集的535份猪临床血清样品进行了检测,结果显示,PRV抗体阳性率达61.87%。综上所述,本试验建立的猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA具有特异、简单、快速的优点,为建立标准化的检测试剂盒奠定了基础。

关键词：猪伪狂犬病病毒 gB蛋白阻断ELISA

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2018年第1期48卷 7-12页

作者：张日腾张乔亚姜辰龙刘宗霞杨茂春姜平白娟南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室

本研究为建立一种针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的快速检测方法,根据PRRSV O RF7基因保守区域序列,设计了三对特异性引物。通过Bst D N A聚合酶、引物、Mg2＋、d NT Ps和SY BR G reenⅠ及H NB染料浓度等反应条件优化,建立了PRRS... 详细信息

本研究为建立一种针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的快速检测方法,根据PRRSV O RF7基因保守区域序列,设计了三对特异性引物。通过Bst D N A聚合酶、引物、Mg2＋、d NT Ps和SY BR G reenⅠ及H NB染料浓度等反应条件优化,建立了PRRSV反转录-环介导等温核酸扩增（RT-L AMP）检测方法 ,62℃条件下反应35 min,肉眼可见白色沉淀,1.5%琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带,SYBR GreenⅠ染料显示呈绿色。该方法的最低检测限（TCID50）为1×10^0.5/m L,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪流行性腹泻病毒等病原均无交叉反应。110份临床样品检测结果显示,PRRSV阳性率60.0%,与RT-PCR检测结果符合率为85.5%。上述结果说明,该方法操作简便,灵敏特异,可用于PRRSV临床样品的快速诊断。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒反转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP) 猪 ORF7基因

副猪格拉瑟菌5型细胞致死性膨胀毒素CdtB破坏猪呼吸道上皮屏障的机制

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畜牧兽医学报 2023年第1期54卷 304-316页

作者：陈敏刘明星张鹏云蔺辉星范红结南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室南京210095

旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,... 详细信息

旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,经透射电子显微镜(TEM)观察,OMVs的粒径在100~200 nm,纳米粒子直径分析(NTA)结果显示,样品在100~200 nm处的粒子数目最多。进而用制备的HbpA及OmpP2多克隆抗体对OMVs及不含OMVs的细菌上清进行Western blot验证,证实所提取的样品为外膜囊泡,且进一步结果证明细胞致死性膨胀毒素(CDT)在GPS培养物中主要以OMVs的形式存在。用OMVs或CdtB处理猪气管上皮细胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)36 h,检测STEC中cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表达水平,并用FITC-葡聚糖(FD-4)检测STEC单层细胞的细胞旁通透性。结果发现,OMVs与CdtB处理后凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达水平升高,ZO-1和Occludin的表达水平降低,FD-4渗透率升高,同时,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试验发现,当CdtB与STEC单层细胞共孵育24 h、OMVs与STEC单层细胞共孵育36 h后,STEC存活率显著降低。而Pifithrin-α预处理STEC可抑制OMVs和CdtB引起的细胞凋亡和屏障通透性的增加。另外,用免疫磁珠捕获的方法去除OMVs中的CdtB(OMVs-ΔCdtB),OMVs-ΔCdtB处理STEC 36 h后cleaved-caspase3、ZO-1、Occludin表达水平与对照组相比无显著差异。综上,成功提取并纯化GPS OMVs,且试验证明GPS可通过OMVs转运CdtB诱导STEC凋亡和屏障损伤,为副猪格拉瑟菌突破呼吸道上皮屏障的机制提供新思路。

关键词：副猪格拉瑟菌外膜囊泡细胞致死性膨胀毒素CdtB 猪呼吸道上皮细胞

毕赤酵母分泌表达JEV prME蛋白及其形成病毒样颗粒的免疫原性鉴定

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生物工程学报 2017年第5期33卷 863-874页

作者：赵鹏江雅王经满范浩杰曹瑞兵南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

应用毕赤酵母分泌表达日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白,鉴定其表达效果与免疫原性,以期为JEV亚单位疫苗的研制奠定基础。RT-PCR扩增JEV SA14-14-2株prME基因,将其连接到毕赤酵母表达载体pPICZa-A,分别获得pPICZa... 详细信息

应用毕赤酵母分泌表达日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白,鉴定其表达效果与免疫原性,以期为JEV亚单位疫苗的研制奠定基础。RT-PCR扩增JEV SA14-14-2株prME基因,将其连接到毕赤酵母表达载体pPICZa-A,分别获得pPICZa-prME和携带JEV Cap蛋白C末端19个Aa信号肽的pPICZa-SprME质粒。表达载体用PmeⅠ酶切线性化,通过电转化转入毕赤酵母X33并诱导发酵培养。利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定酵母发酵上清中目的蛋白的表达情况。利用GE蛋白层析纯化柱纯化目的蛋白,利用电镜观察纯化前后的目的蛋白,将不同剂量纯化后的prME蛋白与弗氏佐剂混合以及定量纯化后的prME蛋白与不同剂量的核酸佐剂混合分别免疫4周龄小鼠,定期采血,ELISA检测被免小鼠血清的抗体水平,空斑减少试验测定抗体中和效价。SDS-PAGE结果表明毕赤酵母可以分泌表达完整的prME蛋白,目的蛋白在70–100 kDa之间;Western blotting结果显示分泌表达的prME蛋白具有良好的反应原性,进一步证明prME蛋白在酵母X33中以整体的形式分泌表达,没有发生水解切割。纯化目的蛋白,根据洗脱时间和体积表明其分子量大于1×10~6 Da,因此推断prME蛋白可能形成多聚化的颗粒。电镜观察发现直径30–50 nm的病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)。免疫试验结果表明,纯化后的重组蛋白10–15μg/只接种小鼠在3周后抗体达到高峰值,之后逐渐下降,免疫7周后小鼠血清仍可检测到JEV抗体。将prME VLPs以10μg/只的剂量与不同剂量的核酸佐剂配伍后接种小鼠,ELISA检测结果表明核酸佐剂可明显增强JEV prME VLPs免疫应答,免疫4周后小鼠血清的中和抗体效价为1∶80–1∶160。上述结果表明毕赤酵母表达JEV prME虽不能发生水解切割,但仍可形成VLP并诱导免疫小鼠产生较高水平中和抗体。

关键词：日本脑炎病毒 prME蛋白毕赤酵母病毒样颗粒免疫原性

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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中国兽医科学 2019年第7期49卷 821-827页

作者：于洁刘雪威白娟宋中宝姜平南京农业大学动物医学院农业部动物细菌学重点实验室

为了鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白抗原表位,本研究将PRRSV N蛋白进行了原核表达和纯化,并用纯化后的N蛋白免疫BALB/c小鼠。利用淋巴瘤细胞融合技术和间接ELISA抗体筛选方法,制备获得4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D10... 详细信息

为了鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白抗原表位,本研究将PRRSV N蛋白进行了原核表达和纯化,并用纯化后的N蛋白免疫BALB/c小鼠。利用淋巴瘤细胞融合技术和间接ELISA抗体筛选方法,制备获得4株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D10、3G12、6E2和6F4,Western-blot和IFA鉴定其均能与PRRSV特异性反应。4株单抗均属于IgG1亚类,轻链均为κ链。ELISA结果显示,3D10、3G12、6E2和6F4之间的叠加系数均在50%以上。选择N蛋白3个主要抗原表位合成肽进行ELISA检测,证明4株单抗识别的抗原表位均为30~52 aa,提示4株单克隆抗体亲和力可能存在一定差异,为该病毒研究提供了重要材料。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体 N蛋白