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基于CRISPR/Cas9系统构建重组人丁酰胆碱酯酶定向整合的山羊胎儿成纤维细胞株

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军事医学 2024年第6期48卷 421-428页

作者：毋云鹏邱业峰唐玉玲孙天奇秦佟童张睿法云智军事科学院军事医学研究院

目的利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复机制构建重组人丁酰胆碱酯酶（rhBChE）基因敲入山羊胎儿成纤维细胞株（GFF），为后续制备表达rhBChE的山羊提供细胞株。方法针对山羊β-酪蛋白（CSN2）基因设计并筛选有效sgRNA靶点，通过电转... 详细信息

目的利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复机制构建重组人丁酰胆碱酯酶（rhBChE）基因敲入山羊胎儿成纤维细胞株（GFF），为后续制备表达rhBChE的山羊提供细胞株。方法针对山羊β-酪蛋白（CSN2）基因设计并筛选有效sgRNA靶点，通过电转染、流式分选和PCR产物测序，在山羊乳腺上皮细胞（GMEC）中确认CSN2基因有效sgRNA；构建靶向有效靶点的红色荧光报告基因同源修复载体（P2A-mCherry），利用流式细胞术检测该靶点的定向整合及表达效率；构建靶向山羊胎儿成纤维细胞CSN2基因有效靶点的rhBChE同源修复载体（P2A-rhBChE），通过电转染和流式分选rhBChE阳性细胞克隆，经PCR产物测序鉴定rhBChE定向整合的阳性细胞株。结果确定sgRNA4为山羊CSN2基因的有效靶点，该靶点可用于目的基因的定向整合；成功构建3株rhBChE定向整合的阳性细胞株。结论靶向山羊CSN2基因的rhBChE阳性细胞株可为应用体细胞克隆技术制备乳腺表达rhBChE的山羊奠定基础。

关键词：丁酰胆碱酯酶 CRISPR/Cas9 CSN2基因同源定向修复山羊胎儿成纤维细胞

磷脂酶A2-重活化剂复合物治疗有机磷中枢中毒的研究

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军事医学 2024年第6期48卷 414-420页

作者：曹文缤王淋隋昕骆媛杨军王永安军事科学院军事医学研究院

目的利用磷脂酶A2(PLA2)开放血脑屏障（BBB）的特性，促使抗毒药物酰胺磷定（HI-6）进入中枢起效，为治疗中枢神经系统中毒提供新的研究思路。方法通过体外释放和体外稳定性实验等方法，对复合物（PLA2+HI-6）的组分进行物理性质表征... 详细信息

目的利用磷脂酶A2(PLA2)开放血脑屏障（BBB）的特性，促使抗毒药物酰胺磷定（HI-6）进入中枢起效，为治疗中枢神经系统中毒提供新的研究思路。方法通过体外释放和体外稳定性实验等方法，对复合物（PLA2+HI-6）的组分进行物理性质表征。利用荧光素钠模拟水溶性药物进行荧光染色，通过评价脑组织荧光病理，定性考察复合物的中枢递送能力。通过激光共聚焦显微镜下碘化丙啶染色，定性观察PLA2对细胞膜通透性的影响。通过建立梭曼染毒小鼠模型，评价复合物对抗有机磷中枢中毒效果：（1）测定小鼠脑乙酰胆碱酯酶重活化率；（2）观察小鼠脑组织病理切片；（3）统计不同处理组小鼠生存时间。分别从细胞水平和动物水平评价PLA2的安全性。结果体外释放和体外稳定性实验结果表明，加入PLA2并不影响HI-6的释放和降解。在动物水平，PLA2有助于荧光素钠进入脑组织被细胞摄取，表现出良好的中枢递送能力。PLA2与HI-6药物组合将染毒小鼠脑内乙酰胆碱酯酶的重活化率提升至50%，相比于单独给药HI-6，提高约12倍。小鼠脑组织病理结果显示，复合物能有效对抗神经毒剂中毒引起的中枢神经系统损伤，并在3倍染毒致死剂量下显著延长小鼠存活时间，同时明显缓解中枢中毒症状。递送机制研究发现，复合物通过增加细胞膜通透性，经跨细胞途径实现中枢递送。细胞水平和动物水平的安全性实验表明，PLA2在该研究中的使用剂量安全可靠，未造成不良反应。结论该研究以PLA2为开放材料和小分子药物HI-6组合，成功构建一种能够有效穿透BBB的复合物PLA2-HI-6。该复合物具备一定中枢靶向性，能显著提高神经毒剂中毒后脑中乙酰胆碱酯酶重活化率，为解决有机磷中枢中毒救治难题提供了参考。

关键词：神经性毒剂有机磷化合物磷脂酶A2 乙酰胆碱酯酶重活化

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慢性束缚肠道应激损伤小鼠模型的构建与评价

中国实验动物学报 2024年第2期32卷 190-201页

作者：郑建华陈菁青董巧燕法云智邱业峰军事医学研究院实验动物中心北京100071

目的结合社会心理应激导致炎症性肠病、肠易激综合征等一系列疾病的特点,建立实验性慢性束缚小鼠肠道应激损伤模型,为探讨慢性束缚应激诱导胃肠病的致病机制以及防治措施奠定基础。方法18只雄性SPF级BALB/c小鼠,适应7 d后,根据体重按随... 详细信息

目的结合社会心理应激导致炎症性肠病、肠易激综合征等一系列疾病的特点,建立实验性慢性束缚小鼠肠道应激损伤模型,为探讨慢性束缚应激诱导胃肠病的致病机制以及防治措施奠定基础。方法18只雄性SPF级BALB/c小鼠,适应7 d后,根据体重按随机数字表法分为2组,对照组及慢性束缚应激组。对小鼠进行束缚应激,每天3 h,连续束缚14 d,建立肠道损伤模型。通过观察体重、肠道组织病理形态变化、检测紧密连接蛋白表达、肠上皮细胞凋亡以及炎症细胞因子mRNA表达水平等指标对模型进行评价。结果慢性束缚应激14 d,小鼠表现为体重减轻,十二指肠绒毛高度变短、隐窝结构异常、绒毛/隐窝比下降;结肠黏膜炎性细胞浸润、隐窝结构不规则。蛋白免疫印迹、免疫组化和免疫荧光染色结果显示,慢性束缚应激后小鼠十二指肠和结肠紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1表达显著下降(P<0.05);肠上皮细胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3的表达显著增加(P<0.05)。此外,肠道炎症因子和趋化因子mRNA表达结果显示,慢性束缚应激14 d显著提高了小鼠十二指肠IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-10基因的表达(P<0.05);慢性束缚应激14 d显著提高了小鼠结肠IL-1β、IL-6、MCP-1的表达(P<0.001)。结论利用小鼠行为限制装置对小鼠连续束缚14 d,导致应激小鼠肠道组织结构异常、肠屏障功能障碍、肠上皮细胞凋亡,引发肠道炎症反应,表明慢性束缚应激肠道损伤小鼠模型构建成功。

关键词：慢性束缚应激肠道应激损伤肠道屏障模型评价细胞凋亡炎症反应

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高同型半胱氨酸血症对小鼠血糖稳态的影响

营养学报 2024年第1期46卷 22-27页

作者：丁天琪陈健文波储文彬樊嵘陈学伟军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所天津300050 天津西青医院中心实验室天津300380

目的探究高同型半胱氨酸血症(hyperhomo cysteinemia,HHcy)对血糖稳态的影响。方法将C57BL/6小鼠随机分为对照组(CHOW)、模型组(HMD)两组,每组10只。CHOW组使用对照饲料(AIN-93G)饲养;HMD组使用高蛋氨酸(AIN-93G+2%)饲料饲养。HHcy模型... 详细信息

目的探究高同型半胱氨酸血症(hyperhomo cysteinemia,HHcy)对血糖稳态的影响。方法将C57BL/6小鼠随机分为对照组(CHOW)、模型组(HMD)两组,每组10只。CHOW组使用对照饲料(AIN-93G)饲养;HMD组使用高蛋氨酸(AIN-93G+2%)饲料饲养。HHcy模型构建成功后,对两组小鼠进行葡萄糖耐量实验(oralglucose tolerance test,OGTT)、胰岛素耐量实验(insulin tolerance test,ITT)和胰岛素分泌实验。饲养4月后处理取材,取小鼠血浆和胰腺组织,采用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察小鼠胰腺病理学组织形态变化、免疫荧光染色技术检测胰腺胰岛素表达、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测胰腺胰岛素总含量。结果HMD组小鼠蛋氨酸饮食1月后,与CHOW组相比,血浆中Hcy水平显著增高(P<0.0001),成功构建HHcy模型;饲养4月后,与CHOW组小鼠相比,两组小鼠空腹血糖无明显差异,HMD组小鼠随机血糖显著升高(P<0.0001)、糖耐量受损(P<0.001)、胰岛素耐量受损(P<0.001);与CHOW组小鼠相比,HMD组小鼠葡萄糖刺激下的胰岛素分泌减少(P<0.0001);HE染色结果显示,两组小鼠胰腺组织形态无明显变化;小鼠胰腺胰岛素免疫荧光化学分析显示,与CHOW组小鼠相比,HMD组小鼠胰岛素荧光强度增强(P<0.001);与CHOW组小鼠相比,HMD组小鼠胰腺胰岛素总含量显著上升,差异有统计学意义(P<0.0001)。结论HHcy可以引起T2DM(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发生,同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)可能通过损伤胰岛素分泌功能影响血糖稳态。

关键词：同型半胱氨酸同型半胱氨酸血症血糖稳态胰岛β细胞胰岛素分泌

杜氏高生熊虫HdNINJ1基因的克隆鉴定及抗辐射功能研究

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基因组学与应用生物学 2024年第4期43卷 616-626页

作者：葛正平李磊张令强青岛大学基础医学院免疫学系青岛266071 军事科学院军事医学研究院北京102206

缓步动物(Tardigrades),俗称“熊虫”,是一类可以耐受超强辐射的小型无脊椎动物,但是目前对其抗辐射机制的认识仍十分匮乏。本研究旨在寻找潜在抗辐射基因,为研究缓步动物耐辐射提供新的认识。本研究在杜氏高生熊虫(Hypsibius dujardini... 详细信息

缓步动物(Tardigrades),俗称“熊虫”,是一类可以耐受超强辐射的小型无脊椎动物,但是目前对其抗辐射机制的认识仍十分匮乏。本研究旨在寻找潜在抗辐射基因,为研究缓步动物耐辐射提供新的认识。本研究在杜氏高生熊虫(Hypsibius dujardini)中发现了人类神经损伤诱导蛋白(nerve injury-induced protein,Ninjurin)同源的新基因,命名为HdNINJ1。本研究以杜氏高生熊虫cDNA为模板,采用PCR技术克隆得到HdNINJ1基因的编码区(coding sequence,CDS)序列,利用生物信息学方法分析其序列特征,并通过克隆形成实验、碱性彗星试验以及免疫荧光实验鉴定了该蛋白的抗辐射功能。结果显示,HdNINJ1基因CDS全长675 bp,编码224个氨基酸,包含1个Ninjurin结构域。细胞增殖实验结果表明,表达HdNINJ1基因的人U2OS细胞受4 Gy X射线辐照后其细胞存活率与对照组相比增加了50.9%;彗星试验和免疫荧光实验结果表明表达HdNINJ1基因的人U2OS细胞在分别受10 Gy和2 Gy X射线辐照后其DNA损伤分别减少了21.0%和22.9%,且结果具有统计学意义。研究结果表明,HdNINJ1可以促进人U2OS细胞的DNA损伤修复并提高其辐射耐受性。

关键词：杜氏高生熊虫 HdNINJ1基因生物信息学分析抗辐射

次级视觉皮层组织病理学改变和神经元钙活动增强参与微波辐射致焦虑样行为

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中华放射医学与防护杂志 2024年第6期44卷 464-471页

作者：冯志华潘婷何钢华常晨旭崔智琳杨镁楹郝延辉柳峰松李杨左红艳河北大学生命科学学院保定071002 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京100850

目的阐明微波辐射对焦虑样情绪行为以及次级视觉皮层组织结构和神经元钙活动的影响。方法选取C57BL/6N小鼠36只,按照随机数表法分为对照组和微波辐射组,其中单纯行为学检测对照组8只,辐射组7只;光纤记录结合行为学实验对照组8只,辐射组7... 详细信息

目的阐明微波辐射对焦虑样情绪行为以及次级视觉皮层组织结构和神经元钙活动的影响。方法选取C57BL/6N小鼠36只,按照随机数表法分为对照组和微波辐射组,其中单纯行为学检测对照组8只,辐射组7只;光纤记录结合行为学实验对照组8只,辐射组7只;苏木素⁃伊红(HE)染色每组各3只。采用中心频率9.875 GHz,平均功率密度12 mW/cm^(2)的X波段高功率微波模拟源,辐射15 min,建立微波辐射动物模型。利用旷场和高架十字迷宫实验,检测微波辐射后小鼠焦虑样情绪行为改变。采用HE染色和光学显微镜观察,研究微波辐射对次级视觉皮层组织形态学结构的影响。基于遗传编码钙成像技术,通过光纤记录结合旷场、高架十字迷宫行为学范式,检测次级视觉皮层V2M区神经元钙活动变化。结果微波辐射后,辐射组小鼠探索旷场中央区域次数及高架十字迷宫开放臂次数较对照组下降,差异均有统计学意义(t=2.24、3.10,P实验结果表明,微波辐射后小鼠探索旷场中央区域与对照组比较差异有统计学意义(t=-2.75,P<0.05);高架十字迷宫开放臂时辐射组对照组和辐射前比较,差异也均有统计学意义(t=-2.77、-3.41,P<0.05)。次级视觉皮层神经元钙活动均显著增强。结论微波辐射可导致焦虑样行为发生以及次级视觉皮层组织的病理学改变,次级视觉皮层神经元钙活动增强是微波辐射致焦虑样行为改变的重要机制。

关键词：微波辐射次级视觉皮层焦虑样行为神经元钙活动

基因修饰的干细胞外泌体水凝胶治疗放射性皮肤损伤的实验研究

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军事医学 2024年第5期48卷 325-333页

作者：任博媛李强靳嘉岩王一晨丁泓帆靳继德军事科学院军事医学研究院解放军总医院第四医学中心烧伤整形医学部

目的研究肝细胞生长因子修饰的牙髓干细胞外泌体水凝胶对放射性皮肤损伤的促愈合作用。方法利用超速离心法分离提取外泌体，分别通过纳米颗粒跟踪分析法、扫描电镜和Western印迹法对外泌体的粒径、形态和标志蛋白进行分析。采用CCK-8... 详细信息

目的研究肝细胞生长因子修饰的牙髓干细胞外泌体水凝胶对放射性皮肤损伤的促愈合作用。方法利用超速离心法分离提取外泌体，分别通过纳米颗粒跟踪分析法、扫描电镜和Western印迹法对外泌体的粒径、形态和标志蛋白进行分析。采用CCK-8、划痕实验和流式细胞术评估外泌体对辐射损伤皮肤细胞的作用。制备温敏型泊洛沙姆水凝胶，采用CCK-8法测试其生物相容性。建立小鼠放创复合伤模型，应用外泌体水凝胶进行治疗，通过创面愈合情况、创面组织HE染色和Masson染色评价创面愈合效果和治疗效果，通过Tunnel染色检测创面细胞凋亡情况，通过丙二醛含量和过氧化物酶活性检测评估创面氧化应激情况，对其作用机制进行初步分析。结果外泌体直径范围为30～150 nm，扫描电镜下呈圆盘状囊泡，CD9、CD63和TSG101表达阳性。细胞实验结果显示，外泌体能显著促进辐射损伤皮肤角质细胞和成纤维细胞的增殖和迁移，减少细胞凋亡。肝细胞生长因子修饰增强外泌体的作用。泊洛沙姆水凝胶显示出良好的温敏性和生物相容性。动物实验结果显示，外泌体治疗显著加快了小鼠放创复合伤的愈合，并抑制炎性浸润、减轻胶原沉积，肝细胞生长因子修饰外泌体促创面愈合作用最强，其促创面愈合的作用机制可能与促细胞增殖、减少细胞调亡和氧化应激有关。结论成功制备了一种新型的基因修饰的干细胞外泌体水凝胶，并证明了其在放射性皮肤损伤治疗中的有效性，为临床放射性皮肤损伤治疗提供了一种新的策略。

关键词：肝细胞生长因子牙髓干细胞外泌体泊洛沙姆温敏水凝胶放射性皮肤损伤

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治疗放烧复合伤的龙油溶致液晶研究

药学学报 2024年第5期59卷 1449-1457页

作者：郭婉婷贾学丽刘岩胡亚丹王可张蕾张勇金义光广东药科大学药学院广东广州510006 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京100850 安徽龙纪元生物科技有限公司安徽宿州234000

放烧复合伤(combined radiation and burn injury,CRBI)是在受到放射性损伤的同时或相继发生烧伤的一种复合伤,临床缺乏有效治疗药物。龙油(Loong oil,LO)是由海螵蛸、红花、核桃油和菜籽油组成的中药油浸物,具有抗辐射和促进组织生长... 详细信息

放烧复合伤(combined radiation and burn injury,CRBI)是在受到放射性损伤的同时或相继发生烧伤的一种复合伤,临床缺乏有效治疗药物。龙油(Loong oil,LO)是由海螵蛸、红花、核桃油和菜籽油组成的中药油浸物,具有抗辐射和促进组织生长的作用。本研究使用单油酸甘油酯制备溶致液晶并包载LO,得到龙油溶致液晶(Loong oil-lyotropic liquid crystals,LOL),用于皮肤CRBI的治疗。LOL在X射线小角散射中的峰值比约■,偏光显微镜下呈现双折射现象,为六角相液晶结构。LOL中LO含量为4%,载药量高,生物黏附性好,适合皮肤给药。所有动物实验经军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所伦理委员会批准且实验均按照相关指导原则和规定进行(批准号:IACUC-DWZX-2022-834)。与三乙醇胺乳膏相比,LOL皮肤渗透性显著增加,皮肤滞留性强,有利于深度CRBI的治疗。小鼠5 Gy ^(60)Co γ射线全身辐照后100℃烫伤6 s,成功构建深II度CRBI模型。LOL促进表皮细胞增殖及毛囊生成,加速伤口愈合并抑制瘢痕的发生,对CRBI有良好的治疗效果。本研究扩大了LO的应用范围,LOL是一种潜在的CRBI治疗药品。

关键词：放烧复合伤龙油溶致液晶电离辐射皮肤损伤

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色氨酸代谢调控肠道应激损伤作用的研究进展

中国实验动物学报 2024年第4期32卷 539-546页

作者：陈菁青郑建华董巧燕张文盛马连素邱业峰军事医学研究院实验动物中心北京100071 北京医药健康科技发展中心北京100035

肠道是动物体内最大的免疫器官,也是机体主要的消化、吸收、代谢场所,维持肠道稳态健康是维护动物机体健康的重要保障。研究表明应激易使肠屏障受损、通透性增加、肠道功能紊乱,引发肠道应激损伤。色氨酸是哺乳动物的一种必需氨基酸,具... 详细信息

肠道是动物体内最大的免疫器官,也是机体主要的消化、吸收、代谢场所,维持肠道稳态健康是维护动物机体健康的重要保障。研究表明应激易使肠屏障受损、通透性增加、肠道功能紊乱,引发肠道应激损伤。色氨酸是哺乳动物的一种必需氨基酸,具有改变肠道菌群组成与代谢,提高肠道黏膜屏障的功能,在维持肠道稳态方面发挥着重要作用。应激状态下大脑和肠道组织色氨酸及其代谢产物含量的异常,提示色氨酸可能在应激反应中具有重要作用。因此,深入探究应激因素的致病机制,揭示色氨酸及其代谢产物对应激动物肠道功能紊乱的调节作用,可为肠道应激损伤提供安全便捷有效的营养防治措施。本文主要就目前应激机制研究进展、肠道应激损伤与色氨酸代谢对肠应激损伤调控作用的研究现状及最新研究进展进行综述。

关键词：应激肠道微生物肠-脑轴色氨酸代谢肠应激损伤