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狂犬病病毒糖蛋白的杆状病毒表达及其免疫原性研究

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病毒学报 2012年第5期28卷 501-505页

作者：陈奇张守峰刘晔付云红孙程龙杨洋宫婷宋菲菲扈荣良军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122

构建表达狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)的重组杆状病毒,评价其表达出的SRV9株糖蛋白对小鼠免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆入穿梭质粒Bacmid中,构建重组穿梭质粒Bacmid-G,以此转染Sf9细胞。对病变细胞培养物进行... 详细信息

构建表达狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)的重组杆状病毒,评价其表达出的SRV9株糖蛋白对小鼠免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆入穿梭质粒Bacmid中,构建重组穿梭质粒Bacmid-G,以此转染Sf9细胞。对病变细胞培养物进行电镜观察,获得正确重组杆状病毒后,通过Western-blot、IFA及小鼠免疫实验鉴定表达产物的免疫反应性及免疫原性。正确构建重组穿梭质粒Bacmid-G;获得表达SRV9株糖蛋白的重组杆状病毒,其表达产物具有良好免疫原性;表达产物接种小鼠可诱导其产生抗狂犬病病毒中和抗体,中和抗体达到保护水平的比例为100%。本实验所获得的重组杆状病毒表达出的SRV9株糖蛋白具有较好的免疫原性,可诱导小鼠产生保护性中和抗体,该实验为进一步开发狂犬病亚单位疫苗奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白杆状病毒表达免疫

狂犬病病毒感染改变小鼠Toll样受体及相关细胞因子的表达

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吉林农业大学学报 2023年第1期45卷 121-126页

作者：衣惠鑫张健张岩霍明赫冯烨涂长春刘艳吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所/吉林省人兽共患病防控重点实验室长春130122

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)作为重要的固有免疫相关受体,在不同毒力狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染的鼠脑中发生了怎样的变化,目前尚未见具体的报道。因此使用不同RABV毒株(固定毒株CVS-11、街毒株GDMM、弱毒株SRV9)经... 详细信息

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)作为重要的固有免疫相关受体,在不同毒力狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染的鼠脑中发生了怎样的变化,目前尚未见具体的报道。因此使用不同RABV毒株(固定毒株CVS-11、街毒株GDMM、弱毒株SRV9)经颅内接种构建小鼠感染模型,并利用RT-qPCR、Western blot等方法探究小鼠脑内TLRs(TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9)、下游效应分子(IRF3、Irgm1)及相关细胞因子(IL-1β、IFN-α、IFN-β和IFN-γ)的表达改变。结果显示:CVS-11组与GDMM组相关指标的改变相类似,鼠脑内病毒拷贝数随感染时间的增加而升高,TLR2、TLR8、TLR9、Irgm1及IFN-α、γ表达显著上调,小鼠分别在感染后7,12 d(中位数)死亡;SRV9组的病毒拷贝数在感染后期显著下降,TLR7、TLR8、TLR9和IFN-γ的变化与病毒拷贝变化趋势一致,IFN-α无变化,小鼠未发生死亡。说明TLR2、TLR7、TLR8、TLR9参与RABV感染后的免疫调控,其中,TLR7的抗病毒作用更为重要,但其具体发挥的作用及作用机制,还有待于进一步研究。

关键词：狂犬病病毒小鼠感染模型固有免疫受体 Toll样受体免疫应答

基于狂犬病病毒G蛋白scFv介导的靶向shRNA制备与鉴定

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微生物学报 2010年第2期50卷 256-262页

作者：杨瑞梅崔燕杨松涛王承宇单虎王化磊夏咸柱甘肃农业大学动物医学院兰州760030 军事医学科学院军事兽医研究所长春军事兽医研究所长春130062 青岛农业大学动物科技学院青岛266109

【目的】探讨以狂犬病病毒G糖蛋白单链抗体介导的载体表达shRNA靶向制剂,靶向抑制狂犬病毒复制的可行性。【方法】应用PCR技术获得狂犬病毒G糖蛋白单链抗体scFv(G)和绿脓杆菌跨膜区-酵母DNA结合结构域ETA-GAL4基因,通过搭桥PCR法获得scF... 详细信息

【目的】探讨以狂犬病病毒G糖蛋白单链抗体介导的载体表达shRNA靶向制剂,靶向抑制狂犬病毒复制的可行性。【方法】应用PCR技术获得狂犬病毒G糖蛋白单链抗体scFv(G)和绿脓杆菌跨膜区-酵母DNA结合结构域ETA-GAL4基因,通过搭桥PCR法获得scFv(G)-ETA-GAL4(SEG)嵌合基因;克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pET28a(+)-scFv(G)-ETA-GAL4(pET28a-SEG);在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化包涵体,经复性、鉴定制得SEG蛋白;ELISA法检测表达蛋白与狂犬病毒特异结合活性;将SEG蛋白与含shRNA的质粒(pRNATU6.3-shRNA)连接制成靶向shRNA,接入100 TCID50狂犬病毒感染BHK-21细胞,35 h观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况;48 h用直接免疫荧光抗体试验测定复合物抑制病毒效果。【结果】克隆得到1557 bp的SEG蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达57 KDa的SEG蛋白,能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,SEG蛋白经镍柱纯化、复性后得率为2.8 mg/mL。ELISA试验证明SEG蛋白在一定浓度范围内与RV结合呈正相关。细胞试验表明GFP在细胞内得到表达;直接免疫荧光试验测定该复合物能抑制76%病毒复制。【结论】SEG蛋白能与携带shRNA的质粒结合,可运送该质粒至RV感染BHK-21细胞中,抑制狂犬病毒的复制。

关键词：狂犬病毒单链抗体绿脓杆菌外毒素跨膜区基因运送 shRNA

狂犬病病毒糖/核蛋白基因疫苗中间试验生物安全评价

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中国人兽共患病杂志 2005年第4期21卷 288-293页

作者：肖跃强张守峰袁慧君扈荣良军事医学科学院军事兽医研究所长春130062 河南职业技术师范学院

目的　本试验应用狂犬病病毒糖/核蛋白“二价”DNA疫苗- pVGN免疫4 0条无狂犬病疫苗免疫史的家犬,共免疫3次。通过观察受试犬的临床表现,监测抗性基因的转移,检测质粒及其主要元件在主要脏器和注射组织的分布、存留及整合,观察主要脏器... 详细信息

目的　本试验应用狂犬病病毒糖/核蛋白“二价”DNA疫苗- pVGN免疫4 0条无狂犬病疫苗免疫史的家犬,共免疫3次。通过观察受试犬的临床表现,监测抗性基因的转移,检测质粒及其主要元件在主要脏器和注射组织的分布、存留及整合,观察主要脏器组织病理学变化,分析疫苗对妊娠母犬及其子代的影响,来评价该疫苗的生物安全性。结果表明,该DNA疫苗可在动物体内诱导良好的体液免疫反应。同时,受试犬未出现任何异常临床表现;DNA疫苗中的卡那霉素抗性基因未在免疫犬肠道正常菌群中发生转移,DNA质粒也未经肠道菌群、尿液和唾液排放到体外;在心、脾、肾和注射部位均能检测到质粒的存在,并分别能存留约18、14 - 18、14和2 6周以上,但质粒DNA未与上述组织的基因组DNA发生整合;在主要代谢器官肝脏中始终未检测到质粒DNA或其主要元件;上述各主要脏器未出现组织病理学变化;对妊娠母犬和其子代无不良影响。说明本狂犬病“二价”DNA疫苗不仅具有良好的免疫原性,而且具有很好的安全性。

关键词：狂犬病基因疫苗 pVGN 安全性评价犬

狂犬病病毒M蛋白在杆状病毒中的表达、纯化及多克隆抗体的制备

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病毒学报 2016年第4期32卷 472-477页

作者：郑光来卢晓冉张静远陈腾王东方严妍张守峰扈荣良军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122

为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体。本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT-PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac I中,获取的重组质粒pFastbac I-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac ***... 详细信息

为表达狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)基质蛋白(M)蛋白,进而制备多克隆抗体。本研究以狂犬病病毒BD06株RNA为模版,通过RT-PCR扩增M蛋白基因全序列,将其插入质粒pFastbac I中,获取的重组质粒pFastbac I-M,经酶切鉴定后,转化到DH10Bac ***感受态中,以获取重组穿梭质粒Bacmid-M。用lipofectamine2000介导Bacmid-M转染Sf9细胞获取重组杆状病毒AcMNPV-M。用抗His标签的单体、犬抗RV阳性血清及兔抗RV阳性血清通过Western-Blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,用Western-Blot和FAVN试验鉴定多克隆抗体的反应原性及其病毒中和效价。结果表明:(1)利用杆状病毒表达系统成功的表达了大小约为25kD的重组M蛋白;(2)重组M蛋白具有良好的免疫原性和反应原性;(3)制备的多克隆抗体与狂犬病病毒BD06、SRV 9、CVS-24、ERA、PV 2061及aG株的M蛋白均能发生特异性反应,但其无病毒中和能力。本研究完成了重组M蛋白的表达、纯化并制备了其多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了物质基础。

关键词：狂犬病病毒基质蛋白杆状病毒表达纯化多克隆抗体

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9株猪瘟分离毒株的致病特性

中国兽医学报 2007年第2期27卷 145-149页

作者：王琴宁宜宝赵耘王在时张广川范学政宋立秦玉明沈青春丘惠深余兴龙吕宗吉徐兴然涂长春中国兽医药品监察所国家猪瘟参考实验室北京100081 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062

采用9株临床表现强、中、低致病特点的猪瘟野毒分离株第3代细胞毒作为种毒,按3mL/头剂量分别注射猪瘟抗原及抗体阴性猪,再用上一代传代猪发病后的血毒作为下一代接毒用种毒接种试验猪1头或2头,或上一代传代猪发病后,同圈放入1头或2头试... 详细信息

采用9株临床表现强、中、低致病特点的猪瘟野毒分离株第3代细胞毒作为种毒,按3mL/头剂量分别注射猪瘟抗原及抗体阴性猪,再用上一代传代猪发病后的血毒作为下一代接毒用种毒接种试验猪1头或2头,或上一代传代猪发病后,同圈放入1头或2头试验猪进行同居感染.如此进行,GDGZ1/95、BJCY1/96和JL1/94传至8代;FJFQ1/99传至7代;HeBHH1/95、HeNBY1/96、BJTX3/96、GXBH1/98和HeNXH2/98传至3代.结果显示:上述分离株传至3～5代过程中均表现出毒力增强的趋势,从3～5代传代到8(7)代的过程中毒力进一步增强并保持稳定,且均超过了标准石门强毒株的发病特点.所有试验猪均出现较典型的猪瘟临床症状,解剖后均表现出不同程度的病理变化,死后或解剖后的各种脏器经HCFA检查均为强阳性,这种现象进一步证实了猪是猪瘟病毒的敏感动物,各毒株之间毒力没有明显差异.对其中7株分离株传代血毒部分代次E2基因主要区域进行序列分析,结果仅GDGZ1/95株从F1～F8代中的F6代有2个核苷酸的差异,引起1个相应氨基酸的变异,其余毒株的不同代次没有碱基发生变异,初步说明猪瘟病毒基因型表现相对的稳定性.

关键词：猪瘟病毒毒力致病特性

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寨卡病毒及其与宿主蛋白相互作用研究进展

病毒学报 2020年第6期36卷 1201-1207页

作者：任琴杜寿文吕孔鹏张星艳戴少波李体远田明尧吴诗品李昌暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)感染内科深圳518000 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所中国医学科学院人兽共患病毒病防控关键技术研究创新单元长春130062

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)作为一种新出现的蚊媒病原体,与成人格林-巴利综合征(Guillain–Barresyndrome,GBS)、新生儿小头畸形以及神经系统缺陷等疾病有关。2016年世界卫生组织将寨卡疫情列为国际关注的公共卫生突发事件,近年来关于Z... 详细信息

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)作为一种新出现的蚊媒病原体,与成人格林-巴利综合征(Guillain–Barresyndrome,GBS)、新生儿小头畸形以及神经系统缺陷等疾病有关。2016年世界卫生组织将寨卡疫情列为国际关注的公共卫生突发事件,近年来关于ZIKV病原学、流行病学、感染与致病、抗病毒免疫应答、疫苗与药物的研究越来越多,为有效防控该病提供了理论依据和具体实践。本文就ZIKV蛋白组成及相应功能、感染周期、ZIKV受体及ZIKV-宿主相互作用等的最新研究进展进行综述,旨在正确认识和深入理解ZIKV致病与机体抗病相关机制,为设计有效的预防或治疗疫苗或药物提供参考资料。

关键词：寨卡病毒(ZIKV) 蛋白组成及功能病毒受体病毒-宿主相互作用

狂犬病病毒重组免疫毒素的表达及其生物活性鉴定

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中国生物工程杂志 2008年第5期28卷 1-5页

作者：王化磊王承宇杨松涛冯娜郑学星李群苏建青朱平夏咸柱吉林大学畜牧兽医学院长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所长春130062

将狂犬病病毒中和性单链抗体基因克隆入原核表达载体pET-PE40,经酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组免疫毒素原核表达载体。IPTG诱导后目的蛋白获得高效表达,SDS-PAGE分析目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于菌体中,表达量占菌体总... 详细信息

将狂犬病病毒中和性单链抗体基因克隆入原核表达载体pET-PE40,经酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组免疫毒素原核表达载体。IPTG诱导后目的蛋白获得高效表达,SDS-PAGE分析目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于菌体中,表达量占菌体总蛋白的32.29%。包涵体蛋白经体外复性及离子交换色谱柱、疏水作用色谱柱、Sephadex G200凝胶过滤层析柱三步纯化后获得纯度大于96%的目的蛋白,间接免疫荧光染色检测表明重组免疫毒素与狂犬病病毒感染细胞具有抗原结合活性,MTT试验显示,重组免疫毒素对狂犬病病毒感染细胞具有明显的杀伤作用,而对正常细胞无杀伤作用。

关键词：重组免疫毒素狂犬病病毒糖蛋白表达细胞毒作用

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬2型腺病毒的构建

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中国病毒学 2005年第2期20卷 155-158页

作者：张守峰扈荣良肖跃强田向阳夏咸柱军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡCAV 2及其E3 区重组质粒pVAX E3 为基础,通过DraⅢ和SspⅠ双酶切,缺失第25097bp 26141bp共1044bp的E3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9 株糖蛋白基因、SV40 po... 详细信息

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡCAV 2及其E3 区重组质粒pVAX E3 为基础,通过DraⅢ和SspⅠ双酶切,缺失第25097bp 26141bp共1044bp的E3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9 株糖蛋白基因、SV40 polyA基因构成的总长2424bp的表达盒,获得重组基因组质粒pPolyⅡCAV 2 CGS(34.7kb)。以AscⅠ和ClaⅠ双酶切,游离重组基因组(32.7kb),在脂质体LipofectamineTM 2000 介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3 缺失区携带狂犬病病毒糖蛋白表达盒的重组犬2 型腺病毒CAV 2 CGS。Western印迹试验表明,CAV 2 CGS表达了狂犬病病毒糖蛋白。初步接种试验显示,重组病毒可以诱导犬产生狂犬病病毒特异性抗体。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白犬2型腺病毒重组病毒