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狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸的制备

生物工程学报 2011年第5期27卷 799-804页

作者：王铁成张涛杨松涛王化磊高玉伟孙玮靳晓霞赵平森冯娜黄耕邹啸环夏咸柱中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122 中国医学科学院北京协和医院实验动物研究所北京100021 吉林大学畜牧兽医学院长春130062

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的狂犬病病毒抗体检测方法,对犬等动物免疫狂犬病疫苗后的抗体水平监测提供参考。用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11,Sepharose 4FF进行层析纯化。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标... 详细信息

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的狂犬病病毒抗体检测方法,对犬等动物免疫狂犬病疫苗后的抗体水平监测提供参考。用醋酸锌沉淀法沉淀狂犬病病毒CVS11,Sepharose 4FF进行层析纯化。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,标记纯化的狂犬病病毒,喷于试纸的结合释放垫(金标垫),将SPA(葡萄球菌表面A蛋白)和纯化的兔抗狂犬病病毒IgG分别喷于试纸的T(检测线)处和C(对照线)处,组装试纸条。用制备的试纸条对261份犬血清进行检测,与快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测的结果一致;对已知效价的犬狂犬病毒中和抗体(VNA)大于0.5 IU,结果为阳性;对狂犬病病毒中和抗体(VNA)小于0.5 IU/mL的血清,结果为阴性。制备的狂犬病病毒抗体胶体金检测试纸检测犬血清抗体,具有特异、便捷、快速的特点,能够检测出狂犬病病毒中和抗体大于0.5 IU的血清,适用于临床犬血清抗体水平监测,具有良好的应用前景。

关键词：胶体金狂犬病病毒中和抗体 CVS11

内蒙古自治区PRRSV分离株全基因测序与遗传变异分析

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中国病原生物学杂志 2019年第5期14卷 501-504页

作者：解蕊伊温树波李卓昕解长占赵冠宇庄忻雨张赫任静强鲁会军吉林农业大学动物科技学院预防兽医学教研室吉林长春130118 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所基因工程实验室内蒙古民族大学动物科学技术学院动物医学系预防兽医教研室延边大学农学院动物医学系中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学重点实验室

目的从内蒙古自治区某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料中分离PRRSV,进行毒株的遗传变异情况及分子生物学特征分析。方法从PRRS疑似病料中用Marc145细胞分离PRRSV,设计引物,PCR扩增其全基因序列并利用MEGAFO进行遗传进化分析。结... 详细信息

目的从内蒙古自治区某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料中分离PRRSV,进行毒株的遗传变异情况及分子生物学特征分析。方法从PRRS疑似病料中用Marc145细胞分离PRRSV,设计引物,PCR扩增其全基因序列并利用MEGAFO进行遗传进化分析。结果成功分离到一株PRRSV,该毒株可在Marc145细胞上增殖并产生细胞病变,免疫荧光检测到特异性荧光,将其命名为NM-12株。全基因序列及Nsp2核苷酸序列分析表明,该毒株属于美洲型,与***及GX1003等毒株处于同一分支。Nsp2氨基酸序列分析显示,该分离株具有与高致病性PRRSV一致的30个氨基酸缺失。ORF5基因序列分析显示,NM12与JXA1亲缘关系较近,但处于不同的分支。结论成功分离到1株PRRSV,属于美洲型,可为分析内蒙古自治区PRRSV遗传进化趋势及防控提供理论参考。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定全基因测序遗传变异分析

MALDI质谱成像技术在狂犬病病毒小鼠组织内定位研究中的应用

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中国免疫学杂志 2012年第6期28卷 540-543页

作者：徐静杨松涛万家余张守峰许娜李楠许琴刘文森军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122 吉林医药学院长春130122

目的:建立基于MALDI质谱的狂犬病病毒小鼠脑组织内质谱成像实验方法,寻找狂犬病病毒脑组织内定位标记物。方法:制备冰冻切片,进行组织上原位酶解及基质覆盖,利用MALDI质谱扫描成像,以及FlexImaging 2.1软件分析,对差异肽段进行二级质谱... 详细信息

目的:建立基于MALDI质谱的狂犬病病毒小鼠脑组织内质谱成像实验方法,寻找狂犬病病毒脑组织内定位标记物。方法:制备冰冻切片,进行组织上原位酶解及基质覆盖,利用MALDI质谱扫描成像,以及FlexImaging 2.1软件分析,对差异肽段进行二级质谱鉴定。结果:初步鉴定出了四段狂犬病病毒肽段,可作为组织内狂犬病病毒定位标志物。结论:为进一步提高狂犬病病毒组织内定位的精确度奠定了研究基础。

关键词： MALDI 狂犬病病毒分子成像

狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

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中国生物制品学杂志 2012年第5期25卷 536-538,548页

作者：李业伟杨洋刘晔王景龙孙程龙韩乃君刘祥义扈荣良吉林大学畜牧兽医学院长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122 华北制药集团新药研究开发有限公司

目的构建狂犬病病毒(Rabies virus,RV)SRV9株糖蛋白(Glycoprotein)基因的重组伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV),并进行鉴定。方法将SRV9株糖蛋白基因表达盒和报告基因Lac Z表达盒克隆至转移载体p8AA中,构建转移质粒p8AA-LacZ-G,与PRV Bartha-K61株基因组共转染BHK-21细胞,待细胞发生病变后,收集病毒液,进行多轮蓝色噬斑筛选,获得重组病毒rPRV-LacZ-G,对其进行电镜观察、PCR及Western blot鉴定,并测定重组病毒的滴度。结果酶切及测序鉴定证实,转移质粒p8AA-LacZ-G构建正确;电镜观察显示,重组病毒rPRV-LacZ-G呈典型的PRV特征结构;PCR分析显示可见RV 1 790 bp的特异性条带;Western blot显示,重组病毒可与SRV9株糖蛋白单抗发生反应,形成特异条带;经测定,重组病毒的滴度为106.25TCID50/ml,较Bartha-K61亲本株的滴度(107TCID50/ml)下降。结论成功构建了RV SRV9株糖蛋白基因重组PRV rPRV-LacZ-G,为其应用于兽用狂犬病疫苗的开发奠定了基础。

关键词：伪狂犬病病毒狂犬病病毒 SRV9株糖蛋白同源重组 Lac Z基因

H5N1虎源流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及临床应用

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畜牧与兽医 2006年第9期38卷 1-4页

作者：侯小强夏咸柱高玉伟薛琳王铁成吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062 解放军军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062

根据本室分离获得的虎源H5N1流感病毒的HA基因序列测定结果。结合GenBank中报道的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行同源性比较分析。选择保守序列区作为扩增区域，利用Primer5．0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物。采用... 详细信息

根据本室分离获得的虎源H5N1流感病毒的HA基因序列测定结果。结合GenBank中报道的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行同源性比较分析。选择保守序列区作为扩增区域，利用Primer5．0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物。采用成本较低、不需要特异探针引物、优化周期短。能区分病毒变异株的SYBR GreenⅠ随机掺入法建立定量PCR反应体系，并对反应条件进行优化。试验结果表明应用该方法对虎源H5流感病毒的检测具有高度的特异性，检测的灵敏度为10^1-10^2拷贝数。对20份病死老虎临床病料和24份人工感染的小鼠脏器病料用荧光定量RT-PCR方法、常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行检测。荧光定量RT-PCR方法检测结果略高于常规RT-PCR方法，但与病毒分离方法结果相一致。这说明荧光定量RT—PCR方法可以对临床上H5N1虎源流感病毒检测提供参考。

关键词： HSN1虎源流感病毒荧光定量RT-PCR 检测方法

狂犬病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

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中国兽医学报 2010年第11期30卷 1476-1479页

作者：许丹杨松涛冯娜高玉伟夏咸柱吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130062

针对狂犬病病毒基因Ⅰ型核蛋白保守区设计4条识别靶序列上6个位点的特异性引物,在链置换聚合酶(Bst酶)作用下,60℃恒温1 h内完成扩增。反应特异性强、灵敏度高。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应或浊度比较进行判定。通过对反应... 详细信息

针对狂犬病病毒基因Ⅰ型核蛋白保守区设计4条识别靶序列上6个位点的特异性引物,在链置换聚合酶(Bst酶)作用下,60℃恒温1 h内完成扩增。反应特异性强、灵敏度高。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应或浊度比较进行判定。通过对反应条件的优化,病毒基因的的最低检出量可达到101拷贝数。该方法可用于狂犬病病毒的实验室检测和临床初步诊断。

关键词：狂犬病病毒等温扩增 LAMP

流感病毒NS蛋白对IFITM基因表达的研究影响

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流感病毒NS蛋白对IFITM基因表达的研究影响

第十届全国免疫学学术大会

作者：崔卓栋田明尧曹佳媛袁森金宁一军事医学科学院军事兽医研究所

IFITM蛋白具有免疫细胞信号转导,细胞粘附、肿瘤发生、生殖细胞归位和成熟、及促进骨矿物化的生物学功能。流感病毒NS蛋白是非结构蛋白,由病毒基因组的第八区段分别编码为NS1、NS2非结构蛋白质。NS1作为干扰素(IFN)的拮抗剂,与流感病毒... 详细信息

IFITM蛋白具有免疫细胞信号转导,细胞粘附、肿瘤发生、生殖细胞归位和成熟、及促进骨矿物化的生物学功能。流感病毒NS蛋白是非结构蛋白,由病毒基因组的第八区段分别编码为NS1、NS2非结构蛋白质。NS1作为干扰素(IFN)的拮抗剂,与流感病毒的致病性有关,流感高致病性毒株极可能是通过NS1蛋白进化更加有效地抑制IFN介导的抗病毒效应,NS2基因编码的蛋白质能抑制报告基因的表达,其留在细胞质中调节NS蛋白的合成。虽有研究揭示IFITM蛋白质抑制虫媒病毒的早期复制,但流感病毒NS蛋白与IFITMs蛋白分子的关系尚未见文献报道。为了理清流感病毒NS蛋白表达对IFITMs蛋白表达的影响,本试验通过设置合适的内参基因将目的基因表达归一化,调整荧光定量PCR条件,进行蛋白基因表达稳定性、灵敏性、特异性等分析,建立了准确测定参考基因和目的基因在细胞中表达量的体系方法,分析了流感病毒NS蛋白对人IFITM1、2、3基因表达水平的影响,同时利用Western-blot检测了IFITM1、2、3的蛋白表达量变化。结果表明:IFITM1、2、3和β-actin标准曲线的相关系数分别为0.998,0.99,0.99,0.995,扩增效率分为106.284%、101.03%、104.929%、101.962%,批内及批间变异系数研究结果将对进一步阐明IFITMs与宿主的相互作用并为抗病毒感染提供新的借鉴与提示。

关键词：流感病毒NS蛋白 IFITM蛋白基因表达实时荧光PCR

来源： cnki会议评论

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狂犬病病毒糖蛋白重组犬2型腺病毒的构建

狂犬病病毒糖蛋白重组犬2型腺病毒的构建

狂犬病病毒糖蛋白哺乳动物细胞稳定表达细胞系的建立

家畜传染病学会第六次人畜共患病学术交流会

作者：张守峰扈荣良肖跃强田向阳夏咸柱军事医学科学院军事兽医研究所

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2及其E3区重组质粒pVAX-E3为基础,通过DraⅢ和Ssp Ⅰ双酶切,缺失25097bp-26141bp共1044bpE3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因、SV40 polyA... 详细信息

本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2及其E3区重组质粒pVAX-E3为基础,通过DraⅢ和Ssp Ⅰ双酶切,缺失25097bp-26141bp共1044bpE3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因、SV40 polyA构成的总长2424bp的表达盒,获得重组基因组质粒pPolyⅡ-CAV-2-CGS(34.7kb)。以AscⅠ和ClaⅠ双酶切,游离重组基因组(32.7kb),在脂质体Lipofectamine 2000介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3区携带狂犬病病毒糖蛋白表达盒的重组犬2型腺病毒CAV-2-CGS。Western印迹试验表明,CAV-2-CGS表达了狂犬病病毒糖蛋白。初步接种试验显示,重组病毒可以诱导犬产生狂犬病病毒特异性抗体。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白犬2型腺病毒重组病毒

来源： cnki会议评论

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中国生物工程杂志 2009年第4期29卷 46-50页

作者：于恒智张守峰扈荣良张乐萃青岛农业大学动物科技学院青岛266109 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所长春130062

试验首先根据GenBank上所发表的狂犬病病毒CVS-24株糖蛋白基因序列,设计并合成一对特异性引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),获得糖蛋白全长cDNA,连接在pMD18-T载体上,测序证明克隆的正确性后,将其插入真核表达载体pIRES1neo,构... 详细信息

试验首先根据GenBank上所发表的狂犬病病毒CVS-24株糖蛋白基因序列,设计并合成一对特异性引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),获得糖蛋白全长cDNA,连接在pMD18-T载体上,测序证明克隆的正确性后,将其插入真核表达载体pIRES1neo,构建了糖蛋白单一表达载体pICG,表达质粒通过脂质体转染BHK-21细胞,在G418抗性压力下出现细胞克隆,通过PCR检测,确定启动子与糖蛋白基因在细胞基因组中共同整合。借助W estern blot检测,证明所表达的糖蛋白与狂犬病抗血清有特异的反应性。采用间接ELISA法,筛选出3株高效表达糖蛋白的细胞株,分别命名为ICG1、ICG2、ICG3。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白转染稳定表达