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Ser84是spindlin1定位与功能发挥的关键位点

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生物化学与生物物理进展 2009年第2期36卷 175-181页

作者：丛斌张鹏王静雪曾泉陈琳岳文裴雪涛军事医学科学院野战输血研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

spindlin1为作者所在研究组克隆并命名的肿瘤相关新基因,之前研究表明spindlin1蛋白定位于细胞核,并有可能通过对TCF-4通路的调节参与对肿瘤细胞生长和周期的调控.为进一步探索spindlin1的作用机制,明确spindlin1结构与功能的关系,在生... 详细信息

spindlin1为作者所在研究组克隆并命名的肿瘤相关新基因,之前研究表明spindlin1蛋白定位于细胞核,并有可能通过对TCF-4通路的调节参与对肿瘤细胞生长和周期的调控.为进一步探索spindlin1的作用机制,明确spindlin1结构与功能的关系,在生物信息学分析及晶体结构解析的基础上,构建系列突变表达载体,首先以spindlin1蛋白亚细胞定位为指标,观察野生型及系列突变体spindlin1蛋白的亚细胞定位,并进一步检测野生型及突变体spindlin1对TCF-4荧光素酶报告基因转录活性的调控作用,以明确spindlin1定位与功能的关键位点.结果表明:Ser14+Ser84、Ser84+Ser99、Ser14+Ser84+Ser99位点Ser到Ala的联合突变能使野生型融合蛋白在细胞核内集中分布的特性消失,成为全细胞弥散分布,而Ser14、Ser84、Ser99各位点的单独突变或Ser14+Ser99联合突变对spindlin1蛋白的细胞核内分布没有影响.与此同时,对TCF-4荧光素酶报告基因活性的分析表明,Ser14+Ser84、Ser84+Ser99、Ser14+Ser84+Ser99的联合突变使spindlin1对其活性的激活作用消失或降低.上述结果表明,Ser84是spindlin1细胞定位与功能发挥的关键位点,其作用发挥需要Ser14与Ser99的协助.

关键词： spindlin1 突变细胞定位 TCF-4

胚胎干细胞向造血干/祖细胞定向诱导分化的研究进展

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生物化学与生物物理进展 2009年第7期36卷 797-802页

作者：杨超习佳飞岳文裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是指由胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)细胞经体外抑制培养而筛选得到的细胞,具有无限增殖潜能,在体外可以向造血细胞分化,有可能为造血干细胞移植和血细胞输注开辟新的来源.此外,ES细胞向造... 详细信息

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是指由胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)细胞经体外抑制培养而筛选得到的细胞,具有无限增殖潜能,在体外可以向造血细胞分化,有可能为造血干细胞移植和血细胞输注开辟新的来源.此外,ES细胞向造血干/祖细胞的定向诱导分化也为阐明哺乳动物造血发育的细胞和分子机制提供了良好的体外模型.对ES细胞向造血干/祖细胞定向分化的研究进展进行了综述.

关键词：胚胎干细胞造血干/祖细胞诱导体外分化

NRSF慢病毒干涉载体的构建及功能初步检测

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生物化学与生物物理进展 2008年第2期35卷 151-158页

作者：杨印祥李艳华刘庆斌张赛男陈琳吕洋白慈贤南雪裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设... 详细信息

为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计,然后构建慢病毒干涉载体.包装产生慢病毒干涉毒液,用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株,利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况,观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化.构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功,并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株,RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明,NRSF干涉片段的干涉效率为56%(n=6,P细胞株,干涉NRSF后,其下游基因特别是胰岛素基因开始表达.这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用.

关键词：神经元限制性沉默因子神经元限制性沉默元件 RNA干涉胰岛素

神经元限制性沉默因子对人胰岛素基因转录调控作用的研究

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生物化学与生物物理进展 2007年第9期34卷 952-959页

作者：刘庆斌李艳华杨印祥袁红丰张锐秦立蓬吕洋张赛男孙迪金陈琳白慈贤南雪王韫芳裴雪涛军事医学科学院输血研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因.先用生物信息学手段对相关基因进行了分析.筛选及序列比对发现,人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相... 详细信息

为了研究神经元限制性沉默因子(NRSF)调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,进一步寻找胰岛细胞中可能存在的其他NRSF调控基因.先用生物信息学手段对相关基因进行了分析.筛选及序列比对发现,人胰岛素核心启动子区有一段与NRSE相似的序列,提示,它可能受NRSF调控.构建了含NRSF基因的慢病毒载体,将其稳定转染于INS-1细胞.构建了3种荧光素酶报告载体:含有人胰岛素启动子-荧光素酶(hInsP-LUC)的慢病毒载体,pGL3-Basic载体和含有2拷贝NRSE样基序-荧光素酶(NRSE-LUC)的报告载体.利用稳定转染及瞬时转染实验观察NRSF对报告载体中荧光素酶活性的影响.利用电泳迁移率变动分析实验观察NRSE样基序与NRSF蛋白的结合情况,并通过竞争结合实验、引入特异性抗体实验证实探针与蛋白质结合的特异性.RT-PCR检测证实,感染空病毒的INS-1细胞不表达NRSF,感染含目的基因慢病毒的INS-1细胞能表达NRSF.将含有hInsP-LUC的慢病毒载体稳定转染于上述2种细胞,荧光素酶活性分析结果显示,NRSF的过表达能明显降低胰岛素启动子的活性.瞬时转染hInsP-LUC报告系统于上述2种细胞,结果也显示NRSF能明显抑制胰岛素启动子-荧光素酶的活性.将含有NRSE-LUC的报告载体瞬时转染于上述2种细胞,结果表明过表达NRSF的INS-1细胞组的荧光素酶相对值比对照组有明显下降.电泳迁移率变动分析实验进一步证实,此NRSE样序列可以与NRSF蛋白特异结合,这种特异结合可以被标准的NRSE序列所竞争.结果表明,人胰岛素启动子中含有NRSE样序列,该序列通过与NRSF蛋白结合从而抑制人胰岛素启动子的转录活性.这一研究工作有助于进一步了解NRSF在胰岛细胞中的调控作用.

关键词：神经元限制性沉默因子(NRSF) 神经元限制性沉默元件(NRSE) 胰岛素启动子

Wnt3a转基因基质细胞的建立及其对脐血CD34^+造血干/祖细胞扩增作用的研究

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生物化学与生物物理进展 2005年第9期32卷 835-841页

作者：师伟韩姝李艳华谢小燕施双双陈琳白慈贤闫舫南雪王韫芳裴雪涛军事医学科学院输血研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

Wnt信号通路在造血干/祖细胞自我更新的过程中发挥至关重要的作用.纯化的Wnt3a蛋白可以实现造血干/祖细胞的扩增.通过病毒转染原代小鼠骨髓基质细胞,建立转基因滋养层细胞.通过共培养对转基因滋养层细胞扩增CD34+造血干/祖细胞的作用进... 详细信息

Wnt信号通路在造血干/祖细胞自我更新的过程中发挥至关重要的作用.纯化的Wnt3a蛋白可以实现造血干/祖细胞的扩增.通过病毒转染原代小鼠骨髓基质细胞,建立转基因滋养层细胞.通过共培养对转基因滋养层细胞扩增CD34+造血干/祖细胞的作用进行了研究.实验结果显示,与普通滋养层加细胞因子组相比,经转基因滋养层加细胞因子组培养的CD34+造血干/祖细胞集落形成能力(CFC)是其(1.55±0.06)倍;混合集落形成能力是其(1.95±0.26)倍;高增殖潜能集落形成能力(HPP-CFC)是其(1.45±0.40)倍;LTC-IC活性是其(3.83±0.86)倍.结果表明,转基因滋养层细胞通过分泌具有天然活性的Wnt3a蛋白能在体外有效地扩增造血干/祖细胞的数量.

关键词： Wnt3a 滋养层细胞造血干/祖细胞扩增

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siRNA沉默socs3对红系发育的影响

生物化学与生物物理进展 2008年第7期35卷 778-784页

作者：刘雨潇吉蕾袁红丰陈琳薛郡管兆轩南雪白慈贤王韫芳岳文裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

为了研究细胞因子信号转导分子3(suppressor of cytokine signals-3,SOCS-3)对造血发育的影响,构建了SOCS-3慢病毒siRNA干涉载体,并转染人红白血病细胞株K562.根据绿色荧光蛋白的表达进行流式分选后,获得了高表达慢病毒干涉载体的细胞.... 详细信息

为了研究细胞因子信号转导分子3(suppressor of cytokine signals-3,SOCS-3)对造血发育的影响,构建了SOCS-3慢病毒siRNA干涉载体,并转染人红白血病细胞株K562.根据绿色荧光蛋白的表达进行流式分选后,获得了高表达慢病毒干涉载体的细胞.实时荧光定量PCR和Western-blot检测了转染细胞中SOCS-3基因的干涉效率,结果显示,与对照组相比,siRNA干涉后K562细胞SOCS-3基因的表达量仅为其相对表达量的22.1%,干涉效率77.9%;Western-blot结果显示,SOCS-3在蛋白质水平表达也明显受抑制.进一步对SOCS-3基因沉默后的K562细胞进行了诱导分化,并采用联苯胺染色法检测K562细胞向红系分化比例变化,免疫荧光染色检测细胞表面抗原的变化,RT-PCR检测造血相关基因的变化.结果发现,SOCS-3沉默后K562细胞向红系的发育能力显著提高.研究结果证明,SOCS-3在造血发育中有重要调控作用,而对其表达进行干涉或沉默将在规模化的红细胞诱导研究中发挥重要作用.

关键词： siRNA 基因沉默 SOCS-3 慢病毒 K562细胞

慢病毒介导的稳定表达bFGF的胎儿肝脏基质细胞株的建立

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生物化学与生物物理进展 2007年第2期34卷 207-214页

作者：习佳飞王韫芳张鹏袁红丰施双双闫舫陈琳白慈贤南雪裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

通过重组慢病毒系统感染人胎儿肝脏基质细胞(fetalliverstromalcell,FLSC),建立了能够稳定、高效表达碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的细胞株bFGF/FLSC.从流产胎儿肝脏组织分离富集基质细胞,对其进行了生长... 详细信息

通过重组慢病毒系统感染人胎儿肝脏基质细胞(fetalliverstromalcell,FLSC),建立了能够稳定、高效表达碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的细胞株bFGF/FLSC.从流产胎儿肝脏组织分离富集基质细胞,对其进行了生长特性和表面标志的鉴定,其在体外维持传代35代,依然保持正常的染色体核型.从胎儿骨髓间充质干细胞中克隆得到bFGF基因,构建重组慢病毒载体,感染FLSC,根据荧光表达强弱进行流式分选,获得能够继续稳定传代的低表达和高表达bFGF的两株细胞,RT-PCR和蛋白质印迹证实,细胞株中bFGF基因的稳定表达.RT-PCR结果显示,弱荧光和强荧光表达细胞的bFGF,在mRNA水平的表达分别是转染空载体细胞的2.33倍和6.19倍;蛋白质印迹结果显示,在蛋白质水平表达分别是1.76倍和5.05倍.用建立的bFGF/FLSC作饲养层细胞体外培养人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells,hES),结果证明,其能在无或少量添加外源bFGF的条件下,维持人ES细胞增殖及其干性达20代.bFGF/FLSC细胞株的建立,将为构建低成本、安全高效的人胚胎干细胞的培养体系及研究造血细胞的发育分化提供适宜的微环境.

关键词：胎儿肝脏基质细胞慢病毒碱性成纤维细胞生长因子转基因人胚胎干细胞

细胞角蛋白19启动子调控的双报告载体的构建及其在肝干/祖细胞分化研究中的应用

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生物化学与生物物理进展 2010年第7期37卷 728-736页

作者：张衡贾雅丽岳文陈琳谢小燕南雪何丽娟裴海云裴雪涛军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

肝干/祖细胞是肝细胞和胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)共同的前体细胞,为了对这一前体细胞的分化情况进行研究,利用报告基因来监测肝干/祖细胞的分化走向.首先,通过PCR方法从肝癌细胞系HepG2的全基因组中克隆了细胞角蛋白... 详细信息

肝干/祖细胞是肝细胞和胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)共同的前体细胞,为了对这一前体细胞的分化情况进行研究,利用报告基因来监测肝干/祖细胞的分化走向.首先,通过PCR方法从肝癌细胞系HepG2的全基因组中克隆了细胞角蛋白19(CK19)启动子片段,构建了CK19启动子调控的海肾荧光素酶和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)双报告载体(pSicoR-CK19-hrl-mrfp).其次,将上述慢病毒载体转染肝干/祖细胞后,通过流式细胞分选获得稳定转染的细胞株.再次,将上述细胞株与表达"上皮形态发生素"(Epimorphin,EPM)的PT67细胞共培养后,整合有pSicoR-CK19-hrl-mrfp表达载体的肝干/祖细胞不仅形态发生了变化,而且排列为二维环状结构,另外还检测到由CK19启动子启动表达的海肾荧光素酶和RFP,细胞形态和基因表型都证明肝干/祖细胞经诱导已经分化成为BECs.与此形成对照的是肝干/祖细胞与不表达EPM的PT67细胞共培养后,没有观测到上述的变化.所以,CK19启动子调控的双报告载体不仅可以实时地显示肝原始细胞在不同的诱导环境下的分化走向,而且还可以定量地检测CK19启动子活性的变化情况.总之,这一载体的成功构建将为研究肝干/祖细胞的分化提供了便捷的工具,同时也有助于筛选可诱导肝干/祖细胞定向分化的分子.

关键词：细胞角蛋白海肾荧光素酶红色荧光蛋白肝干/祖细胞分化

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肿瘤治疗的新希望:肿瘤干细胞

中国医学科学院学报 2005年第6期27卷 659-661页

作者：刘大庆裴雪涛军事医学科学院野战输血研究所干细胞与再生医学研究室北京100850

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织内数量极少的既保持干细胞自我更新能力又能够导致肿瘤发生、发展的一群细胞。目前,在白血病中肿瘤干细胞的研究较为深入,在一些实体肿瘤如乳腺癌、神经系统肿瘤中也发现了肿瘤干细胞存在的证据。肿瘤干细胞... 详细信息

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织内数量极少的既保持干细胞自我更新能力又能够导致肿瘤发生、发展的一群细胞。目前,在白血病中肿瘤干细胞的研究较为深入,在一些实体肿瘤如乳腺癌、神经系统肿瘤中也发现了肿瘤干细胞存在的证据。肿瘤干细胞的研究正逐渐得到重视并成为恶性肿瘤研究领域新的热点和方向。明确肿瘤干细胞的生物学性状及其导致肿瘤发生的内在机制,并以肿瘤干细胞为靶标开展相关研究,就有可能为肿瘤治疗提供新的手段并最终为根治恶性肿瘤带来希望。

关键词：肿瘤干细胞自我更新靶标