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Spike蛋白介导细胞融合程度定量方法的建立及其在药物筛选中的应用

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安徽大学学报(自然科学版) 2024年

作者：刘慕仪张畅李辉龙刘家茏焉秋林杨孟欣黄麟飞万禄明钟辉魏从文军事科学院军事医学研究院生物工程研究所

新型冠状病毒S蛋白与受体ACE2结合介导细胞融合的发生，为进一步探究新冠合胞体发生、发展的规律及致病机制，明确关键蛋白靶点，筛选干预合胞体形成的药物，笔者拟构建新冠S蛋白介导的细胞融合程度的定量方法。利用pCDH-CMV-MCS-EF1-P... 详细信息

新型冠状病毒S蛋白与受体ACE2结合介导细胞融合的发生，为进一步探究新冠合胞体发生、发展的规律及致病机制，明确关键蛋白靶点，筛选干预合胞体形成的药物，笔者拟构建新冠S蛋白介导的细胞融合程度的定量方法。利用pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro、pLV-CMV-MCS-3FLAG-IRES-Bla、S蛋白基因序列、ACE2基因序列、LacZ基因序列、EcoR Ⅰ 限制性内切酶及同源重组酶构建慢病毒穿梭质粒pCDH-S、pCDH-ACE2、pLV-α与pLV-ω，利用该慢病毒质粒分别构建稳定表达S与ACE2蛋白的293FT和A549细胞系，随后利用pLV-α与pLV-ω慢病毒质粒分别感染上述稳定细胞系，构建出可以定量细胞融合程度的细胞系，即293FT-S1-56、A549-S1-56、293FT-ACE2△11-41、A549-ACE2△11-41。最后采用Western Blot蛋白免疫印迹技术鉴定上述融合定量细胞系中S与ACE2的过表达效果，并通过细胞共培养确定融合效果，用β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒定量细胞融合程度。结果显示，慢病毒载体和稳定细胞系构建成功，时间梯度、转染梯度实验显示出该系统良好的定量灵敏度，并能用于卡莫司他(Camostat mesylate)和氯硝柳胺(Niclosamide)等药物抗融合效果的定量评价。成功构建的新冠病毒Spike蛋白介导细胞融合程度定量系统，可用于不同S蛋白突变体致融合能力评价和抗融合药物筛选评价，为进一步的研究奠定了技术基础。

关键词：新型冠状病毒 Spike蛋白 ACE2受体细胞融合定量慢病毒

D-氨基酸营养缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗的构建与评价

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中华医院感染学杂志 2024年 2087-2093页

作者：宋雯歌陆璐关亦妍桑姝丽刘纯杰赵晓冬王艳春军事科学院军事医学研究院生物工程研究所军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所

目的研究D-谷氨酸和D-丙氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的安全性和免疫原性,探讨D-氨基酸营养缺陷株作为口服减毒活疫苗或载体的可行性。方法通过聚合酶链式反应(PCR)扩增并测序进行基因型分析,同时利用生长曲线实验、扫描电镜和透射... 详细信息

目的研究D-谷氨酸和D-丙氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的安全性和免疫原性,探讨D-氨基酸营养缺陷株作为口服减毒活疫苗或载体的可行性。方法通过聚合酶链式反应(PCR)扩增并测序进行基因型分析,同时利用生长曲线实验、扫描电镜和透射电镜观察菌株生长状态和形态,确认敲除相应基因后D-氨基酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌表型稳定;药敏试验探讨外源补充D-氨基酸后,营养缺陷株对作用于细胞壁的青霉素和氨苄青霉素的敏感性;安全性评价有设置不同免疫剂量攻毒,脏器病理切片,小鼠活体成像,菌株计数和粪便16s rRNA全长测序,以检测D-氨基酸营养缺陷型菌株的定植和侵袭能力;免疫小鼠测抗体滴度检测疫苗引起的免疫应答,免疫后攻毒测定D-氨基酸营养缺陷株的保护效力。结果 D-氨基酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌生长稳定,口服有效减毒,在小鼠体内停留时间缩短,激发的炎症反应较低。尤其是D-谷氨酸营养缺陷株,即使在外源补充D-谷氨酸的条件下耐药性也明显降低,既减少了对小鼠机体的损伤又能激发有效的保护性免疫应答。结论D-谷氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌有希望作为减毒活疫苗或载体递送抗原,预防病原体感染。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌黏膜免疫口服疫苗 D-氨基酸营养缺陷减毒活疫苗

缺氧抑制因子ZNF92在肝癌生长和侵袭中的功能研究

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中国生物工程杂志 2024年

作者：李婷婷张婷张亚楠刘婕丁丽华叶棋浓贵州大学医学院军事科学院军事医学研究院生物工程研究所

目的：探究缺氧调控因子锌指蛋白92（Zinc finger proteins 92，ZNF92）在肝细胞癌生长和侵袭中发挥的功能及其可能的调控机制。方法：（1）利用RNA-seq筛选出缺氧抑制因子ZNF92并通过RT-qPCR和Western blot检测缺氧环境(1% O2)对ZNF92... 详细信息

目的：探究缺氧调控因子锌指蛋白92（Zinc finger proteins 92，ZNF92）在肝细胞癌生长和侵袭中发挥的功能及其可能的调控机制。方法：（1）利用RNA-seq筛选出缺氧抑制因子ZNF92并通过RT-qPCR和Western blot检测缺氧环境(1% O2)对ZNF92的mRNA表达水平和蛋白表达水平的影响。（2）利用慢病毒载体构建敲低ZNF92基因的肝癌细胞系。（3）通过CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验确定ZNF92基因对肝细胞癌HepG2细胞、SMMC7721细胞生长和侵袭的影响。（4）通过在敲低ZNF92的稳定肝癌细胞系中瞬时转染锌指E盒结合同源盒1 （Zinc Finger E-box binding homeobox，ZEB1）的siRNA ，通过Western blot实验确定ZEB1转染成功，并在该细胞系中检测ZNF92能否通过调控ZEB1的表达以调控上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）进程。（5）通过在敲低ZNF92的稳定肝癌细胞系中瞬时转染缺氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）的siRNA ，检测ZNF92是否可能通过HIF-1α影响细胞迁移和侵袭。结果：（1）缺氧抑制ZNF92的mRNA表达和蛋白表达。（2）ZNF92调控EMT的关键转录因子ZEB1的蛋白表达影响EMT进程。（3）ZNF92抑制肝癌细胞的迁移和侵袭，但不影响肝癌细胞的增殖。（4）ZNF92通过ZEB1部分调控肝癌细胞的迁移和侵袭。（5）ZNF92可能通过HIF-1α调控ZEB1以影响肝癌细胞的迁移和侵袭。结论：新的缺氧抑制因子ZNF92可能通过HIF-1α影响EMT进程，进而通过调控ZEB1影响肝癌细胞的迁移和侵袭。

关键词：肿瘤缺氧 ZNF92 HIF-1α ZEB1

D-氨基酸营养缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗的构建与评价

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中华医院感染学杂志 2024年第14期34卷 2087-2093页

作者：宋雯歌陆璐关亦妍桑姝丽刘纯杰赵晓冬王艳春军事科学院军事医学研究院生物工程研究所北京100071 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所北京100071

目的研究D-谷氨酸和D-丙氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的安全性和免疫原性,探讨D-氨基酸营养缺陷株作为口服减毒活疫苗或载体的可行性.方法通过聚合酶链式反应(PCR)扩增并测序进行基因型分析,同时利用生长曲线实验、扫描电镜和透射电镜... 详细信息

目的研究D-谷氨酸和D-丙氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的安全性和免疫原性,探讨D-氨基酸营养缺陷株作为口服减毒活疫苗或载体的可行性.方法通过聚合酶链式反应(PCR)扩增并测序进行基因型分析,同时利用生长曲线实验、扫描电镜和透射电镜观察菌株生长状态和形态,确认敲除相应基因后D-氨基酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌表型稳定;药敏试验探讨外源补充D-氨基酸后,营养缺陷株对作用于细胞壁的青霉素和氨苄青霉素的敏感性;安全性评价有设置不同免疫剂量攻毒,脏器病理切片,小鼠活体成像,菌株计数和粪便16s rRNA全长测序,以检测D-氨基酸营养缺陷型菌株的定植和侵袭能力;免疫小鼠测抗体滴度检测疫苗引起的免疫应答,免疫后攻毒测定D-氨基酸营养缺陷株的保护效力.结果D-氨基酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌生长稳定,口服有效减毒,在小鼠体内停留时间缩短,激发的炎症反应较低.尤其是D-谷氨酸营养缺陷株,即使在外源补充D-谷氨酸的条件下耐药性也明显降低,既减少了对小鼠机体的损伤又能激发有效的保护性免疫应答.结论D-谷氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌有希望作为减毒活疫苗或载体递送抗原,预防病原体感染.

关键词：鼠伤寒沙门氏菌黏膜免疫口服疫苗 D-氨基酸营养缺陷减毒活疫苗

运用翻译起始区结构优化实现广谱抗病毒蛋白PA在大肠杆菌中的高效表达

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中国生物工程杂志 2024年

作者：李秋烨谢德健史姝蔡秀怡谭志霞张彦沈文龙叶湘漓赵志虎湖南师范大学医学院长沙市第九医院军事医学科学院生物工程研究所

大肠杆菌是重要的生物工程宿主系统，约1/3的上市蛋白类生物技术药物由大肠杆菌重组生产。但是，密码子偏性所致目的蛋白表达水平较低、不具备真核生物部分翻译后修饰等多种因素，限制了大肠杆菌系统的广泛应用。广谱抗病毒蛋白，对于... 详细信息

大肠杆菌是重要的生物工程宿主系统，约1/3的上市蛋白类生物技术药物由大肠杆菌重组生产。但是，密码子偏性所致目的蛋白表达水平较低、不具备真核生物部分翻译后修饰等多种因素，限制了大肠杆菌系统的广泛应用。广谱抗病毒蛋白，对于类似新冠的新突发再发传染性疾病的高效防控，具有重要意义。为了实现广谱抗病毒蛋白PA在大肠杆菌中的高效表达、拓展其应用潜能，本研究通过密码子优化、结合mRNA翻译起始区TIR（translation initiation region）二级结构最小自由能MFE（minimum free energy）预测等，对PA在大肠杆菌中的表达水平进行了研究，结果发现：密码子的优化，可以实现PA在大肠杆菌中的表达，但是总体表达水平并不是十分理想。TIR的二级结构MFE的大小与表达水平的高低密切相关，通过密码子的同义突变进而改变TIR局部二级结构、MFE大小，可以进一步提高、或降低PA的表达水平，从而从正反两个方面，证实全局密码子的优化结合TIR局部二级结构驱动的MFE调整，是实现PA在大肠杆菌中高效表达的一种现实、有效策略，对于蛋白类生物技术药物在原核系统中的高效表达与规模化生产，具有重要的应用价值。

关键词：大肠杆菌原核表达翻译起始区 mRNA二级结构密码子优化

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高通量测序文库质量控制技术研究进展

遗传 2024年第2期46卷 140-148页

作者：崔梦楠郭彦武雅蓉裴广倩崔玉军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所北京100071

作为生命科学和医学领域中的关键性支撑技术,高通量测序已得到快速发展并日趋成熟。该技术工作流程可分为核酸提取、文库构建、上机测序、数据分析等,其中文库构建是承上启下的关键步骤,文库构建的效果受制于上游样品质量,同时会对测序... 详细信息

作为生命科学和医学领域中的关键性支撑技术,高通量测序已得到快速发展并日趋成熟。该技术工作流程可分为核酸提取、文库构建、上机测序、数据分析等,其中文库构建是承上启下的关键步骤,文库构建的效果受制于上游样品质量,同时会对测序数据产出后的数据分析造成影响。对文库构建质量控制技术的选择和实施是提高结果可靠性、降低测序数据误差的重要保证。本文对文库构建质量控制技术进行深入综述,总结评价其原理、优缺点、适用范围,并对实际应用场景中相关技术的选择进行了论述,以期为科研人员、疾病预防控制人员等在选择文库质量控制技术时提供理论依据与参考,从而促进高通量测序工作的质量和效率。

关键词：高通量测序文库文库浓度文库大小分布质量控制技术评价

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胞磷胆碱的合成策略及研究进展

生物工程学报 2024年第6期40卷 1644-1660页

作者：唐雅倩林彩宝柯崇榕陶勇黄建忠杨欣伟福建师范大学生命科学学院工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心工业微生物教育部工程研究中心福建福州350108 中国科学院微生物研究所中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室北京100101

胞磷胆碱(cytidine-5′-diphosphatecholine,CDP-choline)是磷脂酰胆碱和乙酰胆碱的前体,参与形成细胞膜磷脂双分子层并能够稳定神经递质系统,对脑损伤引起的功能和意识障碍、帕金森病、抑郁症以及青光眼等均有疗效,在临床医学和保健品... 详细信息

胞磷胆碱(cytidine-5′-diphosphatecholine,CDP-choline)是磷脂酰胆碱和乙酰胆碱的前体,参与形成细胞膜磷脂双分子层并能够稳定神经递质系统,对脑损伤引起的功能和意识障碍、帕金森病、抑郁症以及青光眼等均有疗效,在临床医学和保健品领域已有应用。胞磷胆碱的化学合成工艺需要采用昂贵且有毒的试剂且会产生各种副产物,工业化生产成本高,正逐步被生物合成法替代。生物合成法分为微生物发酵法和生物催化法两种:微生物发酵法原料相对低廉,但转化率低、分离纯化工艺繁杂;生物催化法分为细胞高密度培养和体外催化合成2个阶段,合成工艺繁杂,但转化率高、提取成本相对较低,是目前工业化生产的主要方式。本文综述了胞磷胆碱的化学合成和生物合成进展,重点介绍胞磷胆碱的代谢途径及生物催化合成工艺,以期为胞磷胆碱的工业化生产提供思路。

关键词：胞磷胆碱化学合成生物合成生产策略

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HIV耐药毒株传播的监测

中国热带医学 2024年第1期24卷 6-11页

作者：李韩平李林李敬云军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071

传播性耐药(transmitted drug resistance,TDR)指HIV耐药毒株的感染,在没有抗逆转录病毒(antiretroviral,ARV)药物暴露史的患者中检出耐药,将影响一线抗病毒治疗及暴露前后预防的效果,是实现艾滋病防治目标的重大现实威胁。耐药毒株适... 详细信息

传播性耐药(transmitted drug resistance,TDR)指HIV耐药毒株的感染,在没有抗逆转录病毒(antiretroviral,ARV)药物暴露史的患者中检出耐药,将影响一线抗病毒治疗及暴露前后预防的效果,是实现艾滋病防治目标的重大现实威胁。耐药毒株适应性的改变是决定其传播风险的根本性生物学因素,影响监测人群选择、从感染到耐药检测时间的确定及检测方法的应用;传播性耐药突变的定义和分类是获得准确监测结果的关键。本文介绍了近年来耐药毒株的适应性、监测的耐药突变、监测人群选择等方面的研究进展,提出了我国TDR监测应重点开展的工作,包括建立适合我国毒株特点的监测耐药突变、建立和使用高分辨测序方法准确鉴定混合碱基、实现TDR监测的规范化等,从而为准确获得TDR监测结果,有效遏制耐药毒株的传播提供科技支撑。

关键词：传播性耐药监测耐药突变适应性

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生物组织光子传输蒙卡仿真加速技术研究综述

中国激光 2024年

作者：徐楼喆李婷中国医学科学院生物医学工程研究所

蒙特卡洛模拟方法通过对指定光学参数的组织模型进行随机抽样计算，理论上可以对任意复杂模型达到非常高的精度。在实际使用中，蒙特卡洛模拟方法计算时间长的特点限制了其精度的提高，因此本文重点关注蒙特卡洛模拟加速方法和技术的进... 详细信息

蒙特卡洛模拟方法通过对指定光学参数的组织模型进行随机抽样计算，理论上可以对任意复杂模型达到非常高的精度。在实际使用中，蒙特卡洛模拟方法计算时间长的特点限制了其精度的提高，因此本文重点关注蒙特卡洛模拟加速方法和技术的进展，分析了各种加速方法的原理，比较了加速方法的速度、精度和适用场景，讨论了蒙特卡洛方法在组织光学领域未来发展的潜在方向。

关键词：医用光学光子传输仿真蒙特卡洛模拟加速