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液相色谱-串联质谱法检测甲基化和乙酰化修饰的组蛋白H3及其在表观遗传药物评估中的应用

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分析化学 2024年第6期52卷 818-836页

作者：史钦鋆瞿敏敏李治马波陈佳徐斌徐华谢剑炜青岛大学药学院军事医学研究院国家安全特需药品全国重点实验室

基于液相色谱-串联质谱技术（Liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS），采用三重四极杆质谱的多反应选择离子监测（Multiple reaction monitoring, MRM）模式，应用自下而上的蛋白分析策略，对细胞组蛋白H3 N端的... 详细信息

基于液相色谱-串联质谱技术（Liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS），采用三重四极杆质谱的多反应选择离子监测（Multiple reaction monitoring, MRM）模式，应用自下而上的蛋白分析策略，对细胞组蛋白H3 N端的常见甲基化和乙酰化修饰位点及表达水平进行定量分析。将本方法应用于28种表观遗传药物引起的细胞组蛋白H3修饰变化的检测，结果表明，其中25种药物（包括去乙酰化酶抑制剂Abexinostat、Valproic acid和AGK7等）暴露HepG2细胞24 h后诱导的组蛋白H3修饰变化与其已报道的生物活性一致，同时也可检测到其它修饰变化；其余3种药物，包括去甲基化酶抑制剂IOX1、GSK-j1和乙酰化转移酶抑制剂L002，在暴露细胞后仅检测到与已报道活性不同的修饰变化；总体检测吻合率达到89.3%。本方法能通量化定量分析组蛋白H3修饰位点及其变化，具有特异性好和修饰信息丰富等优势，有望为表观遗传活性化合物的筛选评估及作用机制探讨提供新的技术工具。

关键词：表观遗传药物液相色谱-串联质谱组蛋白甲基化乙酰化

环磷酰胺作用于SH-SY5Y细胞的损伤效应及能量代谢变化（英文）

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中国药理学与毒理学杂志 2024年

作者：李佳佳王娇肖文一韦冬晖张永祥蒋宁周文霞军事科学院军事医学研究院国家安全特需药品全国重点实验室

目的建立环磷酰胺(CTX)及其活性代谢衍生物4-氢过氧环磷酰胺(4-HC)的神经损伤模型，研究CTX和4-HC的神经毒性效应及其潜在机制。方法采用8个不同浓度的CTX溶液(0.01 mmol·L-1～80 mmol·L-1)和8个不同浓度的4-HC溶液(0.01μmol·L-1... 详细信息

目的建立环磷酰胺(CTX)及其活性代谢衍生物4-氢过氧环磷酰胺(4-HC)的神经损伤模型，研究CTX和4-HC的神经毒性效应及其潜在机制。方法采用8个不同浓度的CTX溶液(0.01 mmol·L-1～80 mmol·L-1)和8个不同浓度的4-HC溶液(0.01μmol·L-1～80μmol·L-1)作用于SH-SY5Y细胞48 h，应用IncuCyte ZOOM系统记录细胞形态变化和生长曲线；采用CCK-8法检测细胞活力；用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞LDH释放率。CTX(1,5,10和20 mmol·L-1)和4-HC(1,5,10，和20μmol·L-1M)以同样的方式处理细胞后，使用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)染色法检测细胞增殖；免疫荧光法检测DNA双链断裂标志物γ-H2AX的含量和线粒体膜电位变化。CTX(1,5和10 mmol·L-1)和4-HC(1,5,10μmol·L-1)以同样的方式处理细胞后，SeaHorse XF检测细胞糖酵解及线粒体氧化磷酸化水平。结果与细胞对照组相比，CTX和4-HC组的细胞融合率曲线逐渐下降，呈浓度和时间依赖性；CTX和4-HC组的细胞活力呈浓度依赖性下降(P<0.01)，半数抑制浓度(IC50)分别为4.44 mmol·L-1和4.781μmol·L-1;LDH释放率显著增加(P<0.01);EdU+细胞百分比显著下降(P<0.01);γ-H2AX+细胞百分比显著增加(P<0.05)；线粒体膜电位显著降低(P<0.05);CTX和4-HC处理导致最大糖酵解能力、酵解储备、最大呼吸速率和ATP产生速率显著降低(P<0.05)。结论 CTX和4-HC对SH-SY5Y细胞具有明显的细胞毒性作用，可降低细胞活力，破坏细胞膜结构，阻碍细胞增殖，其机制可能与导致细胞DNA损伤、能量代谢紊乱和线粒体功能障碍密切相关。

关键词：环磷酰胺 4-过氧化氢环磷酰胺神经毒性能量代谢

失血大鼠肠道多节段病理学评价及巨噬细胞功能研究

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军事医学 2024年

作者：魏汉琪蒋兴伟苏允琦高锋华宁畅文安华英巩家媛刘鹏宇王哲马骏于群军事科学院军事医学研究院

目的研究重度失血大鼠模型中各肠道节段的病理损伤和炎症情况随时间变化的特点，探索肠道巨噬细胞极化对肠道炎症病理生理的可能影响。方法将雄性Wistar大鼠随机平均分为假手术组和失血组，失血组股动静脉插管并在25～30 min内快速失... 详细信息

目的研究重度失血大鼠模型中各肠道节段的病理损伤和炎症情况随时间变化的特点，探索肠道巨噬细胞极化对肠道炎症病理生理的可能影响。方法将雄性Wistar大鼠随机平均分为假手术组和失血组，失血组股动静脉插管并在25～30 min内快速失去大鼠总血量的40%，假手术组仅插管不失血，然后将上述两组大鼠分别随机平均分为5组，分别以放血完成后0 h、3 h、6 h、12 h和24 h作为实验终点处死，快速分离全肠并在十二指肠、空肠、回盲部、结肠和直肠相同位置剪取肠段进行病理组织学评分、酶联免疫吸附测定相关炎症因子以及多色免疫组织化学染色测定巨噬细胞表面标志物，统计实验数据并分析。结果 1.与假手术组相比，结肠3 h、6 h时的组织学评分无显著差异，直肠除24 h以外各时间点评分无显著差异，其余各肠段0 h后各时间点的评分与假手术组均存在显著差异（P所减少。结论不同肠道节段在失血发生后病理损伤程度有差异，并且存在一定的时间变化规律，与巨噬细胞炎症水平也有一定的相关性。

关键词：失血大鼠肠道炎症巨噬细胞

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合成生物学在多糖结合疫苗研发中的应用

合成生物学 2024年第2期5卷 338-352页

作者：叶精勤黄文华潘超朱力王恒樑军事科学院军事医学研究院病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071

由于合成生物学的快速发展,目前已经实现了人工设计DNA和蛋白质的合成,对具有重要生物学功能、结构也更为复杂的糖类物质进行精准设计合成,也将是合成生物学未来发展的重要方向。近年来,一种基于细菌寡糖转移酶体系的蛋白多糖偶联技术... 详细信息

由于合成生物学的快速发展,目前已经实现了人工设计DNA和蛋白质的合成,对具有重要生物学功能、结构也更为复杂的糖类物质进行精准设计合成,也将是合成生物学未来发展的重要方向。近年来,一种基于细菌寡糖转移酶体系的蛋白多糖偶联技术发展迅速,已被广泛应用于病原细菌多糖结合疫苗的生物合成制备。本文综述了该技术体系中的寡糖转移酶元件、载体蛋白元件、异源多糖抗原合成线路以及工程菌株改造等核心关键模块的最新研究进展。使用生物活体系统,发酵生产多糖结合疫苗,具有产物均一性好、步骤简便、绿色环保等优势,是一种亟待发展的新兴技术,同时也存在一些技术细节需要完善。未来,寡糖转移酶的定向进化、纳米颗粒型蛋白载体的应用、多糖合成基因的组合重排、工程菌株的代谢途径优化,将有望进一步促进多糖结合疫苗的生物合成研究。

关键词：糖合成生物学多糖结合疫苗蛋白多糖偶联技术寡糖转移酶

用于中和抗体评价和进入抑制剂筛选的多变异株SARS-CoV-2假病毒体系构建与评估

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中国免疫学杂志 2024年第4期40卷 811-817页

作者：李静璇刘峰王莹程军平肖智勇周文霞军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

目的:构建一种高滴度SARS-CoV-2假病毒(PsV)体系,用于中和抗体体外评价与病毒进入抑制剂的筛选。方法:共转染慢病毒载体质粒psPAX2、pCDH-Luc与SARS-CoV-2 Spike(S)蛋白表达质粒,收获的假病毒上清感染ACE2-293T细胞。通过测定p24蛋白含... 详细信息

目的:构建一种高滴度SARS-CoV-2假病毒(PsV)体系,用于中和抗体体外评价与病毒进入抑制剂的筛选。方法:共转染慢病毒载体质粒psPAX2、pCDH-Luc与SARS-CoV-2 Spike(S)蛋白表达质粒,收获的假病毒上清感染ACE2-293T细胞。通过测定p24蛋白含量反映PsV滴度,Western blot检测S蛋白在PsV中的表达。利用原始株、D614G、Gamma、Delta、Omicron PsV亚型对1株S蛋白单克隆抗体的中和能力进行评价。采用两种已报道的病毒进入抑制剂氯喹、角叉菜胶检测对Omicron PsV进入的影响。结果:慢病毒载体成功掺入了S蛋白,Western blot结果显示665Y位突变的S蛋白表现出与野生型全长S蛋白(180 kD)不同的切割形式(90 kD)。三质粒体系包装出的PsV滴度更高,S蛋白表达质粒、转移质粒与包装质粒比例在1∶3∶3时为原始株PsV包装的最佳条件。该条件下包装出的5种PsV滴度均在20 ng/ml以上。PsV可有效感染ACE2-293T细胞,双报告基因GFP与萤火虫荧光素酶表达明显,化学发光数值高达106。基于原始株S蛋白的单克隆抗体可有效中和原始株PsV,对原始株PsV的中和作用是对变异株PsV的10~30倍。病毒进入抑制剂氯喹与ι-角叉菜胶可显著抑制Omicron PsV进入宿主细胞。结论:成功构建了高滴度的SARS-CoV-2 PsV进入体系,该体系以荧光素酶报告基因为指示,包含原始株和D614G、PsV Gamma、Delta、Omicron 4种变异株PsV,可有效评价中和抗体与病毒进入抑制剂活性,区分二者对不同变异株的敏感性差异对抗SARS-CoV-2药物研发有重要意义。

关键词： SARS-CoV-2 假病毒 S蛋白中和抗体病毒进入抑制剂

稳定表达PSMB9-eGFP-His蛋白的THP-1细胞系建立及免疫蛋白酶体活性检测

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生物工程学报 2024年第7期40卷 2282-2293页

作者：王佳豪冯利杰张瑶徐平安徽医科大学基础医学院安徽合肥230032 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所、中国医学科学院蛋白质组学与药物研发新技术创新单元、北京蛋白质组研究中心医学蛋白质组全国重点实验室北京102206

泛素/蛋白酶体系统(ubiquitin/proteasome system,UPS)在调控细胞内蛋白质稳态过程中发挥重要功能,UPS中蛋白酶体的催化活性受β1(PSMB6)、β2(PSMB7)和β5(PSMB5)亚基调控,在干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、炎症反应、氧化应激等条件诱导下,β1、β2和β5可被相应的β1i(PSMB9)、β2i(PSMB10)和β5i(PSMB8)替换,组装形成免疫蛋白酶体(immunoproteasome)。与标准蛋白酶体相比,免疫蛋白酶体具有更强的免疫调节作用,如加工递呈MHCⅠ抗原、调节促炎细胞因子的产生及T细胞分化、增殖等。免疫蛋白酶体的异常聚集会导致帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化等神经退行性疾病的发生。为探究PSMB9在细菌感染后发挥的功能,本研究通过构建过表达PSMB9-eGFP-His的慢病毒质粒,利用三质粒系统转染HEK293T包装慢病毒,嘌呤霉素筛选,获得稳定表达PSMB9融合蛋白的人髓系白血病单核细胞THP-1细胞系,利用蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)及荧光显微镜验证了PSMB9融合蛋白的表达,通过实时荧光定量PCR(quantitative PCR,q PCR)计算了稳转细胞系中PSMB9-eGFP基因的拷贝数。免疫荧光结果发现eGFP-His不会影响PSMB9的亚细胞定位,镍柱亲和纯化实验证实PSMB9融合蛋白可组装至20S免疫蛋白酶体中,且具有底物切割活性。上述结果证明PSMB9-eGFP基因成功整合入THP-1细胞基因组并稳定表达,可用于探究PSMB9亚基在活细胞模型中不同感染条件及疾病进程中的细胞定位、动态表达和活性的变化,并为其他2个免疫蛋白酶体亚基PSMB8和PSMB10的稳转细胞系构建提供了参考。

关键词：免疫蛋白酶体慢病毒稳转细胞系 PSMB9 THP-1

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DNA聚合酶θ:易错的多功能DNA末端修复分子

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生物化学与生物物理进展 2024年第3期51卷 493-503页

作者：王瑶陈国江冯健男石艳春王晶郑源强内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室呼和浩特010058 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

DNA聚合酶θ(DNA polymerase theta,Polθ)是一种广泛存在于动植物中的DNA修复酶。它在选择性末端连接(alternative end-joining,Alt-EJ)途径中发挥着关键作用,常参与DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)损伤修复。在正常生理状态下,Polθ主要调控基因组稳定性。然而,在恶性肿瘤发生时,Polθ表现出异常高表达水平,并参与调控肿瘤细胞的恶性转变过程。研究表明,抑制Polθ活性可导致同源重组(homologous recombination,HR)缺陷的肿瘤细胞发生合成致死(synthetic lethality,SL)。因此,已经开发出多种针对Polθ的小分子抑制剂,可与其他化疗药物联合使用以抑制恶性肿瘤的发展。此外,敲除或抑制Polθ活性还能增加HR修复效率,从而提高外源基因靶向整合效果。本文综述了Polθ及其介导的Alt-EJ修复机制在生物学功能方面的最新研究进展,为靶向Polθ在肿瘤治疗和基因编辑方面的应用提供理论基础。

关键词： DNA聚合酶θ DNA双链断裂修复基因组稳定性肿瘤抑制靶向整合

一种基于多路纳米孔测序技术的多种血清型沙门氏菌快速分型方法

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军事医学 2024年

作者：王东帅师丹阳李君文金敏军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所天津市环境与食品安全风险监督技术重点实验室

目的构建基于多路纳米孔测序技术的本地化沙门氏菌血清型分型方法，评估血清型数量和测序时间对分型结果的影响，为多种血清型沙门氏菌的同时快速分型提供方法。方法首先，利用纳米孔测序技术建立多菌株测序方法。其次，基于沙门氏菌... 详细信息

目的构建基于多路纳米孔测序技术的本地化沙门氏菌血清型分型方法，评估血清型数量和测序时间对分型结果的影响，为多种血清型沙门氏菌的同时快速分型提供方法。方法首先，利用纳米孔测序技术建立多菌株测序方法。其次，基于沙门氏菌核心基因组数据库，构建本地化沙门氏菌血清型分型流程。最后，评估血清型数量和测序时间对分型结果的影响。结果建立的多种血清型沙门氏菌分型方法准确率和特异性均可达到100%，且在2小时测序时间内可完成6株以上不同血清型的沙门氏菌快速准确分型。结论本方法能够同时对多株血清型沙门氏菌快速分型，有效提高沙门氏菌血清型的鉴定效率，为环境水体中沙门氏菌血清型的快速鉴定提供有力支持。

关键词：多路纳米孔测序沙门氏菌血清型快速分型

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水熊虫耐干燥机制的关键分子筛选

中国科学：生命科学 2024年第5期54卷 936-950页

作者：郑坤沈磐侯雨杉王斐王虎强杨冬军事科学院军事医学研究院生命组学研究所国家蛋白质科学中心(北京)北京蛋白质组研究中心医学蛋白质组全国重点实验室北京102206 中国人民解放军南部战区总医院骨科广州510010 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所北京100850

水熊虫,学名缓步动物,是一种能耐受多种极端环境的微小水陆两栖动物,但其耐干燥的具体分子机制仍不明.本研究收集3种水熊虫和其他11种后生动物的基因组数据,使用OrthoFinder判定得到4个基因家族在水熊虫中特异扩张;接着用eggNOG-Mapper... 详细信息

水熊虫,学名缓步动物,是一种能耐受多种极端环境的微小水陆两栖动物,但其耐干燥的具体分子机制仍不明.本研究收集3种水熊虫和其他11种后生动物的基因组数据,使用OrthoFinder判定得到4个基因家族在水熊虫中特异扩张;接着用eggNOG-Mapper注释变形拉式熊虫的基因的功能信息,并分析其在正常、低湿隐生、补水80 min、补水3 h四种状态的基因表达谱,筛选出5032个差异基因,用Fuzzy C-Means算法分为9类,对干燥状态下高表达的基因做功能富集分析,得到耐干燥关键分子尿苷二磷酸糖基转移酶UGT72E1(UDP-glycosyltransferase72E1).此外,UGT72E1在典型高生熊虫低湿隐生状态同样存在高表达,推测其通过调节苯丙烷代谢增强水熊虫耐干燥能力.

关键词：水熊虫缓步动物耐干燥低湿隐生尿苷二磷酸糖基转移酶苯丙烷代谢