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病毒载体疫苗研究进展

合成生物学 2024年第2期5卷 281-293页

作者：王步森徐婧含高智强侯利华军事科学院军事医学研究院前沿生物技术实验室北京100071

近十年来,中东呼吸综合征、埃博拉出血热、寨卡病毒感染、新型冠状病毒肺炎等重大传染性疾病疫情相继出现,对疫苗的快速研发提出重大挑战。其中病毒载体疫苗是新型疫苗研发的重要形式,它可以通过雾化吸入或口服等方式进行无创免疫,在没... 详细信息

近十年来,中东呼吸综合征、埃博拉出血热、寨卡病毒感染、新型冠状病毒肺炎等重大传染性疾病疫情相继出现,对疫苗的快速研发提出重大挑战。其中病毒载体疫苗是新型疫苗研发的重要形式,它可以通过雾化吸入或口服等方式进行无创免疫,在没有佐剂的情况下发挥免疫作用,同时诱导体液、细胞和黏膜免疫反应,具有良好的免疫原性和安全性。随着对病毒基因组和结构蛋白等元件认识的不断深入,利用合成生物学研究思路系统设计、改造病毒载体,从而赋予重组病毒载体疫苗高滴度生产、高安全性和高免疫原性等生物学特征,对疫苗研发具有重要指导意义。本文综述了复制型、非复制型等病毒载体疫苗研发策略,以及具有临床应用价值的疫苗病毒载体,如腺病毒载体、痘病毒载体、水疱性口炎病毒载体等,希望对利用合成生物学进行新型病毒载体疫苗的研发提供一定的参考。未来,病毒载体疫苗必将向着更高的安全性、更强的保护性、更好的依从性、更低的生产成本等方向迭代发展。

关键词：病毒载体传染病疫苗合成生物学改造

一株降低了抗体依赖性增强效应的西尼罗病毒中和抗体的表达与体外活性研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第1期44卷 44-49页

作者：郝相君陈楠朱婉露王晶陈国江乔春霞李新颖沈倍奋冯健男柴立辉肖鹤军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所北京100850 河南大学抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室开封475004

目的建立降低抗体依赖性增强(antibody-dependent enhancement,ADE)效应的抗体表达系统,以期降低目标抗体的ADE效应。方法对哺乳细胞抗体表达载体Fc区进行L234A和L235A点突变,建立抗体表达载体pFRT-IgG1κ-FcM。选取前期工作中获得的1... 详细信息

目的建立降低抗体依赖性增强(antibody-dependent enhancement,ADE)效应的抗体表达系统,以期降低目标抗体的ADE效应。方法对哺乳细胞抗体表达载体Fc区进行L234A和L235A点突变,建立抗体表达载体pFRT-IgG1κ-FcM。选取前期工作中获得的1株具有显著ADE效应的抗体Wt-WNV利用pFRT-IgG1κ-FcM系统进行表达,获得突变后抗体FcM-WNV。ELISA检测FcM-WNV与靶抗原西尼罗病毒包膜蛋白DⅢ(West Nile virus envelope protein-DⅢ,WNV E-DⅢ)的结合,流式细胞术分析FcM-WNV与人高亲和力IgG Fc受体hFcγRⅠ(hCD64)的结合。假病毒感染宿主细胞(BHK21和K562)试验检测FcM-WNV的体外中和活性。结果FcM-WNV与Wt-WNV表达水平相当,能识别结合WNV E-DⅢ,且呈浓度依赖效应;与Wt-WNV相比,FcM-WNV与hCD64的结合力明显减弱,表现为荧光强度明显降低;与前期实验结果一致,Wt-WNV在5μg/ml的浓度下具有明显增强WNV假病毒感染K562细胞的作用,而FcM-WNV在5μg/ml浓度下,能有效阻断假病毒感染K562和BHK21细胞。结论本研究建立的抗体表达系统可有效降低目标抗体的ADE效应。

关键词：中和抗体西尼罗病毒抗体依赖性增强效应

Spike蛋白介导细胞融合程度定量方法的建立及其在药物筛选中的应用

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安徽大学学报(自然科学版) 2024年

作者：刘慕仪张畅李辉龙刘家茏焉秋林杨孟欣黄麟飞万禄明钟辉魏从文军事科学院军事医学研究院生物工程研究所

新型冠状病毒S蛋白与受体ACE2结合介导细胞融合的发生，为进一步探究新冠合胞体发生、发展的规律及致病机制，明确关键蛋白靶点，筛选干预合胞体形成的药物，笔者拟构建新冠S蛋白介导的细胞融合程度的定量方法。利用pCDH-CMV-MCS-EF1-P... 详细信息

新型冠状病毒S蛋白与受体ACE2结合介导细胞融合的发生，为进一步探究新冠合胞体发生、发展的规律及致病机制，明确关键蛋白靶点，筛选干预合胞体形成的药物，笔者拟构建新冠S蛋白介导的细胞融合程度的定量方法。利用pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro、pLV-CMV-MCS-3FLAG-IRES-Bla、S蛋白基因序列、ACE2基因序列、LacZ基因序列、EcoR Ⅰ 限制性内切酶及同源重组酶构建慢病毒穿梭质粒pCDH-S、pCDH-ACE2、pLV-α与pLV-ω，利用该慢病毒质粒分别构建稳定表达S与ACE2蛋白的293FT和A549细胞系，随后利用pLV-α与pLV-ω慢病毒质粒分别感染上述稳定细胞系，构建出可以定量细胞融合程度的细胞系，即293FT-S1-56、A549-S1-56、293FT-ACE2△11-41、A549-ACE2△11-41。最后采用Western Blot蛋白免疫印迹技术鉴定上述融合定量细胞系中S与ACE2的过表达效果，并通过细胞共培养确定融合效果，用β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒定量细胞融合程度。结果显示，慢病毒载体和稳定细胞系构建成功，时间梯度、转染梯度实验显示出该系统良好的定量灵敏度，并能用于卡莫司他(Camostat mesylate)和氯硝柳胺(Niclosamide)等药物抗融合效果的定量评价。成功构建的新冠病毒Spike蛋白介导细胞融合程度定量系统，可用于不同S蛋白突变体致融合能力评价和抗融合药物筛选评价，为进一步的研究奠定了技术基础。

关键词：新型冠状病毒 Spike蛋白 ACE2受体细胞融合定量慢病毒

缺氧抑制因子ZNF92在肝癌生长和侵袭中的功能研究

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中国生物工程杂志 2024年

作者：李婷婷张婷张亚楠刘婕丁丽华叶棋浓贵州大学医学院军事科学院军事医学研究院生物工程研究所

目的：探究缺氧调控因子锌指蛋白92（Zinc finger proteins 92，ZNF92）在肝细胞癌生长和侵袭中发挥的功能及其可能的调控机制。方法：（1）利用RNA-seq筛选出缺氧抑制因子ZNF92并通过RT-qPCR和Western blot检测缺氧环境(1% O2)对ZNF92... 详细信息

目的：探究缺氧调控因子锌指蛋白92（Zinc finger proteins 92，ZNF92）在肝细胞癌生长和侵袭中发挥的功能及其可能的调控机制。方法：（1）利用RNA-seq筛选出缺氧抑制因子ZNF92并通过RT-qPCR和Western blot检测缺氧环境(1% O2)对ZNF92的mRNA表达水平和蛋白表达水平的影响。（2）利用慢病毒载体构建敲低ZNF92基因的肝癌细胞系。（3）通过CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验确定ZNF92基因对肝细胞癌HepG2细胞、SMMC7721细胞生长和侵袭的影响。（4）通过在敲低ZNF92的稳定肝癌细胞系中瞬时转染锌指E盒结合同源盒1 （Zinc Finger E-box binding homeobox，ZEB1）的siRNA ，通过Western blot实验确定ZEB1转染成功，并在该细胞系中检测ZNF92能否通过调控ZEB1的表达以调控上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）进程。（5）通过在敲低ZNF92的稳定肝癌细胞系中瞬时转染缺氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）的siRNA ，检测ZNF92是否可能通过HIF-1α影响细胞迁移和侵袭。结果：（1）缺氧抑制ZNF92的mRNA表达和蛋白表达。（2）ZNF92调控EMT的关键转录因子ZEB1的蛋白表达影响EMT进程。（3）ZNF92抑制肝癌细胞的迁移和侵袭，但不影响肝癌细胞的增殖。（4）ZNF92通过ZEB1部分调控肝癌细胞的迁移和侵袭。（5）ZNF92可能通过HIF-1α调控ZEB1以影响肝癌细胞的迁移和侵袭。结论：新的缺氧抑制因子ZNF92可能通过HIF-1α影响EMT进程，进而通过调控ZEB1影响肝癌细胞的迁移和侵袭。

关键词：肿瘤缺氧 ZNF92 HIF-1α ZEB1

用于中和抗体评价和进入抑制剂筛选的多变异株SARS-CoV-2假病毒体系构建与评估

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中国免疫学杂志 2024年第4期40卷 811-817页

作者：李静璇刘峰王莹程军平肖智勇周文霞军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

目的:构建一种高滴度SARS-CoV-2假病毒(PsV)体系,用于中和抗体体外评价与病毒进入抑制剂的筛选。方法:共转染慢病毒载体质粒psPAX2、pCDH-Luc与SARS-CoV-2 Spike(S)蛋白表达质粒,收获的假病毒上清感染ACE2-293T细胞。通过测定p24蛋白含... 详细信息

目的:构建一种高滴度SARS-CoV-2假病毒(PsV)体系,用于中和抗体体外评价与病毒进入抑制剂的筛选。方法:共转染慢病毒载体质粒psPAX2、pCDH-Luc与SARS-CoV-2 Spike(S)蛋白表达质粒,收获的假病毒上清感染ACE2-293T细胞。通过测定p24蛋白含量反映PsV滴度,Western blot检测S蛋白在PsV中的表达。利用原始株、D614G、Gamma、Delta、Omicron PsV亚型对1株S蛋白单克隆抗体的中和能力进行评价。采用两种已报道的病毒进入抑制剂氯喹、角叉菜胶检测对Omicron PsV进入的影响。结果:慢病毒载体成功掺入了S蛋白,Western blot结果显示665Y位突变的S蛋白表现出与野生型全长S蛋白(180 kD)不同的切割形式(90 kD)。三质粒体系包装出的PsV滴度更高,S蛋白表达质粒、转移质粒与包装质粒比例在1∶3∶3时为原始株PsV包装的最佳条件。该条件下包装出的5种PsV滴度均在20 ng/ml以上。PsV可有效感染ACE2-293T细胞,双报告基因GFP与萤火虫荧光素酶表达明显,化学发光数值高达106。基于原始株S蛋白的单克隆抗体可有效中和原始株PsV,对原始株PsV的中和作用是对变异株PsV的10~30倍。病毒进入抑制剂氯喹与ι-角叉菜胶可显著抑制Omicron PsV进入宿主细胞。结论:成功构建了高滴度的SARS-CoV-2 PsV进入体系,该体系以荧光素酶报告基因为指示,包含原始株和D614G、PsV Gamma、Delta、Omicron 4种变异株PsV,可有效评价中和抗体与病毒进入抑制剂活性,区分二者对不同变异株的敏感性差异对抗SARS-CoV-2药物研发有重要意义。

关键词： SARS-CoV-2 假病毒 S蛋白中和抗体病毒进入抑制剂

RNF20影响RNA病毒感染后的巨噬细胞极化

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免疫学杂志 2024年第1期40卷 11-18页

作者：杨光曹俊霞张纪岩董洁军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所北京100850

目的探究环指蛋白20(RNF20)在抗RNA病毒先天免疫中的作用。方法在293T人胚肾上皮细胞中过表达RNF20,运用双荧光素酶报告基因实验,检测仙台病毒(SeV)感染诱导的干扰素a4(Ifna4)基因启动子活化。构建Rnf20基因髓系条件性敲除小鼠模型(Rn... 详细信息

目的探究环指蛋白20(RNF20)在抗RNA病毒先天免疫中的作用。方法在293T人胚肾上皮细胞中过表达RNF20,运用双荧光素酶报告基因实验,检测仙台病毒(SeV)感染诱导的干扰素a4(Ifna4)基因启动子活化。构建Rnf20基因髓系条件性敲除小鼠模型(Rnf20F/F;Lyz2-Cre),运用流式细胞术检测Rnf20F/F;Lyz2-Cre和对照Rnf20F/F小鼠骨髓、脾脏和外周血髓系细胞亚群的比例;利用建立的小鼠模型培养骨髓源巨噬细胞(BMDMs),在SeV和水疱性口炎病毒(VSV)感染后,运用免疫印迹检测转录因子干扰素调节因子3(IRF3)和核因子-κB (NF-κB)p65亚基的磷酸化,通过ELISA检测细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-6的表达,通过高通量转录组测序分析转录组的改变,并通过LPS和IL-4分别诱导巨噬细胞M1和M2极化,证实RNF20对于转录组的影响。结果 293T细胞中RNF20过表达不影响SeV感染诱导的Ifna4基因启动子活化。Rnf20F/F;Lyz2-Cre和Rnf20F/F小鼠髓系细胞发育无明显差异,在RNA病毒感染2组小鼠的BMDMs后,IRF3、NF-κB p65的磷酸化和IFN-β、TNF-α、IL-6的表达相似,但是一些与巨噬细胞极化相关的基因表达有显著差异。RNF20的缺失有抑制巨噬细胞M1型极化、促进巨噬细胞M2型极化的趋势。结论RNF20不影响RNA病毒感染诱导的IRF3和NF-κB通路活化,但可通过影响巨噬细胞极化而参与感染后炎症的消退。

关键词：环指蛋白20 骨髓源的巨噬细胞 RNA病毒极化

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HIV耐药毒株传播的监测

中国热带医学 2024年第1期24卷 6-11页

作者：李韩平李林李敬云军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071

传播性耐药(transmitted drug resistance,TDR)指HIV耐药毒株的感染,在没有抗逆转录病毒(antiretroviral,ARV)药物暴露史的患者中检出耐药,将影响一线抗病毒治疗及暴露前后预防的效果,是实现艾滋病防治目标的重大现实威胁。耐药毒株适... 详细信息

传播性耐药(transmitted drug resistance,TDR)指HIV耐药毒株的感染,在没有抗逆转录病毒(antiretroviral,ARV)药物暴露史的患者中检出耐药,将影响一线抗病毒治疗及暴露前后预防的效果,是实现艾滋病防治目标的重大现实威胁。耐药毒株适应性的改变是决定其传播风险的根本性生物学因素,影响监测人群选择、从感染到耐药检测时间的确定及检测方法的应用;传播性耐药突变的定义和分类是获得准确监测结果的关键。本文介绍了近年来耐药毒株的适应性、监测的耐药突变、监测人群选择等方面的研究进展,提出了我国TDR监测应重点开展的工作,包括建立适合我国毒株特点的监测耐药突变、建立和使用高分辨测序方法准确鉴定混合碱基、实现TDR监测的规范化等,从而为准确获得TDR监测结果,有效遏制耐药毒株的传播提供科技支撑。

关键词：传播性耐药监测耐药突变适应性

抗新型冠状病毒分泌型IgA的构建及其经鼻给药的生物分布研究

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军事医学 2024年

作者：黄平张冠英迟象阳孙韩聪房婷于长明陈薇军事科学院军事医学研究院生物工程研究所

目的以实验室前期开发的一株IgG型抗新型冠状病毒中和抗体ZW2G10为模板，构建得到分泌型IgA(sIgA)并进行活性评价，明确sIgA经鼻给药后在ICR小鼠体内的生物分布情况。方法 sIgA经表达、纯化和鉴定后，通过ELISA和假病毒中和实验评价其... 详细信息

目的以实验室前期开发的一株IgG型抗新型冠状病毒中和抗体ZW2G10为模板，构建得到分泌型IgA(sIgA)并进行活性评价，明确sIgA经鼻给药后在ICR小鼠体内的生物分布情况。方法 sIgA经表达、纯化和鉴定后，通过ELISA和假病毒中和实验评价其结合活性和中和活性。sIgA偶联Alexa Fluor 750荧光染料，对小鼠进行滴鼻，活体成像观察sIgA的体内生物分布情况；将小鼠解剖后，观察sIgA在各器官组织的分布情况。结果与IgG型抗体相比，sIgA保留了与SARS-CoV-2 S蛋白的结合能力，其中和能力得到增强。sIgA以1 mg/kg的单次剂量滴鼻后，可在小鼠肺部留存72 h以上；在其他器官组织中，仅鼻腔和胃肠道在滴鼻后8 h内检测到抗体的存在，在心脏、肝脏、肾脏、脾、脑、膀胱和血液中均未检测到抗体存在。结论成功构建通用、高效的sIgA表达体系，明确了sIgA经鼻给药后可有效针对呼吸道和肺部，sIgA有望成为提供即时被动免疫保护的潜在药物。

关键词：新型冠状病毒分泌型IgA 抗体工程经鼻给药生物分布活体成像

产气荚膜梭菌致病机制及其治疗性抗体研究进展

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中国药理学与毒理学杂志 2024年第4期38卷 304-313页

作者：赵品楠罗龙龙军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所国家安全特需药品全国重点实验室北京100850

产气荚膜梭菌(CP)是一种常见的人兽共患病菌,广泛存在于自然界中,其分泌的外毒素给人类健康和畜牧业造成较大影响和损失。CP最主要的致病毒素为α,β,ε和τ毒素及肠毒素和坏死性肠炎B样毒素,其导致的疾病各不相同。抗生素治疗是目前治... 详细信息

产气荚膜梭菌(CP)是一种常见的人兽共患病菌,广泛存在于自然界中,其分泌的外毒素给人类健康和畜牧业造成较大影响和损失。CP最主要的致病毒素为α,β,ε和τ毒素及肠毒素和坏死性肠炎B样毒素,其导致的疾病各不相同。抗生素治疗是目前治疗CP感染的主要手段,但由于耐药性不断增长,控制CP感染愈发困难。近年来随着基因工程技术的快速发展,针对不同外毒素的疫苗或抗体有可能成为应对CP感染的新一代免疫治疗手段。研究表明,针对CPα毒素的疫苗可预防小鼠A型CP感染;抗α毒素的单链抗体、双价单链抗体和纳米抗体等,可与α毒素特异性结合,有效中和α毒素的磷脂酶C活性,在小鼠模型中对致死量α毒素攻击具有保护作用。本文简述CP的主要致病因子、致病机制和基因工程抗体治疗研究进展,为CP感染防治提供参考。

关键词：产气荚膜梭菌毒素抗体