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伪狂犬病病毒gE/gI/TK基因缺失对感染PK-15细胞的差异表达蛋白质组分析

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中国兽医学报 2023年第5期43卷 880-886页

作者：张洪亮王凤雪刁志凯李桂梅黄娟温永俊单虎青岛农业大学动物医学院山东省预防兽医学重点实验室山东青岛266109 内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为了研究伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株3个主要毒力基因gE/gI/TK缺失对感染宿主细胞后蛋白表达的影响,探究PRV与宿主细胞相互作用的分子机制,将PRV SD-2017ΔgE/gI/TK株接种PK-15细胞,运用串联质谱标签(tandem mass tags,... 详细信息

为了研究伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株3个主要毒力基因gE/gI/TK缺失对感染宿主细胞后蛋白表达的影响,探究PRV与宿主细胞相互作用的分子机制,将PRV SD-2017ΔgE/gI/TK株接种PK-15细胞,运用串联质谱标签(tandem mass tags,TMT)标记定量蛋白质组学技术,开展PRV感染细胞后差异表达蛋白分析,并通过Western blot进行数据验证。通过生物信息学分析发现,与亲本毒株PRV SD-2017感染组比较,SD-2017ΔgE/gI/TK感染组共鉴定到19个差异表达蛋白,其中7个蛋白上调,12个蛋白下调;与传统疫苗株Bartha-K/61比较,SD-2017ΔgE/gI/TK感染组共鉴定到176个差异表达蛋白,其中157个蛋白上调,19个蛋白下调。这些差异蛋白主要与紧密连接、RNA降解途径、核糖体生物发生、B细胞受体等信号通路有关,其中ATP2A1、KDM8、Eri1、XRCC6、DNM2和PYCR2等差异蛋白参与细胞凋亡、免疫反应和自噬相关功能。通过Western blot验证了MYLPF、ERI1、XRCC6和GAMT的表达情况与TMT比率一致,证明了该数据的可靠性。本研究为进一步探讨PRV变异株的致病和免疫机制奠定了理论基础。

关键词：伪狂犬病病毒变异株毒力基因 TMT 差异表达蛋白

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梅花鹿结核病间接ELISA方法的建立

黑龙江畜牧兽医 2022年第21期 69-74,79页

作者：包福祥张磊徐文博敖可心蒋强吴玘瑶张慧敏程艺白文成杜雅楠内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010018 农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010018

为了建立鹿结核病的快速检测方法,试验采用亲和层析方法纯化梅花鹿血清IgG,并免疫兔,制备兔抗梅花鹿IgG抗体,辣根过氧化物酶(HRP)进行标记,通过ELISA和Western-blot对HRP标记的兔抗梅花鹿IgG抗体进行鉴定。同时合成结核分枝杆菌38 ku基... 详细信息

为了建立鹿结核病的快速检测方法,试验采用亲和层析方法纯化梅花鹿血清IgG,并免疫兔,制备兔抗梅花鹿IgG抗体,辣根过氧化物酶(HRP)进行标记,通过ELISA和Western-blot对HRP标记的兔抗梅花鹿IgG抗体进行鉴定。同时合成结核分枝杆菌38 ku基因,并与pET-22b(+)质粒连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,诱导表达和纯化38 ku蛋白,以38 ku蛋白作为包被抗原,以HRP标记的兔抗梅花鹿IgG抗体作为二抗,建立间接ELISA方法。利用建立的间接ELISA方法对结核菌素皮肤试验检出的20份阴性血清和10份阳性血清进行验证。结果表明:对梅花鹿血清IgG进行纯化,得到大小分别约为50 ku和25 ku的蛋白质;制备的HRP标记的兔抗梅花鹿IgG抗体可特异性识别梅花鹿血清IgG,在抗体浓度稀释比例为1∶20000时仍有很好的结合效果;38 ku蛋白作为抗原的最佳包被浓度为1μg/mL,被检梅花鹿血清的最佳稀释比例为1∶100,HRP标记的兔抗梅花鹿IgG抗体的最佳稀释比例为1∶10000;间接ELISA方法能够准确区分结核菌素皮肤试验确定的阳性和阴性梅花鹿血清。说明试验建立的间接ELISA方法能够作为鹿结核病血清学快速检测的有效方法,弥补了传统方法的不足。

关键词：牛结核分枝杆菌梅花鹿 38 ku蛋白兔抗梅花鹿IgG抗体间接ELISA

AA-CYP表氧化酶代谢产物对胰岛β细胞增殖和细胞周期的影响

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中国兽医杂志 2022年第11期58卷 59-64页

作者：玉斯日古楞白兆星吴贞思陈彦汝么宏强内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010011 农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010011

花生四烯酸(AA)经过细胞色素P450(CYP)表氧化酶途径生成环氧二十碳三烯酸(EETs)和20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)。为探讨EETs和20-HETE对胰岛β细胞增殖和细胞周期的影响及其机制,本试验将培养的MIN6小鼠胰岛β细胞分为空白对照组和不... 详细信息

花生四烯酸(AA)经过细胞色素P450(CYP)表氧化酶途径生成环氧二十碳三烯酸(EETs)和20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)。为探讨EETs和20-HETE对胰岛β细胞增殖和细胞周期的影响及其机制,本试验将培养的MIN6小鼠胰岛β细胞分为空白对照组和不同浓度EETs和20-HETE处理组,分别采用CCK-8法、流式细胞术和Western blot法检测EETs和20-HETE对胰岛β细胞增殖和细胞周期的影响。CCK-8法结果显示,14,15-EET促进胰岛β细胞增殖,且在一定范围内呈时间和浓度依赖性;流式细胞术结果显示,EETs作用后G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多,从而促进胰岛β细胞的增殖;Western blot试验结果显示,11,12-EET和14,15-EET能够激活AKT磷酸化水平及PI3K活化状况。本试验结果表明,EETs和20-HETE联合使用时,对胰岛β细胞的增殖没有促进作用,但EETs能够促进小鼠胰岛β细胞增殖,其分子机制可能是EETs激活了PI3K/AKT信号转导通路。

关键词： EETs 20-HETE 胰岛β细胞细胞增殖细胞周期

兔子宫内膜上皮细胞α7-nAChR介导MAPK信号通路抑制炎性反应的机制

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中国兽医学报 2022年第3期42卷 582-586页

作者：鲍朝霞魏泓毓陈灰曹金山贺鹏飞内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

子宫内膜上皮细胞可通过自我调控降低过度炎症反应以避免细胞损伤,但调控机制尚不清楚。本研究旨在探讨α7烟碱乙酰胆碱受体(α7-nAChR)是否介导调控丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路参与细胞避免炎症过度反应。通过体外培养兔子宫内... 详细信息

子宫内膜上皮细胞可通过自我调控降低过度炎症反应以避免细胞损伤,但调控机制尚不清楚。本研究旨在探讨α7烟碱乙酰胆碱受体(α7-nAChR)是否介导调控丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路参与细胞避免炎症过度反应。通过体外培养兔子宫内膜上皮细胞,脂多糖(LPS)刺激细胞炎症反应、α7-nAChR抑制剂和激动剂处理细胞,比较α7-nAChR表达与MAPK信号通路的相关性,探讨α7-nAChR介导细胞炎症自我调控可能的机制。Western blot检测结果表明,兔子宫内膜上皮细胞在100μg/L LPS刺激12 h后,JNK1/2和P38MAPK磷酸化水平明显低于细胞空白对照组,α7-nAChR抑制剂MLA(5μmol/L)与α7-nAChR激动剂共同处理后ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK磷酸化水平上升,而α7-nAChR激动剂PNU282987(5μmol/L)和尼古丁(10 mg/L)可明显逆转MLA效应,且MAPK信号通路关键因子磷酸化与α7-nAChR表达呈部分负相关。结果表明,α7-nAChR介导调控MAPK信号通路是细胞避免炎症过度反应自我调控的潜在机制。

关键词：兔子宫内膜上皮细胞 α7-nAChR MAPK LPS 抗炎机制

捻转血矛线虫伊维菌素耐药相关长链非编码RNA及其调控功能分析

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中国农业大学学报 2023年第1期28卷 190-202页

作者：陈昕迪王腾宇刘春霞王文龙内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010010 内蒙古农业大学生命科学学院呼和浩特010010

为探究捻转血矛线虫伊维菌素耐药分子标记和关键调控元件,通过高质量的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)表达谱对捻转血矛线虫敏感与耐药虫株lncRNA的顺式调控(Cis-regulation,cis)和竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA,... 详细信息

为探究捻转血矛线虫伊维菌素耐药分子标记和关键调控元件,通过高质量的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)表达谱对捻转血矛线虫敏感与耐药虫株lncRNA的顺式调控(Cis-regulation,cis)和竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA,ceRNA)调控进行分析,筛选影响虫体伊维菌素耐药机制的微小调控分子。本研究利用RNA-seq技术对捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株进行测序,根据生物学软件预测结果,筛选出位于蛋白编码基因上下游10 kb以内的lncRNA作为顺式调控作用的元件。对差异lncRNA进行GO和KEGG富集分析,并将显著差异的lncRNA和miRNA通过Target finder和Cytoscape v3.7.1软件建立lncRNA-miRNA调控网络和可视化分析。根据miRNA调控元件对lncRNA-circRNA-miRNA-mRNA调控网络进行连通性分析,结合耐药相关信号通路的富集结果构建lncRNA-miRNA-mRNA可视化网络,同时对随机选取的10个差异lncRNA进行qRT-PCR验证。结果显示:1)捻转血矛线虫伊维菌素敏感虫株和耐药虫株中筛选出5374条转录本,共预测到858个新lncRNA中有474个靶向到mRNA,且有205个lncRNA差异表达显著。其中,102个上调、103个下调。预测结果中723个lncRNA通过顺式调控作用靶向到1320个上下游基因,共匹配1566组调控关系。2)GO和KEGG富集结果显示,大量靶基因涉及到催化活性、转运活动、代谢过程、细胞膜以及代谢途径、内吞作用、甘油磷脂代谢、转运等信号通路。3)根据lncRNA-miRNA调控网络分析显示,205个显著差异lncRNA靶向结合371个miRNA,进而组成3227组调控关系且连通性较高。4)qRT-PCR验证结果显示,10个差异表达的lncRNA与RNA-seq结果表达趋势一致。综上,该研究成功获取lncRNA表达谱并构建部分耐药相关通路的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,为进一步探究lncRNA在捻转血矛线虫伊维菌素耐药调节机制中的作用提供理论依据。

关键词：捻转血矛线虫伊维菌素耐药性长链非编码RNA 竞争性内源RNA

胆酸对代谢性炎症模型大鼠炎性因子及PPARα和LXRα表达与分布的影响

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中国兽医学报 2022年第6期42卷 1241-1248页

作者：何秀玲孙苗石琳琳李培锋关红郭凤英内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010011 内蒙古农业大学职业技术学院内蒙古包头014109

为了探讨胆酸对代谢性炎症模型大鼠炎症的影响,揭示其调控机理,从而为宠物新型抗代谢性炎症药物的研究提供试验基础,试验用饲喂高脂饲料60 d的SD大鼠建立代谢性炎症模型。将大鼠随机分为5组,即模型组,胆酸高、中、低剂量组,阴性对照组,... 详细信息

为了探讨胆酸对代谢性炎症模型大鼠炎症的影响,揭示其调控机理,从而为宠物新型抗代谢性炎症药物的研究提供试验基础,试验用饲喂高脂饲料60 d的SD大鼠建立代谢性炎症模型。将大鼠随机分为5组,即模型组,胆酸高、中、低剂量组,阴性对照组,连续灌胃给药30 d后处死大鼠,采用HE染色法,观察肝脏组织病理学变化;采用ELISA试剂盒检测单核细胞趋化因子1(MCP-1)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)的含量;采用实时荧光定量PCR法检测巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、白介素10(IL-10)、白介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF-α)表达量;采用免疫组化法检测过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)及肝X受体α(LXRα)的分布及表达。结果显示,与阴性对照组相比,模型组大鼠的肝脏组织中出现脂肪空泡以及以巨噬细胞为主的炎性细胞聚集;而给予胆酸治疗的高、中、低剂量组大鼠的肝脏细胞中细胞形态和大小均正常,且炎性细胞减少以及脂肪蓄积得到改善。与阴性对照组相比,模型组的MIP-1α及IL-8的表达量极显著升高(P<0.01),MCP-1的含量、TNF-α的表达量显著升高(P<0.05);与模型组相比,胆酸高剂量组MIP-1α、IL-10及IL-8表达量极显著降低(P<0.01),胆酸中、低剂量组的IL-10表达量显著降低(P<0.05),MIP-1α及IL-8表达量极显著降低(P<0.01),胆酸中剂量组的TNF-α的表达量显著降低(P<0.05)。PPARα及LXRα受体均分布在肝脏细胞核,模型组PPARα表达量较阴性对照组极显著下降(P<0.01),胆酸高、中剂量组PPARα表达量较模型组极显著上调(P<0.01)、低剂量组显著上调(P<0.05),胆酸高、中、低剂量组较模型组LXRα表达量极显著下调(P<0.01)。结果表明,胆酸能够通过上调PPARα、下调LXRα的表达,抑制脂肪生成,从而降低代谢性炎症模型大鼠的炎症反应。

关键词：大鼠胆酸代谢性炎症 PPARα LXRα

内蒙古地区羊源副结核分枝杆菌的分离与基因分型

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中国农业科学 2023年第6期56卷 1204-1214页

作者：赵维宏韩文雄杨波孟维康柴海亮马懿敏张占胜王利峰王艳王明圆张姗丁玉林王金玲吉林台王凤龙赵丽刘永宏内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古赛科星繁育生物技术(集团)股份有限公司鄂尔多斯市动物疫病预防控制中心

【目的】副结核病被世界动物卫生组织（OIE）列入必须报告的《OIE疫病、感染及侵染名录》，我国将其列为二类动物疫病，引起多种反刍动物慢性、增生性肠炎，感染动物通过肠道间歇性排菌而成为养殖场的持续传染源，给养殖业带来了巨大经... 详细信息

【目的】副结核病被世界动物卫生组织（OIE）列入必须报告的《OIE疫病、感染及侵染名录》，我国将其列为二类动物疫病，引起多种反刍动物慢性、增生性肠炎，感染动物通过肠道间歇性排菌而成为养殖场的持续传染源，给养殖业带来了巨大经济损失。其病原体副结核分枝杆菌（MAP）属于胞内寄生的革兰氏阳性菌，为三类动物病原微生物，包括S型（羊型，细分为Ⅰ型、Ⅲ型和骆驼型）和C型（牛型、Ⅱ型，包括B型（野牛型））。有研究表明，各亚型MAP无宿主特异性，但具有地域性，内蒙古作为国内该病的首发地区，获得并准确鉴定内蒙古地区MAP菌株亚型及基因特征，对副结核病的预防控制意义重大。【方法】对内蒙古地区来源的28份MAP阳性的羊源病料进行MAP分离培养，菌落Ziehl-Neelsen染色，染色阳性菌扩繁，提取扩繁菌液基因组DNA，进行IS900基因、IS1311基因和DMC基因扩增、测序和序列分析，同时IS1311基因PCR产物进行Hinf I和Mse I双酶切鉴定。【结果】28份样品经过7—12周培养，共有9支培养基长出菌落，菌落半透明乳白色、表面光滑。挑取单菌落进行抗酸染色，在显微镜下观察到呈不规则（单个或分枝状）、红染的细短杆菌，符合分枝杆菌的形态学特征及抗酸染色特性。9株分离菌IS900、IS1311和DMC基因PCR扩增产物均与目的基因片段预期大小一致。确定了本研究9株分离株均为MAP菌株，分别命名为MAP-NM1至MAP-NM9。DMC基因扩增产物大小为310bp，符合Ⅱ型MAP特征；IS1311基因扩增产物经HinfⅠ和MseⅠ双酶切，本研究9株MAP均得到4条目的条带，与Ⅱ型MAP一致；IS1311基因测序结果与S型、C型、印度野牛型和美国野牛型MAP代表株对照分析显示，9株MAP IS1311基因片段的64、65、68、223、236、422、527、628位碱基位点符合C型和B型MAP特征；IS900基因测序结果序列分析显示，9株MAP IS900基因片段第169位及第216位碱基分别为C（胞嘧啶）和A（腺嘌呤），符合Ⅱ型和Ⅲ型MAP特征；17株来自GenBank数据库的MAP IS900基因参考序列与本研究9株分离株IS900基因系统进化树显示，本研究9株MAP均划分于Ⅱ型MAP分支；3个基因测序结果进行Blast在线分析，与本研究所得分离株同源性最高的参考序列均为Ⅱ型MAP，且同源性均高于98%。综上所述，本研究9株MAP分离株均为Ⅱ型MAP。【结论】首次分离得到内蒙古地区羊源Ⅱ型MAP菌株。

关键词：副结核分枝杆菌分离培养亚型鉴定羊内蒙古

绵羊梅迪-维斯纳病毒CA-TM融合蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2022年第12期44卷 1290-1297页

作者：陈思旭张培史晓娜刘然刘淑英内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018 内蒙古自治区基础兽医学重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为建立一种快速、准确的梅迪-维斯纳病毒(MVV)抗体检测方法,本研究利用DNAStar生物学软件对MVV衣壳蛋白(CA)和MVV跨膜蛋白(TM)的抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE PCR)获得CA-TM融合基因,构建表达质粒p Easy-E1-CA-TM,将其转化大肠杆菌... 详细信息

为建立一种快速、准确的梅迪-维斯纳病毒(MVV)抗体检测方法,本研究利用DNAStar生物学软件对MVV衣壳蛋白(CA)和MVV跨膜蛋白(TM)的抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE PCR)获得CA-TM融合基因,构建表达质粒p Easy-E1-CA-TM,将其转化大肠杆菌BL21后诱导蛋白表达并纯化,经SDS-PAGE检测结果显示,得到重组CA-TM蛋白(rCA-TM),r CA-TM以包涵体形式表达。以获得的rCA-TM作为包被抗原,采用方阵法优化各反应条件,建立了MVV间接ELISA检测方法。利用该方法检测羊临床常见病原阳性血清,结果显示,除MVV阳性血清以外,口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊肺炎支原体等绵羊临床常见病原的阳性血清均为阴性,特异性较强,且该方法能识别感染MVV病畜体内产生的CA蛋白和TM蛋白抗体。将MVV阳性血清2倍倍比稀释(1:500~1:32 000)后,分别利用建立的MVV间接ELISA方法及商品化MVV抗体ELISA试剂盒检测,结果显示商品化MVV抗体ELISA试剂盒最低可检测出1:40 00倍稀释的阳性血清,而本研究建立的间接ELISA方法最低可检测出1:16 000倍稀释的阳性血清,敏感性较高。重复性试验结果显示,该方法批内、批间试验的变异系数分别为3.6%~6.9%、2.3%~8.5%,均小于10%,重复性较好。利用本实验建立的MVV间接ELISA方法和商品化MVV抗体ELISA试剂盒对69份绵羊临床样品检测,结果显示,本实验建立的ELISA方法检测出31份阳性样品,38份阴性样品;商品化MVV抗体ELISA检测试剂盒检出37份阳性样品,32份阴性样品。二者的阳性符合率为83.7%,阴性符合率为100%,总符合率为91.3%。本研究首次基于MVV rCA-TM建立了MVV间接ELISA检测方法,且该方法能够分别识别CA蛋白抗体和TM蛋白抗体,不仅减少了因为血清转换而导致血清抗体检测不准确的影响,还扩大了检测范围,为内蒙地区绵羊梅迪-维斯纳病的诊断及净化提供了检测手段。

关键词：梅迪-维斯纳病毒间接ELISA方法原核表达融合蛋白

捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药相关lncRNA的转录组学测序与分析

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生物工程学报 2020年第2期36卷 250-258页

作者：赵学亮王文龙呼和巴特尔内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室

分析捻转血矛线虫敏感株和耐药株中长链非编码RNA (Long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,探讨lncRNA与捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制的关联性,为捻转血矛线虫耐药机理提供依据。文中对捻转血矛线虫敏感株和耐药株进行cDNA测序文库构建... 详细信息

分析捻转血矛线虫敏感株和耐药株中长链非编码RNA (Long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,探讨lncRNA与捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制的关联性,为捻转血矛线虫耐药机理提供依据。文中对捻转血矛线虫敏感株和耐药株进行cDNA测序文库构建,使用Illumina HiSeq 4000平台进行双端测序,筛选出差异的lncRNA,基于顺式调控(cis)和反式调控(trans)对差异显著的lncRNA进行靶基因预测,并对靶基因进行过Gene Ontology (GO)功能注释和KEGG Pathway富集分析,利用FPKM法估计lncRNA和mRNA的表达水平。结果表明,敏感株和耐药株候选lncRNA分别为6 377和6 356个,两个文库中筛选出168个差异显著的lncRNA,其中在敏感株中表达上调有92个,表达下调76个。筛选得到的差异显著lncRNA候选靶基因416个,这些基因共注释到641条GO terms和92条信号通路;其中富集到耐药性相关的通路有药物代谢-其他酶、药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对异生素的代谢等。综上表明,部分lncRNA介导的靶基因与捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药性相关,lncRNA在捻转血矛线虫耐药性中具有潜在的重要的调节作用。探究了对于敏感虫株和耐药虫株中lncRNA的表达谱,发现了敏感虫株和耐药虫株中差异表达的lncRNA,有助于找出捻转血矛线虫如何抵抗丙硫咪唑的发生机制,为探讨捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药机制提供科学的依据。

关键词：捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药性转录组长链非编码RNA