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重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗病毒滴度荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

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中国生物制品学杂志 2024年第6期37卷 745-750页

作者：杜天飞容新宗杨盛理张勇侠高雅丽武志强李春阳刘兰军成都生物制品研究所有限责任公司四川省疫苗工程技术研究中心四川成都610023

目的建立检测重组麻疹病毒载体严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗病毒滴度的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用。方法以重组质粒pUC57-S351为模板,扩增SARS-CoV-2 ... 详细信息

目的建立检测重组麻疹病毒载体严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗病毒滴度的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用。方法以重组质粒pUC57-S351为模板,扩增SARS-CoV-2 S基因,优化引物浓度,建立qPCR检测方法。对该方法的专属性、重复性进行验证,确定线性范围及检测限。应用建立的qPCR法对生物反应器连续培养感染后1~12 d的重组病毒S基因拷贝数进行检测。结果选择引物浓度为0.20μmol/L建立qPCR方法。该方法能特异性检测SARS-CoV-2 S基因拷贝数;模板浓度在2×10^(2)~2×10^(8)copies/μL之间,线性关系良好(R^(2)=0.995),检测下限为2×10^(2)copies/μL;6次重复检测重组病毒S基因拷贝数的变异系数(coefficient of variation,CV)为2.64%。应用建立的qPCR法检测生物反应器连续培养感染后1~12 d的重组病毒S基因拷贝数的结果与细胞病变法检测结果基本一致。结论建立的qPCR法专属性和重复性良好,可用于重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗病毒滴度检测。

关键词：荧光定量PCR 重组麻疹病毒载体SARS-CoV-2疫苗 S基因病毒滴度

高表达H2型人类组织血型抗原HEK-293T细胞系的构建及其应用

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微生物学免疫学进展 2024年第4期52卷 9-15页

作者：秦海艳谢忆张巧玲马素娟李晨杨林鹏付艳丽李奇蒙杨俊杰兰州生物制品研究所有限责任公司、甘肃省疫苗技术创新中心甘肃兰州730046

目的通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶2(fucosyltransferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系。方法构建FUT2慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2细胞系。PCR鉴定FUT2基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性。结果成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2细胞系,PCR验证显示,FUT2基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中。HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA水平提高了330倍。99.9%的HEK-293T/FUT2细胞表达H2型人类组织血型抗原。GI.1重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2细胞产生很好的结合反应,EC50为2.007μg/mL。结论建立了H2型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法。

关键词：人类组织血型抗原人胚肾293T细胞(HEK-293T细胞) 诺如病毒 α-1 2岩藻糖转移酶结合活性

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人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的制备与质量评价

微生物学免疫学进展 2024年第3期52卷 45-51页

作者：郭玉婷付艳丽孔涛马亚茹梁凌宇陈勇兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗技术创新中心甘肃兰州730046

目的建立一种从废弃的Cohn法组份IV沉淀中提取制备人抗凝血酶Ⅲ浓缩制剂的工艺,并通过与国外已上市人抗凝血酶-Ⅲ产品进行质量及相关药代动力学参数对比,评价制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的质量情况。方法对制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制... 详细信息

目的建立一种从废弃的Cohn法组份IV沉淀中提取制备人抗凝血酶Ⅲ浓缩制剂的工艺,并通过与国外已上市人抗凝血酶-Ⅲ产品进行质量及相关药代动力学参数对比,评价制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的质量情况。方法对制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂和国外已上市人抗凝血酶-Ⅲ产品ThrombateⅢ^(®)进行活性、纯度、肝素亲和力等关键质量属性的检测对比,并进行小鼠体内消除半衰期对比研究,评价2种制品的质量相似性。结果制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂活性为56.7 IU/mL,ThrombateⅢ^(®)活性为53.4 IU/mL;制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的纯度为99.1%,ThrombateⅢ^(®)的纯度为97.3%;制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂中具肝素亲和活性的分子约为89.1%,ThrombateⅢ^(®)分子中具肝素亲和活性的分子约为84.6%;制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的比活为10.98 IU/mg,ThrombateⅢ^(®)的比活为9.98 IU/mg;制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂在小鼠体内的消除半衰期为5.19 h,ThrombateⅢ^(®)在小鼠体内的消除半衰期为4.85 h;经t检验分析,制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂中的hAT-Ⅲ与ThrombateⅢ^(®)中的hAT-Ⅲ在小鼠血清中的药物消除速率差异无统计学意义(P=0.2531)。结论与国外已上市同类产品ThrombateⅢ^(®)相比,制备的人抗凝血酶-Ⅲ浓缩制剂的各项关键质量指标均非劣于ThrombateⅢ^(®)说明本文所述人抗凝血酶-Ⅲ的制备工艺能有效从废弃的Cohn法组份IV沉淀中提取高质量的人抗凝血酶-Ⅲ制剂,能有效提高人血浆综合利用效率。

关键词：人抗凝血酶-Ⅲ 质量控制半衰期分离和纯化血浆

呼吸道合胞病毒融合前F蛋白三聚体定量检测方法的建立及应用

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微生物学免疫学进展 2024年第4期52卷 16-22页

作者：唐悦王婉侯风萍寇桂英陈玥如郭岚李奇蒙傅生芳李雄雄兰州生物制品研究所有限责任公司、甘肃省疫苗技术创新中心甘肃兰州730046

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用。方法选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horserad... 详细信息

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用。方法选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的RSV pre-F特异性抗体D25作为检测抗体,通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度,对封闭液进行优化,建立双抗体夹心ELISA。分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证,并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测。结果该方法确定的捕获抗体AM14包被浓度为1.25μg/mL,检测抗体D25浓度为0.50μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)。方法验证结果显示,线性范围为1.50~24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好,仅与RSV pre-F三聚体反应;准确度和精密度验证结果显示回收率为87.41%~117.03%,变异系数(coefficient of variation,CV)为5.47%~14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时,回收率在87.65%~106.45%,证明该方法耐用性优良;该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测。结论成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法,该方法专属性强,准确度、精密度、耐用性均优良,可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测,无需Octet或者Biacore等精密仪器,具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点。

关键词：呼吸道合胞病毒融合前F蛋白定量酶联免疫吸附试验三聚体构象

3种抗人T淋巴细胞免疫球蛋白淋巴细胞毒效价检测方法比较

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国际生物制品学杂志 2024年第4期47卷 217-222页

作者：杜天飞于晓萍李春阳刘兰军成都生物制品研究所有限责任公司重组蛋白质药物及新疫苗研究室四川省疫苗工程技术研究中心成都610023

目的通过比较3种淋巴细胞毒效价检测方法测定抗人T淋巴细胞免疫球蛋白免疫血清及原液样品的效价结果, 阐明3种检测方法的相关性。方法采用中国药典2020年版三部淋巴细胞毒效价检测方法、基于人外周血单个核细胞的淋巴细胞毒流式检测方... 详细信息

目的通过比较3种淋巴细胞毒效价检测方法测定抗人T淋巴细胞免疫球蛋白免疫血清及原液样品的效价结果, 阐明3种检测方法的相关性。方法采用中国药典2020年版三部淋巴细胞毒效价检测方法、基于人外周血单个核细胞的淋巴细胞毒流式检测方法及基于人白血病T细胞株(Jurkat细胞)的淋巴细胞毒流式检测方法测定3批次免疫血清及3批次原液的效价。免疫血清稀释128、256及512倍进行效价检测, 判定效价;原液稀释8~2 048倍进行检测, 计算半数效应浓度。结果中国药典方法与基于人外周血单个核细胞流式法检测3批次免疫血清的效价均为1∶512;基于Jurkat细胞流式法检测001批次免疫血清的效价为1∶512, 002与003批次免疫血清的效价为1∶256。3种方法测定3批次原液的效价结果与阳性对照Grafalon的活性水平相当, 不同方法检测的效价趋势基本一致。结论虽然3种方法测定免疫血清与原液的效价结果趋势基本一致, 但淋巴细胞毒流式检测方法操作更便捷, 且可定量测定半数效应浓度值。

关键词：抗人T淋巴细胞免疫球蛋白流式细胞术淋巴细胞毒效价

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乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴定方法专属性研究

国际生物制品学杂志 2024年第2期47卷 63-66页

作者：廖海棠马玉晓彭维江虹霞曾兰义罗明杰吕冰凌刘菊成都生物制品研究所有限责任公司质量检定室成都610023 四川省疫苗工程技术研究中心成都610023

目的研究乙型脑炎(乙脑)减毒活疫苗冻干稳定剂中各组分(蔗糖乳糖溶液、尿素、人血白蛋白、明胶)对病毒滴定方法(噬斑法)的影响,进一步确定该方法的专属性。方法采用噬斑法对不同浓度的乙脑疫苗稳定剂各组分分别进行滴定,考察各组分对BH... 详细信息

目的研究乙型脑炎(乙脑)减毒活疫苗冻干稳定剂中各组分(蔗糖乳糖溶液、尿素、人血白蛋白、明胶)对病毒滴定方法(噬斑法)的影响,进一步确定该方法的专属性。方法采用噬斑法对不同浓度的乙脑疫苗稳定剂各组分分别进行滴定,考察各组分对BHK21细胞的影响。取3批乙脑疫苗原液与稳定剂各组分分别混合为实验组,与病毒稀释液混合为对照组,采用噬斑法检测实验组与对照组的病毒滴度并进行统计分析。结果稳定剂中各组分对BHK21细胞无影响。将乙脑病毒完全中和后,细胞板上没有噬斑形成。实验组与对照组病毒滴度差异无统计学意义,t值分别为蔗糖乳糖溶液0.24,明胶-0.09,尿素-0.15,人血白蛋白-0.05,P值均大于0.05。结论噬斑法检测乙脑病毒的专属性良好,可用于乙脑疫苗的病毒滴度检测。

关键词：日本脑炎疫苗滴定分析法噬斑法专属性

重组戊型肝炎疫苗宿主细胞残余DNA荧光染色法检测方法的建立和验证

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国际生物制品学杂志 2024年第4期47卷 203-206页

作者：张巧玲张志豪秦海艳杨林鹏杨俊杰兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室兰州730030 兰州生物制品研究所有限责任公司中试研究室兰州730030

目的建立检测重组戊型肝炎疫苗宿主DNA残留量的荧光染色法,并进行方法验证。方法采用λDNA作为标准品建立标准曲线,重组戊型肝炎疫苗纯化后原液作为样品,进行线性、准确度以及精密度的验证。结果该方法在1.250~80.000 ng/ml范围内有良... 详细信息

目的建立检测重组戊型肝炎疫苗宿主DNA残留量的荧光染色法,并进行方法验证。方法采用λDNA作为标准品建立标准曲线,重组戊型肝炎疫苗纯化后原液作为样品,进行线性、准确度以及精密度的验证。结果该方法在1.250~80.000 ng/ml范围内有良好的线性,决定系数大于0.99;准确性验证中DNA残留量加标回收率在90.00%~110.00%之间,且加标回收率相对标准偏差均小于15.00%。重复性验证和中间精密度验证的相对标准偏差分别为6.62%和10.30%,均小于15.00%。结论该方法快速、灵敏、准确,可以检测重组戊型肝炎疫苗宿主DNA残留量。

关键词：重组戊型肝炎疫苗荧光染色法残余DNA

人血清抗肺炎球菌荚膜多糖的血清特异性IgG抗体ELISA检测方法的适用性验证

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微生物学免疫学进展 2024年第1期52卷 31-39页

作者：石刚杨田瑶任珍芸李阿妮王欣茹郭丽娜刘文宾罗树权李红叶强中国食品药品检定研究院细菌多糖和结合疫苗室、国家卫健委生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629 兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室、甘肃省疫苗工程技术研究中心甘肃兰州730046

目的验证ELISA中使用国产酶标板和国产细胞壁C多糖(cell wall polysaccharides, CWPS)替代现用的进口酶标板(Greiner 655080)和丹麦国家血清研究所(Statens Serum Institut, SSI)的CWPS,用于检测肺炎球菌疫苗免疫人血清中抗荚膜多糖Ig... 详细信息

目的验证ELISA中使用国产酶标板和国产细胞壁C多糖(cell wall polysaccharides, CWPS)替代现用的进口酶标板(Greiner 655080)和丹麦国家血清研究所(Statens Serum Institut, SSI)的CWPS,用于检测肺炎球菌疫苗免疫人血清中抗荚膜多糖IgG抗体的可行性和适用性。方法执行PnPS ELISA,以现用SSI的CWPS和Greiner 655080酶标板为对照,分别用国产CWPS和国产酶标板(96BTA),检测相同样品中24个肺炎球菌血清型别的抗荚膜多糖IgG抗体,对检测结果进行系统分析。结果 (1)国产酶标板的适用性验证结果:国产及进口酶标板检测质控血清09CS的24个血清型的荚膜多糖IgG抗体含量完全一致,林氏一致性相关系数(lin's concordance correlation coefficient,r_(c))为0.990 3;20份实验室内质控血清的结果为高度一致,r_(c)为0.958 0;24个血清型的样本最低检测限(lower limit of detection, LLQ)在0.008~0.072μg/mL,进口酶标板为0.010~0.079μg/mL之间。(2) CWPS的适用性验证结果:国产CWPS的生化检测结果和~1H核磁共振波谱图(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)与现用SSI的CWPS基本一致;国产和进口CWPS吸收后检测质控血清09CS的24个肺炎球菌血清型特异性荚膜多糖抗体值结果完全一致,r_(c)为0.999 0;国产及进口CWPS检测所选10对免前及免后血清的检测结果为高度一致,免前血清的r_(c)为0.953 0,免后血清的r_(c)为0.972 0。结论经验证,国产CWPS可替代进口CWPS,国产酶标板可替代进口酶标板,用于肺炎球菌疫苗临床血清特异性抗体含量的检测。

关键词：肺炎链球菌细胞壁多糖 96孔酶标板酶联免疫吸附试验适用性验证

动态浊度法与热原检查法检测A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗的比较

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中国科技期刊数据库医药 2024年第3期 0165-0170页

作者：陈鑫朱海王晶祁茗雪冯德杰兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃兰州730046

研究A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗生产过程中热原安全性问题,对动态浊度法与热原检查法检测A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗进行比较。方法根据《中华人民共和国药典》2020版(三部) 规定的方法,随机抽取10批次A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗为研究样... 详细信息

研究A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗生产过程中热原安全性问题,对动态浊度法与热原检查法检测A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗进行比较。方法根据《中华人民共和国药典》2020版(三部) 规定的方法,随机抽取10批次A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗为研究样品,分别采用细菌内毒素动态浊度法和热原检查家兔法进行检定。结果 10批A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗热原检查法热原检查均符合规定,动态浊度法能定量检测A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中细菌内毒素定量检测结果与热原检查家兔法一致。结论细菌内毒素动态浊度法能定量检测A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中细菌内毒素的含量,在快速检测中优于热原检查法,基于上述的比较研究,表明动态浊度法可作为A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗生产过程控制中热原检查的补充方法,更好地控制产品质量。

关键词： A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗动态浊度法细菌内毒素家兔法热原