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基于全质粒的SA11轮状病毒反向遗传学系统构建

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微生物学免疫学进展 2024年第5期 11-18页

作者：王云瑾程亚慧陈汉泉寇桂英侯风萍包红胡广宏李晓萌李雄雄兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室甘肃省疫苗技术创新中心

目的建立基于全质粒的轮状病毒反向遗传学系统，为轮状病毒致病机制研究、疫苗研发提供更为快速有效的手段。方法基于11和14质粒系统进行毒株rSA11和携带外源荧光标记基因的rSA11-NSP3-UnaG毒株拯救，通过酶联免疫吸附测定（enzyme-li... 详细信息

目的建立基于全质粒的轮状病毒反向遗传学系统，为轮状病毒致病机制研究、疫苗研发提供更为快速有效的手段。方法基于11和14质粒系统进行毒株rSA11和携带外源荧光标记基因的rSA11-NSP3-UnaG毒株拯救，通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent serologic assay, ELISA）、荧光显微镜、RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳（poly-acrylamide gel electrophoresis, PAGE）、蚀斑和半数细胞培养感染剂量(50%cell culture infectious dose, CCID50)结合ELISA(CCID50combined ELISA,CCIDEA50)方法对拯救毒株进行鉴定、传代稳定性及增殖动力学研究。结果拯救病毒ELISA结果均为阳性。荧光显微镜观察发现，rSA11无绿色荧光，rSA11-NSP3-UnaG可见大量绿色荧光富集。PAGE结果显示，rSA11电泳带型与野生型SA11（wtSA11）电泳带型一致。相比于wtSA11和rSA11,rSA11-NSP3-UnaG毒株NSP3基因片段发生迁移，片段大小与预期一致。此外，rSA11和rSA11-NSP3-UnaG在MA104和Vero细胞中连续传代，其电泳带型均保持一致。蚀斑结果显示，相比于rSA11,rSA11-NSP3-UnaG蚀斑形态略小。CCIDEA50检测结果显示，P1～P10代rSA11和rSA11-NSP3-UnaG在MA104和Vero细胞中的病毒滴度均≥6.5 lgCCIDEA50/mL,最高可达8.5 lgCCIDEA50/mL。病毒增殖动力学分析显示，不同MOI的rSA11在MA104细胞中的增殖趋势与wtSA11基本趋于一致，但在Vero细胞中其增殖趋势较wtSA11迟缓，且MOI=0.01与MOI=0.1的rSA11在Vero细胞中的增殖趋势一致。结论 11和14质粒系统均可以成功拯救rSA11和rSA11-NSP3-UnaG,拯救毒株在MA104和Vero细胞中可以有效增殖，传代稳定性良好。

关键词：轮状病毒反向遗传学基因重配

吐温80对戊型肝炎病毒病毒样颗粒稳定性的研究

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微生物学免疫学进展 2024年第5期 32-38页

作者：张巧玲杨林鹏张志豪秦海艳付艳丽杨俊杰兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室甘肃省疫苗技术创新中心

目的探讨不同浓度吐温80对戊型肝炎病毒(hepatitis E virus)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)稳定性的影响以及对比吐温80与海藻糖及山梨醇对VLP的稳定性作用，为VLP疫苗制剂优化提供一定的参考。方法验证4种不同浓度(0.002 5%、... 详细信息

目的探讨不同浓度吐温80对戊型肝炎病毒(hepatitis E virus)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)稳定性的影响以及对比吐温80与海藻糖及山梨醇对VLP的稳定性作用，为VLP疫苗制剂优化提供一定的参考。方法验证4种不同浓度(0.002 5%、0.005 0%、0.010 0%和0.020 0%)的吐温80对戊型肝炎病毒VLP稳定性的作用，在-80℃将戊型肝炎病毒VLP反复冻融3次，检测不同试验组VLP粒径大小、蛋白纯度及相对含量。在筛选出适宜浓度的吐温80后，选择15.000 0%海藻糖及10.000 0%山梨醇，分别对比3种不同类型的保护剂对戊型肝炎病毒VLP的保护作用。结果在不同浓度吐温80冻融试验中，对照组(冻融后)VLP平均粒径大小均远超出质量标准，而4种浓度的吐温80组VLP粒径大小均在质量标准范围内。经过方差分析，对照组(冻融前)与试验组各组峰面积差异无统计学意义(P=0.053 1,P>0.05),对照组(冻融后)与试验组各组峰面积之间差异有统计学意义(P=0.005 3,P0.05)。另外，电镜下可以观察到在0.010 0%吐温80组冻融后大部分VLP形态均一，未聚集成团。结论 0.010 0%吐温80对戊型肝炎病毒VLP具有良好的稳定作用。

关键词：戊型肝炎病毒病毒样颗粒吐温80 海藻糖山梨醇稳定性

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红前期疟疾疫苗研发进展

微生物学免疫学进展 2024年第5期 71-76页

作者：冯晓琳陈勇兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室甘肃省疫苗技术创新中心

疟疾(malaria)是疟原虫感染所致的传染病，主要流行于热带和亚热带地区。疟疾严重危害了人类的生命安全，亟需有效的疟疾疫苗作为防控手段。目前红前期多种候选疫苗已被探索，包括亚单位疫苗、全孢子体疫苗、病毒载体疫苗和mRNA疫苗。... 详细信息

疟疾(malaria)是疟原虫感染所致的传染病，主要流行于热带和亚热带地区。疟疾严重危害了人类的生命安全，亟需有效的疟疾疫苗作为防控手段。目前红前期多种候选疫苗已被探索，包括亚单位疫苗、全孢子体疫苗、病毒载体疫苗和mRNA疫苗。其中以恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)红前期环子孢子蛋白(circumsporozoite protein, CSP)为抗原研制的亚单位疫苗RTS,S/AS01和R21/Matrix-M已获WHO批准。这两款疫苗接种后均可降低疟疾的患病率和死亡率。同时，基于mRNA的新型冠状病毒疫苗已取得成功，这重新引起了研究者对mRNA疫苗平台的兴趣。mRNA疟疾疫苗成为疟疾疫苗开发的新途径。现就CSP的生物学特性及红前期疟疾疫苗研究现状作一概述。

关键词：疟疾疫苗红前期疫苗环子孢子蛋白亚单位疫苗全孢子体疫苗病毒载体疫苗 mRNA疫苗

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新型人用狂犬病疫苗研发与保护效果

微生物学免疫学进展 2024年第4期52卷 82-87页

作者：张晓昕(综述) 李薇(审校) 兰州生物制品研究所有限责任公司中试研究室甘肃省疫苗技术创新中心甘肃兰州730046

狂犬病(rabies)是由狂犬病毒(rabies virus)感染引起的一种严重威胁人类安全的急性传染病。虽然狂犬病灭活疫苗能够有效预防狂犬病毒感染,但存在接种剂次多、成本高等缺点,亟需研发有效、价格适中的新型狂犬病疫苗。近年,病毒载体疫苗... 详细信息

狂犬病(rabies)是由狂犬病毒(rabies virus)感染引起的一种严重威胁人类安全的急性传染病。虽然狂犬病灭活疫苗能够有效预防狂犬病毒感染,但存在接种剂次多、成本高等缺点,亟需研发有效、价格适中的新型狂犬病疫苗。近年,病毒载体疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、佐剂疫苗和嵌合疫苗等新型狂犬病疫苗被研究用于防治狂犬病毒感染。现就新型狂犬病疫苗的研发情况、保护效果及其在预防狂犬病病毒感染等方面作一概述。

关键词：狂犬病疫苗病毒性疫苗病毒载体疫苗亚单位疫苗 DNA疫苗 mRNA疫苗佐剂

应用QbD原则优化GO-SSD发酵罐混合清洗工艺的开发

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甘肃科技 2024年第9期40卷 18-24页

作者：郭济中徐世友杨林鹏张旭东杨俊杰李薇周晖国兰州生物制品研究所有限责任公司中试研究室第四研究室/甘肃省疫苗技术创新中心甘肃兰州730046

文章开发了一种适用于发酵罐混合模式的清洗方法。采用组正交超饱和设计方法,以发酵罐排水口在线电导率值、发酵罐淋洗水澄明度和发酵罐内部洁净程度作为评价指标。通过标准最小二乘法和蒙特卡洛模拟获得发酵罐混合模式清洗工艺参数和... 详细信息

文章开发了一种适用于发酵罐混合模式的清洗方法。采用组正交超饱和设计方法,以发酵罐排水口在线电导率值、发酵罐淋洗水澄明度和发酵罐内部洁净程度作为评价指标。通过标准最小二乘法和蒙特卡洛模拟获得发酵罐混合模式清洗工艺参数和设计空间,采用获得的设计空间的最劣工艺参数进行连续5次验证试验来验证清洗方法的有效性。最终获得清洗工艺设计空间如下:纯化水清洗循环次数2~3次,注射用水清洗循环次数2~3次,注射用水清洗吹扫时间3~5 min,其余清洗工艺参数采用组正交超饱和设计低水平条件。进行5批混合模式清洗验证,结果显示评价指标均符合标准,证明研究建立的清洗方法对发酵罐污染物清洗结果有效,且评价指标结果较优。

关键词：组正交超饱和设计混合模式清洗质量源于设计

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Al(OH)_(3)和CpG寡核苷酸免疫佐剂对结核分枝杆菌Ag85B蛋白免疫原性的影响

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微生物学免疫学进展 2024年第3期52卷 10-16页

作者：张光磊王玉冲吴智远李朋伟张婷婷李睿李奇蒙王婷王彩霞焦磊兰州生物制品研究所有限责任公司第三研究室甘肃省疫苗技术创新中心甘肃兰州730046

目的探究Al(OH)_(3)和CpG寡核苷酸免疫佐剂对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85B蛋白免疫原性的影响。方法将Mtb Ag85B蛋白在大肠埃希菌中进行重组表达,经亲和层析纯化后分别与Al(OH)_(3)、CpG寡核苷酸(简称CpG)及Al(... 详细信息

目的探究Al(OH)_(3)和CpG寡核苷酸免疫佐剂对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Ag85B蛋白免疫原性的影响。方法将Mtb Ag85B蛋白在大肠埃希菌中进行重组表达,经亲和层析纯化后分别与Al(OH)_(3)、CpG寡核苷酸(简称CpG)及Al(OH)_(3)和CpG组成的复合佐剂[Al(OH)_(3)+CpG]配伍,经皮下免疫BALB/c小鼠,初免后28 d加强免疫1次,分别于初免后14、42和56 d采集免疫血清,采用ELISA检测血清中Ag85B特异性IgG、lgG1、IgG2a和IgG2b水平;初免后42 d,每组取4只小鼠无菌分离脾淋巴细胞,利用酶联免疫斑点检测各组细胞中分泌γ干扰素和白介素4的淋巴细胞数量,采用流式细胞术检测各组细胞中CD4^(+)T和CD8^(+)T淋巴细胞的比例。结果 1.5μg或4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫后均诱导了高水平的Ag85B特异性IgG,免疫效果优于该蛋白与2种佐剂单独配伍组。1.5μg或4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫血清中IgG亚型为IgG1、IgG2a和IgG2b混合型,其中IgG2a和IgG2b水平均高于Al(OH)_(3)配伍免疫组,差异均有统计学意义(P均<0.001)。酶联免疫斑点检测显示,4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫小鼠的脾淋巴细胞中分泌γ干扰素和白介素4的淋巴细胞数量均高于Al(OH)_(3)配伍免疫组,差异均有统计学意义(P均<0.05);流式细胞术检测显示,1.5μg或4.5μg Ag85B重组蛋白与Al(OH)_(3)+CpG配伍免疫小鼠的T淋巴细胞中CD4^(+)T淋巴细胞的占比均高于Al(OH)_(3)配伍免疫组。结论 Al(OH)_(3)和CpG联合使用可能协同增强Ag85B重组蛋白的免疫原性。

关键词：佐剂 Al(OH)_(3) CpG寡核苷酸结核分枝杆菌 Ag85B重组蛋白免疫原性 IgG 淋巴细胞

体外转录mRNA系统的建立及其在呼吸道合胞病毒疫苗中的应用

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微生物学免疫学进展 2024年第3期52卷 17-25页

作者：侯风萍程亚慧唐悦吴爱莉王云瑾李晓萌王剑李雄雄兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室甘肃省疫苗技术创新中心甘肃兰州730046

目的建立mRNA的体外转录系统,并用于评价呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)mRNA疫苗的免疫效果。方法以增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为模式蛋白,将EGFP基因分别克隆入pcDNA3.1(+)和pmRV载体中,通过体外转录合成EGFP mRNA,以验证载体及mRNA框架结构的正确性;然后将RSV融合前F蛋白(RSV preF)序列构建于经验证的载体,体外转录合成RSV preF mRNA;转染细胞后,通过荧光显微镜、流式细胞术、免疫荧光和Western blot等方法验证蛋白表达;进一步通过微流控技术用脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)包封体外转录合成的mRNA,经过粒径和多分散性指数检测后进行小鼠免疫和评价。结果经过验证发现,pcDNA3.1(+)的框架结构更适合mRNA;EGFP mRNA转染HEK 293T细胞24 h后,体外转染效率>90%;免疫荧光和Western blot等方法验证RSV mRNA能够在24 h内表达preF;包封后的RSV mRNA疫苗免疫小鼠,血清抗体滴度与RSV preF蛋白免疫抗体滴度相近(P>0.05),细胞因子IFN-γ和IL-4均有一定程度的上调。结论建立了正确表达目的蛋白的mRNA体外转录系统,以此为基础的RSV mRNA疫苗在小鼠体内可诱导强的免疫应答,为潜在的RSV mRNA候选疫苗奠定了基础。

关键词： mRNA疫苗体外转录系统呼吸道合胞病毒脂质体纳米颗粒免疫应答

不同类型生物反应器培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A10型的比较

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中国生物制品学杂志 2024年第10期 1153-1160+1166页

作者：万鑫蔡潜叶童肖奥戴旱雨游磊孟胜利郭靖王泽鋆申硕武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室国家联合疫苗工程技术研究中心湖北省疫苗技术创新中心

目的比较摇床生物反应器、篮式生物反应器和NBS生物反应器培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A10型（Coxsackievirus A10,CV-A10）的效果。方法分别采用2 L摇床生物反应器（预辐照片状载体袋）、15 L篮式生物反应器（片状载体）和40 L NBS生... 详细信息

目的比较摇床生物反应器、篮式生物反应器和NBS生物反应器培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A10型（Coxsackievirus A10,CV-A10）的效果。方法分别采用2 L摇床生物反应器（预辐照片状载体袋）、15 L篮式生物反应器（片状载体）和40 L NBS生物反应器（Cytodex 1球状载体）培养Vero细胞，制备CV-A10，比较不同类型生物反应器细胞贴壁效率、营养代谢物质含量、细胞生长特性以及病毒滴度和抗原含量差异。将2 L摇床生物反应器放大至50 L培养Vero细胞和CV-A10，比较不同规模摇床生物反应器制备的病毒滴度和抗原含量。结果 Vero细胞在片状载体上的贴壁效率远高于球状载体，不同类型生物反应器中葡萄糖和乳酸含量变化曲线保持一致；不同类型生物反应器均可用于Vero细胞的高密度培养，相比于使用球状载体培养的NBS生物反应器，使用片状载体培养的摇床和篮式生物反应器可获得更高的细胞密度；不同类型生物反应器均可用于CV-A10的高效制备，且制备的CV-A10抗原含量和病毒滴度无差异；50 L摇床生物反应器可成功放大培养Vero细胞和CV-A10，不同规模摇床生物反应器制备的病毒滴度和抗原含量无差异。结论摇床生物反应器、篮式生物反应器和NBS生物反应器均可用于Vero细胞的稳定培养和CV-A10的高效制备。

关键词：摇床生物反应器篮式生物反应器 NBS生物反应器片状载体球状载体 Vero细胞柯萨奇病毒A10型

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人用疫苗佐剂研究进展

微生物学免疫学进展 2024年第4期52卷 74-81页

作者：高然(综述) 傅生芳(审校) 兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室甘肃省疫苗技术创新中心甘肃兰州730046

佐剂(adjuvant)是增强和调节疫苗抗原免疫反应的增强剂,与抗原一起使用能使机体产生更强或更平衡的免疫反应。近年来,重组蛋白疫苗、核酸疫苗等新型疫苗是疫苗的研发热点,尤其是重组蛋白疫苗,通常存在免疫原性弱或辅助性T细胞(helper T ... 详细信息

佐剂(adjuvant)是增强和调节疫苗抗原免疫反应的增强剂,与抗原一起使用能使机体产生更强或更平衡的免疫反应。近年来,重组蛋白疫苗、核酸疫苗等新型疫苗是疫苗的研发热点,尤其是重组蛋白疫苗,通常存在免疫原性弱或辅助性T细胞(helper T cells,Th)1/Th2免疫反应不平衡等问题,需要添加佐剂以改善疫苗的免疫效果,因而佐剂开发就成为该类疫苗研发的焦点之一。疫苗佐剂种类繁多且机制复杂,主要分为递送类佐剂、免疫激动剂及复合佐剂等。现就已获批的人用疫苗佐剂以及具有潜力的部分新型佐剂从其作用机制和临床或临床前应用等方面作一概述,为人用疫苗佐剂的相关研究提供理论和应用参考。

关键词：疫苗佐剂免疫激动剂免疫机制 TLR受体激动剂铝佐剂