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短双链RNA对CVB3病毒细胞内清除作用的可行性研究及其机制探讨

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中华实验和临床病毒学杂志 2008年第4期22卷 260-262页

作者：肖宗慧韩继生姚海兰刘哲伟首都儿科研究所分子免疫室北京100020

目的通过观察短双链RNA（Short interfering RNA，siRNA）体外转染HeLa细胞评价siRNA抗CVB3病毒感染的可行性和抑制作用机制。方法通过细胞病变作用保护实验，选择合适的siRNA剂量。Western Blot、***等方法在体外检测siRNA抗CVB3病毒... 详细信息

目的通过观察短双链RNA（Short interfering RNA，siRNA）体外转染HeLa细胞评价siRNA抗CVB3病毒感染的可行性和抑制作用机制。方法通过细胞病变作用保护实验，选择合适的siRNA剂量。Western Blot、***等方法在体外检测siRNA抗CVB3病毒复制作用及作用途径。结果siRNA．3753通过脂质体转染试剂能高效转入HeLa细胞，转染效率可达98．77％，在细胞内可稳定长达48h。siRNA-3753的浓度为0．6gmol／L对病毒抑制率高同时对细胞不会产生毒性作用，该浓度作为本次研究的实验剂量。siRNA-3753抗CVB3病毒感染作用是通过siRNA直接降解病毒基因得到的，而不是通过激活PKR或干扰素等其他未知因素起效的。结论siRNA可以高效、较长时间的转染入HeLa细胞内，在低剂量时即产生较好的抗病毒感染作用，通过直接降解病毒基因组的途径特异性抑制CVB3病毒的复制及感染。

关键词： RNA 柯萨奇病毒感染脂质体转染试剂抗病毒感染作用细胞

ITK蛋白调节小鼠脾淋巴细胞增殖分化的研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2009年第4期23卷 269-271页

作者：肖宗慧何峰姚海兰韩继生刘哲伟首都儿科研究所分子免疫室北京100020

目的应用RNA干扰技术特异性抑制Itk基因的表达，观察Itk蛋白在淋巴细胞增殖和相应免疫因子合成分泌中的作用，进行Itk作为药物靶标的确认。方法设计合成针对Itk基因的siRNA，将siRNA电转染至小鼠脾淋巴细胞，WestemBlot检测Itk蛋白的表... 详细信息

目的应用RNA干扰技术特异性抑制Itk基因的表达，观察Itk蛋白在淋巴细胞增殖和相应免疫因子合成分泌中的作用，进行Itk作为药物靶标的确认。方法设计合成针对Itk基因的siRNA，将siRNA电转染至小鼠脾淋巴细胞，WestemBlot检测Itk蛋白的表达、MTS方法检测细胞增殖率、ELISA方法检测细胞因子的含量。结果实验组Itk—siRNA在细胞水平上有效抑制了Itk蛋白的表达；Itk受抑制后细胞增殖率与对照组相比明显降低，差异有统计学意义，P〈0．05；细胞因子IL-2，IL-4，IL-5，IFN-γ的分泌水平下降，P〈0．05。结论Itk表达受抑制后有效降低脾淋巴细胞的增殖率及细胞因子分泌的减少，研究验证了Itk在细胞增殖和炎性细胞因子分泌方面的重要免疫调节作用，为将其作为药物的靶基因提供实验依据。

关键词：蛋白质酪氨酸激酶 RNA 细胞培养的细胞因子类

小干扰RNA在心肌细胞中对柯萨奇病毒B3复制的抑制作用研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第4期28卷 320-324页

作者：刘哲伟任红雁姚海兰肖宗慧鲁杰何峰韩继生首都儿科研究所分子免疫研究室北京100020

目的通过在原代心肌细胞培养上研究小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）介导的基因干扰对病毒增殖的抑制和细胞内免疫清除作用，评价siRNA在治疗病毒性感染中的可能性。方法体外制备BALB／c乳鼠心肌细胞，利用脂质体和电穿孔转... 详细信息

目的通过在原代心肌细胞培养上研究小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）介导的基因干扰对病毒增殖的抑制和细胞内免疫清除作用，评价siRNA在治疗病毒性感染中的可能性。方法体外制备BALB／c乳鼠心肌细胞，利用脂质体和电穿孔转染方法转染siRNA后感染病毒，流式细胞术、中性红染色和病毒致细胞病变作用（CPE）保护实验评价转染效率和细胞生长状态，空斑形成减少实验、RT-PCR等方法检测抑制病毒程度。结果通过在HeLa细胞上的筛选，针对病毒不同区域的siRNA呈现出不同的抗病毒作用，靶序列位于2B区的siRNA-3753能显著抑制柯萨奇病毒B3（CVB3）感染。在原代培养的心肌细胞中，转染siRNA-3753后同样显示出很好的抗病毒效果，心肌的搏动、心肌细胞的生长状况保持着较好的状态。而病毒对照和非特异性siRNA-non感染24h后，细胞停止搏动，逐步变圆，皱缩死亡。测定培养上清和细胞内的病毒滴度，电转siRNA-3753对病毒抑制率可以达到98．1％，脂质体转染siRNA-3753对病毒抑制率为78.2％。电穿孔转染效率可以达到56.03％，脂质体为9.0％。结论针对CVB3基因组2B区的siRNA在保护心肌细胞抵抗CVB3病毒感染实验中具有抑制病毒复制作用。

关键词：小干扰RNA 柯萨奇B组病毒(CVB) 病毒性心肌炎心肌细胞

TLR途径负性调节因子A20、IRF-4和TRAF4在川崎病免疫发病中的变化

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第5期27卷 468-473页

作者：王国兵李成荣杨军祖莹杨卫国儿科研究所分子免疫室深圳市儿童医院518026

目的探讨Toll样受体（TLR）信号途径负性调控因子在川崎病（KD）免疫发病机制中的作用。方法急性期KD患儿48例，正常同年龄对照组16例，感染性疾病对照组（ID）16例。采用逆转录．聚合酶链反应（***）及荧光定量PCR检测外周血单核，... 详细信息

目的探讨Toll样受体（TLR）信号途径负性调控因子在川崎病（KD）免疫发病机制中的作用。方法急性期KD患儿48例，正常同年龄对照组16例，感染性疾病对照组（ID）16例。采用逆转录．聚合酶链反应（***）及荧光定量PCR检测外周血单核，巨噬细胞（MC）TLR4信号途径传导分子、负性调节因子及前炎症细胞因子mRNA的表达。结果（1）急性期KD患儿TLR4、MD-2、MyD88、IRAK-4、TRAF6、TAK1、TAB1及TAB2mRNA表达明显高于正常同年龄对照组（P〈0．01）；（2）KD及ID患儿A20、IRF-4、TRAF4基因表达上调（P〈0．01）；KD患儿除．A20表达水平高于ID对照组外，IRF-4、TRAF4表达水平明显低于ID对照组（P〈0．01）；KD患儿前炎症细胞因子表达明显高于ID组（P〈0．01）；（3）经细菌脂多糖（LPS）刺激后，KD患儿及正常对照组A20、IRF-4及TRAF4表达明显增高（P〈0．01），但KD患儿3种负性调节因子基因表达显著低于正常对照组（P〈0．01）；（4）KD合并冠状动脉损伤组（KD-CAL^＋）MC负性调节因子IRF-4及TRAF4明显低于无冠状动脉损伤组（KD-CAL^-），A20表达则显著高于后者；KD-CAL^＋组前炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α均高于KD-CAL^-组（P〈0．01）。结论急性期KD患儿TLR信号途径负性调节因子相对表达不足可能与KD的免疫发病机制有关。

关键词：川崎病 Toll样受体 A20 IRF-4 TRAF4

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川崎病Toll样受体MyD88非依赖性信号途径及其调节因子的研究

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中华儿科杂志 2007年第11期45卷 818-823页

作者：王国兵李成荣祖莹深圳市儿童医院儿科研究所分子免疫室 518026

目的探讨 Toll 样受体 MyD88非依赖性途径及其调节因子在川崎病(KD)免疫发病机制中的作用。方法急性期 KD 患儿32例,正常同年龄对照组16例,KD 患儿分别于静脉丙种球蛋白(IVIG)治疗前后直接取血备检。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及... 详细信息

目的探讨 Toll 样受体 MyD88非依赖性途径及其调节因子在川崎病(KD)免疫发病机制中的作用。方法急性期 KD 患儿32例,正常同年龄对照组16例,KD 患儿分别于静脉丙种球蛋白(IVIG)治疗前后直接取血备检。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及荧光定量 PCR(RealTime PCR)检测单核/巨噬细胞(MC)Toll 样受体4及 MyD88非依赖性途径传导分子/效应分子,如含 Toll-白细胞介素-1受体结构域诱导干扰素接头分子(TRIF)、TRIF 相关接头分子(TRAM)、TANK 结合激酶1(TBK-1)、干扰素β(IFN-β)、干扰素诱导蛋白10(IP-10)、活化正常 T 细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)、诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)等,及负性调节因子细胞因子信号抑制因子1(SOCS-1)mRNA 表达;流式细胞术检测 MC 细胞表面共刺激分子 CD40的表达;甲基化特异性-荧光定量 PCR 分析 SOCS-1基因胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)基序甲基化状态。结果 (1)急性期KD 患儿 MC MyD88非依赖性途径传导分子 TLR4、TRIF、TRAM、TBK-1和 IFN-β mRNA 表达水平显著高于正常同年龄对照组(P分子 CD40明显高于同年龄对照组[(6.19±2.25)% vs.(2.00±1.37)%,t=7.98,P免疫功能紊乱的因素之一。

关键词：黏膜皮肤淋巴结综合征受体细胞表面膜糖蛋白类阻遏蛋白质类胞间信号肽类和蛋白质类

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EV71感染患儿Toll样受体表达初探

中华微生物学和免疫学杂志 2011年第8期31卷 729-734页

作者：郭建群李成荣祖莹王国兵何颜霞付丹深圳市儿童医院儿科研究所分子免疫室 518026

目的探讨肠道病毒71型（EVT1）感染患儿免疫活性细胞模式识别受体（patternrec—ognitionreceptor，PRR）及细胞因子水平的变化。方法Ev71感染患儿71例，其中轻症EV71感染组20例，重症EV71感染组25例，危重症EV71感染组26例，同年龄正... 详细信息

目的探讨肠道病毒71型（EVT1）感染患儿免疫活性细胞模式识别受体（patternrec—ognitionreceptor，PRR）及细胞因子水平的变化。方法Ev71感染患儿71例，其中轻症EV71感染组20例，重症EV71感染组25例，危重症EV71感染组26例，同年龄正常对照组20例。采用***检测外周血单个核细胞维甲酸蛋白Ⅰ（retinoic acidinduciblegene I，RIG—I）、黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differentitation-associated gene5，MDA5）及细胞因子（IL-12、IFN-α）表达；流式细胞术检测外周血单核／巨噬细胞（monocyte／macrophages，MC）、髓样树突状细胞（myloiddentriticcells，mDC）及浆样树突状细胞（plasmacytoiddentriticcells，pDC）Toll样受体（TLRs）表达率；ELISA检测细胞因子IL-12及IFN-α的变化。结果（1）轻症患儿仅TLR7升高，重症EV71感染患儿外周血MC、mDC、pDCTLR7表达明显升高（P〈0．05），MC、mDC高表达TLR2、3、4，危重症患儿呈下降趋势。（2）EV71感染患儿胞内模式识别受体RIG—I／MDA5mRNA表达明显增加；（3）轻症患儿DC相关细胞因子有上升趋势，重症患儿DC相关细胞因子IL-12、IFN-α明显增高（P〈O．05），轻症及危重症患儿明显降低（P〈0．05）。结论TLR7可能是免疫活性细胞识别EV71的主要模式识别受体；RIG-I／MDA5也可能参与识别EV71；合并细菌感染或细胞破坏释放的内源性配体导致TLR2或TLR4活化，诱导炎症反应。

关键词： EV71感染模式识别受体 Toll样受体 RIG-I/MDA5 免疫功能

川崎病Toll样受体信号途径调节因子变化及其意义

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中华儿科杂志 2008年第1期46卷 49-54页

作者：王国兵李成荣祖莹杨卫国深圳市儿童医院儿科研究所分子免疫室 518026

目的探讨急性期川崎病（KD）Toll样受体（TLRs）信号途径调节因子的变化及意义。方法急性期KD患儿48例，正常同年龄对照组儿童（对照组）16例，感染性疾病对照组（ID组）16例。采用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）及荧光定量PCR检测外... 详细信息

目的探讨急性期川崎病（KD）Toll样受体（TLRs）信号途径调节因子的变化及意义。方法急性期KD患儿48例，正常同年龄对照组儿童（对照组）16例，感染性疾病对照组（ID组）16例。采用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）及荧光定量PCR检测外周血单核／巨噬细胞（MC）TLR4信号途径传导分子，调节因子及前炎症细胞因子mRNA的表达；流式细胞术检测MC TLR4的表达。结果（1）急性期KD患儿TLR4、髓样分化蛋白2（MD-2）、髓样分化蛋白88（MyD88）、白细胞介素1受体相关激酶4（IRAK-4）、肿瘤坏死因子相关因子6（TRAF6）、转化生长因子-β-活化激酶1（TAK1）、TAK结合蛋白1（TAB1）和TAK结合蛋白2（TAB2）mRNA表达明显高于对照组（P〈0．05）；（2）KD患儿及ID组患儿MC正性调节因子TLR4相关蛋白（PRAT4B）和信号转导接头蛋白2（STAP2）表达明显高于对照组（P〈0．05），两组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）；KD患儿DAP12基因表达明显低于对照组（P〈0．05），FLN29、RP105及MD-1 mRNA表达上调（P〈0．05），4种负性调节因子均显著低于ID组（P〈0．05）；KD患儿前炎症细胞因子表达明显高于ID组（P〈0．05）；（3）体外细菌脂多糖（LPS）刺激后KD患儿及对照组正性调节因子mRNA表达显著上调，对照组负性调节因子表达上调（P〈0．05），KD患儿除DAP12表达上调外（P〈0．05），FLN29、RP105及髓样分化蛋白1（MD-1）刺激前后无明显变化（P〉0．05）；（4）KD合并冠状动脉损伤组（KD—CAL^＋组）MC正性调节因子PRAT4B和STAP2表达明显高于无冠状动脉损伤组（KD—CAL^＋组）（P〈0．05）；KD—CAL^＋组负性调节因子FLN29、RP105和MD-1表达显著低于KD-CAL^-组（P〈0．05）；KD—CAL^＋组前炎症细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及CD14^＋细胞表面TLR4蛋白表达高于KD—CAL^-组[（11．9±2．4）％vs．（6．5±1．7）％，P〈0．05]。结论急性期KD患儿TLRs信号途径负性调节因子调控失衡可能是导致KD免疫功能紊乱的因素之一。

关键词：黏膜皮肤淋巴结综合征受体,细胞表面膜糖蛋白类

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遗传与儿童免疫性疾病

中华儿科杂志 2006年第6期44卷 425-427页

作者：李成荣深圳市儿童医院儿科研究所分子免疫室 518026

根据遗传因素在发病机制中的作用可将疾病分为单基因遗传病和复杂性状(complex traits)疾病.常见的原发性免疫缺陷病多属单基因遗传病,遵循孟德尔遗传规律,其遗传方式可分为常染色体显性遗传(AD)、常染色体隐性遗传(AR)、X连锁遗传(XL)... 详细信息

根据遗传因素在发病机制中的作用可将疾病分为单基因遗传病和复杂性状(complex traits)疾病.常见的原发性免疫缺陷病多属单基因遗传病,遵循孟德尔遗传规律,其遗传方式可分为常染色体显性遗传(AD)、常染色体隐性遗传(AR)、X连锁遗传(XL)等.多数自身免疫性疾病[如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(JRA)、川崎病(KD)]和过敏性疾病属复杂性状疾病;它们是由许多相关基因加和作用形成的.复杂性状性疾病目前已成为生命科学中普遍关注的前沿,阐明复杂性状疾病的发病机制,需要解决两个问题:一是明确疾病的主要易感基因,这需要在人类基因组中找寻一种数目多、分布广泛且相对稳定的遗传标记,单核苷酸多态性(SNPs)正是代表了这样的一种标记;二是寻找影响这些基因表达的表观遗传(epigenetic)修饰因子(如DNA甲基化).因此,本文仅在简单介绍一般免疫性疾病遗传学特点的基础上,结合目前的临床基础研究资料,重点讨论表观遗传修饰及SNPs与免疫系统疾病的关系。[第一段]

关键词：自身免疫性疾病单基因遗传病复杂性状疾病原发性免疫缺陷病常染色体显性遗传常染色体隐性遗传表观遗传修饰孟德尔遗传规律系统性红斑狼疮类风湿性关节炎

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急性期川崎病Th17细胞变化初探

中华微生物学和免疫学杂志 2009年第10期29卷 939-943页

作者：王国兵李成荣杨军杨卫国深圳市儿童医院儿科研究所分子免疫室 518026

目的探讨Th17细胞在川崎病（Kawasaki disease，KD）免疫发病机制中的作用。方法急性期KD患儿60例，正常同年龄对照组32例，KD患儿分别于静脉丙种球蛋白（IVIG）治疗前后直接取血备检。采用荧光定量PCR（real—timePCR）检测CD4^＋T细胞... 详细信息

目的探讨Th17细胞在川崎病（Kawasaki disease，KD）免疫发病机制中的作用。方法急性期KD患儿60例，正常同年龄对照组32例，KD患儿分别于静脉丙种球蛋白（IVIG）治疗前后直接取血备检。采用荧光定量PCR（real—timePCR）检测CD4^＋T细胞IL-17A／F、转录因子ROR-γt、Foxp3及PBMCIL-6、TGF—β、IL-23p19、IL-27p28、IL-27EBI3、IFN-γ等mRNA表达；酶联免疫吸附试验检测血浆中IL-6、TGF—β、IL-23、IL-27、IFN-γ的蛋白浓度；流式细胞术检测外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Tr）的比例。结果急性期KD患儿CD4^＋T细胞高表达IL-17A及IL-17F（P〈0．01），IVIG治疗后明显降低（P〈0．01）；急性期KD患儿IL-17A／IL-17F与红细胞沉降率（ESR）、C反应蛋白（CRP）、白细胞数目（WBC）呈正相关（IL-17A：0．70，0．85，0．80，P〈0．01；IL一17F：0．63，0．65，0．69，P〈0．01）；急性期KD患儿Th17细胞转录因子ROR-γt及前炎症细胞因子IL-6转录水平明显高于对照组（P〈0．01），IVIG治疗后显著降低（P〈0．01）；TGF—β、IL-23p19、IL-27p28、IL-27EBI3mRNA水平及血浆蛋白浓度与对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）；血浆IFN-γ浓度显著升高，mRNA水平无变化；急性期KD患儿CD4^＋CD25^＋Tr细胞比例明显低于正常对照组（P〈0．01），其转录因子Foxp3表达亦明显降低（P〈0．01）。结论急性期KD患儿Th17细胞过度活化可能参与了KD免疫发病机制。

关键词：川崎病 Th17细胞 IL-17 ROR-γt