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肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2014年第12期44卷 1231-1235页

作者：李富祥廖德芳姚俊熊和丽李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为建立肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据肺炎克雷伯菌16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR。结果显示... 详细信息

为建立肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据肺炎克雷伯菌16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR。结果显示,该方法与猪肺炎支原体、猪鼻支原体、臭鼻克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、肠球菌、乳杆菌、解淀粉芽胞杆菌、猪丹毒杆菌、奇异变形杆菌和化脓隐秘杆菌共15种细菌无交叉反应;标准品浓度在2.29×109~2.29×104 copies/μL范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.29×102 copies/μL的标准品阳性质粒;批内和批间变异系数均小于3%。临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强和检测快速的优点,可用于肺炎克雷伯菌感染的早期诊断、样品的快速检测以及肺炎克雷伯菌的定量分析。

关键词：肺炎克雷伯菌 TaqMan荧光定量PCR 16SrRNA基因早期诊断定量分析

中国动物虫媒病毒主要传播媒介库蠓种类及其分布

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中国热带医学 2022年第6期22卷 505-511页

作者：李苏胜王静林云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

库蠓(双翅目:蠓科)是一种重要的医学和兽医学媒介昆虫,能通过叮咬动物和人传播蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)、施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus, SBV)、奥罗波克病毒(Oropouche virus, OROV)等多种病毒,危害动物和人类健康,造... 详细信息

库蠓(双翅目:蠓科)是一种重要的医学和兽医学媒介昆虫,能通过叮咬动物和人传播蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)、施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus, SBV)、奥罗波克病毒(Oropouche virus, OROV)等多种病毒,危害动物和人类健康,造成重大经济损失。全国34个省级行政区中,除了北京和澳门,其余都有库蠓分布的报道。我国现记载的库蠓属有12个亚属368种,分布在云南的库蠓种类最多,其中原野库蠓(***)的分布最广。能传播或潜在具有传播病毒能力的库蠓至少有42种,其中我国有20种,在北京、天津、香港、澳门以外的各省(市、自治区)均有分布。为进一步了解传播虫媒病毒的库蠓种类及其分布情况,促进我国蠓传动物疾病的预防和控制,本文对我国动物病毒媒介库蠓的种类和分布情况进行综述,为动物虫媒病毒的研究提供依据。

关键词：库蠓地理分布虫媒病毒

一株尿素酶阴性产气巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

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中国预防兽医学报 2017年第3期39卷 240-243页

作者：李富祥李华春杨仕标宋建领朱建波廖德芳云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

本研究从猪流产胎儿中分离到一株形似产气巴氏杆菌菌株并命名为ZY14013,对其进行生化鉴定、16S rDNA序列分析和药物敏感性分析。生化鉴定结果表明,ZY14013除尿素酶阴性外,其它生化特征与产气巴氏杆菌模式菌株ATCC 27883以及其它分离株... 详细信息

本研究从猪流产胎儿中分离到一株形似产气巴氏杆菌菌株并命名为ZY14013,对其进行生化鉴定、16S rDNA序列分析和药物敏感性分析。生化鉴定结果表明,ZY14013除尿素酶阴性外,其它生化特征与产气巴氏杆菌模式菌株ATCC 27883以及其它分离株具有相似生化特征。遗传进化分析表明ZY14013与ATCC 2788以及16株现存分离株16S rDNA核苷酸同源性分别为99.2%和99.6%~99.9%,在进化树中形成同一个群。药敏试验表明,分离株ZY14013对青霉素、氟苯尼考和头孢类抗生素敏感,对链霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素和氧氟沙星耐药。本研究首次证实了猪产气巴氏杆菌感染在中国大陆的存在,同时,本研究在世界首次分离到尿素酶阴性产气巴氏杆菌,丰富了产气巴氏杆菌的生化特征,为研究尿素酶在产气巴氏杆菌致病性中的作用提供了自然突变体。

关键词：产气巴氏杆菌尿素酶阴性分离 16S rDNA 生化特征

口蹄疫病毒群特异性RT-LAMP检测技术的建立及试用

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中国动物传染病学报 2020年

作者：谢佳芮寇美玲苗海生云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业农村部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室

为实现对口蹄疫病毒（FMDV）感染的现场快速检测，本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列，截取并比对FMDV高度保守的3D（RNA聚合酶）基因序列，设计17套环介导等温扩增引物，并对反应体系和... 详细信息

为实现对口蹄疫病毒（FMDV）感染的现场快速检测，本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列，截取并比对FMDV高度保守的3D（RNA聚合酶）基因序列，设计17套环介导等温扩增引物，并对反应体系和反应条件进行优化，建立FMDV群特异性RT-LAMP技术。该技术在反应前用石蜡密封PicoGreen染料，实现了免开盖可视化判定检测结果；该技术对PRV、PRRSV、AKAV、BTV-1、BTV-16、EHDV、CHUV等偶蹄动物病毒未见非特异性扩增；最低可检测3.4×10-6ng/μL的病毒RNA，灵敏度是RT-qPCR技术的10倍，是一步法RT-PCR的100倍；尝试应用RT-LAMP对94份RNA临床样品进行检测比对，该检测方法与RT-PCR方法和RT-qPCR 方法对临床样品检测的符合率均为82.8%。本研究建立的FMDV群特异性RT-LAMP快速核酸检测技术，具有准确性高、快速简便的优点，可用作家畜FMDV早期感染的现场诊断技术。

关键词：口蹄疫病毒环介导等温核酸扩增群特异性引物

感染16型蓝舌病病毒后绵羊部分细胞因子消长特点研究

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中国畜牧兽医 2021年第1期48卷 296-302页

作者：苗海生寇美玲谢佳芮李乐李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

本试验旨在探明绵羊感染16型蓝舌病病毒(Bluetongue virus type 16,BTV16)后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的消长特点。用实时荧光定量PCR检测方法对感染BTV16后3只绵羊上述4种因子mRNA进行检测,同时设立阴性对照绵羊,并以0 d mRN... 详细信息

本试验旨在探明绵羊感染16型蓝舌病病毒(Bluetongue virus type 16,BTV16)后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的消长特点。用实时荧光定量PCR检测方法对感染BTV16后3只绵羊上述4种因子mRNA进行检测,同时设立阴性对照绵羊,并以0 d mRNA为基准,计算mRNA的相对表达量,同时检测病毒抗体效价、测量绵羊体温。结果显示,接种BTV16的3只绵羊均不同程度产生抗体和体温症状,4种细胞因子的mRNA在接种病毒2~4 d内均出现显著上升,其中IFN-γ峰值在2.58~27.84倍之间,IL-2峰值在5.24~17.19倍之间,IL-4峰值在2.16~3.43倍之间,IL-10峰值在15.78~48.77倍之间,个体上升幅度存在显著差异,4种细胞因子均在高水平持续6 d左右后逐渐下降。对照绵羊上述参数在正常范围内波动。本研究阐明了接种BTV16后绵羊细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10在转录水平上的消长特点,为进一步深入开展BTV感染特征、宿主机体免疫机制研究提供参考。

关键词： 16型蓝舌病病毒(BTV16) 细胞因子 mRNA 消长特点

阿卡斑病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立和比较试验

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中国预防兽医学报 2019年第4期41卷 371-375页

作者：苗海生李乐廖德芳寇美玲朱建波肖雷孟锦昕杨恒李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室

为建立阿卡斑病毒抗体检测方法,本研究以纯化的阿卡斑病毒作为包被抗原,以制备的抗阿卡斑病毒的多克隆抗体与待检血清竞争结合抗原,采用方阵滴定法优化反应条件,建立了阿卡斑病毒竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。通过对60份牛、羊阿卡... 详细信息

为建立阿卡斑病毒抗体检测方法,本研究以纯化的阿卡斑病毒作为包被抗原,以制备的抗阿卡斑病毒的多克隆抗体与待检血清竞争结合抗原,采用方阵滴定法优化反应条件,建立了阿卡斑病毒竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。通过对60份牛、羊阿卡斑病毒抗体阳性血清和40份阴性血清样品的检测,确定阴阳性样品抑制率(PI)临界值为60%;特异性试验结果显示,该方法对BTV-1、BTV-4、BTV-9、BTV-16、小反刍兽疫、中山病病毒、鹿流行性出血热病毒(EHDV)、羊痘和O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,标准阳性血清1颐128倍稀释时,检测结果仍为阳性,SNT最低检出为,敏感性高于微量血清中和试验(SNT)检测结果(1颐64);批内和批间变异系数(CV)在0.54%~5.27%和0.3%~9.3%之间,具有较好的可重复性;用该方法与法国IDVET公司的同类试剂盒对85份牛、羊血清样品同时检测,结果显示二者符合率为91.76%,可以替代进口同类产品。本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于阿卡斑病毒抗体检测和流行病学调查。

关键词：阿卡斑病毒 cELISA 抗体检测

云南景洪帕利亚姆亚群达圭勒病毒的分离与鉴定

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中国畜牧兽医 2021年第6期48卷 2160-2168页

作者：寇美玲杨振兴谢佳芮李乐苗海生云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

为了解牛感染帕利亚姆亚群达圭勒病毒(D’Aguilar virus,DAGV)情况,本研究应用BHK21细胞对2019年云南省景洪市采集的健康黄牛血液样品进行盲传病毒分离,对出现细胞病变的样品进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病毒进... 详细信息

为了解牛感染帕利亚姆亚群达圭勒病毒(D’Aguilar virus,DAGV)情况,本研究应用BHK21细胞对2019年云南省景洪市采集的健康黄牛血液样品进行盲传病毒分离,对出现细胞病变的样品进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病毒进行S2、S3、S7基因序列测定和比对分析。结果显示,有5个血液样品可致BHK21细胞病变,电镜观察到完整病毒颗粒呈球形,直径约50 nm;琼脂糖凝胶电泳结果发现5株新分离病毒基因组为10节段,呈现3-3-4的电泳带型特征,其带型特征与2014年在云南分离到的DAGV V106/YN/2014毒株相似;5株病毒S2、S3、S7基因核苷酸、氨基酸序列相似性均为100%,S3、S7片段核苷酸和氨基酸序列与中国本土分离的帕利亚姆亚群病毒(Palyamserogroup virus,PALV)毒株相似性最高;S2片段氨基酸与核苷酸序列与日本分离的DAGV相似性最高。S2、S3、S7基因遗传进化分析结果显示,5株新分离毒株间基因相似度为100%;5个毒株的S7与S3基因序列均与中国本土分离的已知部分PALV毒株在同一分支,亲缘关系较近,提示这5株毒株为PALV;5株毒株S2片段核苷酸序列与日本分离的部分DAGV毒株位于同一分支上,亲缘关系较近,进一步证实这5株毒株为PALV DAGV。本研究成功分离到5株DAGV毒株,并进行了基因片段遗传进化分析,为进一步开展DAGV流行病学研究提供基础。

关键词：帕利亚姆血清群达圭勒病毒分离鉴定

云南边境地区帕利亚姆血清群中山病病毒的分离与鉴定

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中国畜牧兽医 2022年第11期49卷 4401-4409页

作者：寇美玲苗海生李乐谢佳芮李华春宋建领云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

【目的】了解西南边境地区牛感染中山病病毒(Chuzan virus,CHUV)的情况。【方法】应用BHK21细胞对云南景洪、江城采集的312份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,对出现细胞病变的毒株进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病... 详细信息

【目的】了解西南边境地区牛感染中山病病毒(Chuzan virus,CHUV)的情况。【方法】应用BHK21细胞对云南景洪、江城采集的312份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,对出现细胞病变的毒株进行形态学、基因组带型和分子生物学鉴定,对分离到的病毒进行S7、S2基因序列测定和比对分析。【结果】4份血液样品可致BHK21细胞病变,电镜观察病毒颗粒呈球形,直径约50 nm;琼脂糖凝胶电泳发现,4株分离毒株基因组为10节段,带型为“3-3-4”,与2012年云南师宗分离的CHUV SZ187毒株相似;4株病毒S7、S2基因核苷酸序列相似性分别为98.7%~99.7%和97.9%~99.1%;S2基因片段核苷酸和氨基酸序列与中国本土分离的SZ187、GHN-GS-16等毒株相似性最高;S7基因片段核苷酸和氨基酸序列与日本分离的ON-1/E/18、ON-3/E/17及中国本土的SZ187、GHN-GS-16等毒株的相似性最高。S7、S2基因遗传进化分析结果显示,4株新分离毒株亲缘关系最近;4株毒株的S7基因序列与中国本土和日本分离的已知帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)毒株位于同一分支,提示4株毒株为PALV,且形成一簇,有一定的地域性;4株毒株S2基因片段核苷酸序列与中国本土分离的CHUV位于同一分支,亲缘关系较近,进一步证实这4株毒株为CHUV。【结论】本研究首次报告了从云南边境地区牛群中分离到CHUV毒株,为CHUV在中国的流行病学和边境地区疫病风险防控提供了重要参考及有力依据。

关键词：中山病病毒(CHUV) 分离鉴定序列分析

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云南蓝舌病病毒1型毒株M6基因序列分析

中国畜牧兽医 2016年第2期43卷 340-347页

作者：李楠朱建波肖雷李乐杨恒孟锦昕何于雯李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224

为了解云南蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）1型M6基因流行株的遗传变异及其与国内外流行病毒的遗传进化关系,试验从细胞培养物中分别提取4株云南分离株BTV-1（Y863、SZ120169、6-12和7-12）RNA,用M6基因特异引物进行RT-PCR扩增和测... 详细信息

为了解云南蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）1型M6基因流行株的遗传变异及其与国内外流行病毒的遗传进化关系,试验从细胞培养物中分别提取4株云南分离株BTV-1（Y863、SZ120169、6-12和7-12）RNA,用M6基因特异引物进行RT-PCR扩增和测序,采用生物信息学软件对获得的M6基因编码区序列进行核苷酸、氨基酸同源性比对及遗传进化分析。结果表明,分别获得4株云南分离株BTV-1 M6基因1 763bp序列;4株云南分离株BTV-1核苷酸同源性在95.2%-99.9%之间,氨基酸同源性在97.6%-99.8%之间,1979年师宗分离的Y863病毒毒株与2012年师宗（SZ120169）、2013年江城（6-12、7-12）分离的3株病毒毒株核苷酸同源性分别为95.5%、95.2%和95.2%,氨基酸同源性分别为97.6%、98.4%和98.2%,而近两年（2012、2013）分离病毒核苷酸和氨基酸同源性较高,分别在96.9%-99.9%和99.1%-99.8%之间;遗传进化分析发现,4株云南分离株BTV-1为Eastern基因群病毒,它们之间核苷酸和氨基酸同源性分别为95.2%-99.9%和97.6%-99.8%;进一步分析发现4株云南分离株BTV-1与希腊及澳大利亚BTV-1型毒株亲缘关系较近,核苷酸和氨基酸同源性分别为90.4%-95.6%和95.1%-99.1%,而与地中海国家（意大利、法国、阿尔及利亚、摩洛哥和突尼斯）和南非毒株关系较远,核苷酸和氨基酸同源性分别在83.8%和95.7%以下。4株云南分离株BTV-1属于Eastern基因群病毒,云南分离株BTV-1 M6基因在自然进化中发生遗传变异缓慢,该基因可以用来进行BTV-1基因群分布及毒株的地理区域来源相关的研究。

关键词：蓝舌病病毒 M6基因序列分析

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