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猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立及初步应用

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 413-418页

作者：周建浩王东方刘影王淑娟马震原谢彩华赵雪丽杨海波冯桂丹康台生胡煜锋李博文闫若潜河南农业大学动物医学院郑州450046 河南省动物疫病预防控制中心/河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008 河南科技大学动物科技学院洛阳471000 上海市动物疫病预防控制中心上海201103

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异... 详细信息

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL^(-1),敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×10^(1)copies·μL^(-1));模板浓度为1.0×10^(0)~1.0×10^(4)copies·μL^(-1)时,具有良好的线性关系(R 2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddPCR方法、行业标准FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddPCR方法对行业标准FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为10^(0)%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

关键词：猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR 方法建立

鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 165-173页

作者：赵雪丽闫若潜王华俊王淑娟马震原谢彩华柴茂杨海波王翠刘影王东方河南省动物疫病预防控制中心、河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室郑州450008

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性... 详细信息

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

关键词：猪圆环病毒2型 rep基因猪圆环病毒3型 cap基因双重TaqMan MGB FQ-PCR

鸭疫里默氏杆菌九型分泌系统(T9SS)分泌蛋白B739_0093的功能鉴定

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微生物学报 2024年第7期64卷 2407-2418页

作者：江茵罗睿心程安春刘马峰西南动物疫病防控技术教育部工程研究中心四川成都611130 四川省动物疫病防控国际联合研究中心四川成都611130 动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130 四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心四川成都611130

【目的】鸭疫里默氏杆菌是引起鸭浆膜炎的一种革兰氏阴性病原菌,该菌编码的九型分泌系统(type IX secretion system,T9SS)参与滑动、致病等过程。前期研究结果表明,鸭疫里默氏杆菌CH-1株B739_0093基因在限铁培养条件明显上调。序列分析... 详细信息

【目的】鸭疫里默氏杆菌是引起鸭浆膜炎的一种革兰氏阴性病原菌,该菌编码的九型分泌系统(type IX secretion system,T9SS)参与滑动、致病等过程。前期研究结果表明,鸭疫里默氏杆菌CH-1株B739_0093基因在限铁培养条件明显上调。序列分析表明,B739_0093编码蛋白含有一个T9SS分泌蛋白保守的C端结构域,然而其具体功能未知。本研究旨在鉴定该基因编码蛋白是否被T9SS分泌,以及在该菌致病中的作用。【方法】用荧光定量PCR检测B739_0093是否被铁离子和铁转运调节子(ferric uptake regulator,Fur)调控;用大肠杆菌表达重组B739_0093截短蛋白制备多克隆抗体,通过Western blotting检测是否由T9SS分泌;构建B739_0093基因缺失株,通过毒力和定殖试验鉴定B739_0093在鸭疫里默氏杆菌致病中的功能。【结果】荧光定量PCR结果表明,B739_0093基因在铁离子限制性培养基明显上调,此调控是由调控蛋白Fur介导的;Western blotting结果显示,B739_0093基因编码蛋白在亲本株RA CH-1主要定位在分泌物中,而在T9SS缺失株定位在菌体且不能在分泌物被检测到;与亲本株RA CH-1相比,RA CH-1ΔB739_0093对雏鸭的致病力减弱,在雏鸭各组织器官的定殖能力明显降低。【结论】B739_0093基因编码蛋白是由鸭疫里默氏杆菌T9SS分泌的,其表达受铁离子及Fur调控,并且参与了该菌的致病。

关键词：鸭疫里默氏杆菌九型分泌系统毒力

2020—2022年全球H5亚型高致病性禽流感疫情简况及分析

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中国兽医杂志 2024年第7期60卷 34-40页

作者：王慧强张跃程敏姮殷雨晴郑雪莹李志军北京市动物疫病预防控制中心北京大兴102629

为了解近年全球H5亚型高致病性禽流感(HPAI)疫情具体情况,本文通过对农业农村部畜牧兽医局发布的“一周国际动物疫情动态”和“疫情发布”中的HPAI疫情信息进行统计和分析,对2020—2022年全球H5亚型HPAI疫情的发生和流行情况,空间、时... 详细信息

为了解近年全球H5亚型高致病性禽流感(HPAI)疫情具体情况,本文通过对农业农村部畜牧兽医局发布的“一周国际动物疫情动态”和“疫情发布”中的HPAI疫情信息进行统计和分析,对2020—2022年全球H5亚型HPAI疫情的发生和流行情况,空间、时间和群间分布,以及给养禽业造成的危害进行较为全面的了解。结果显示,2020年全球H5亚型HPAI疫情以H5N8亚型为主;自2021年5月份,呈现H5N1亚型疫情逐渐增多、H5N8亚型疫情逐渐减少的趋势,至11月份,形成以H5N1亚型疫情为主、H5N8亚型疫情零星发生的局面。H5N1亚型HPAI疫情逐渐演变为全球大流行,在欧洲形成“重灾区”,非洲和亚洲疫情也较为严重。2022年存在2次明显的H5亚型HPAI跨洲际传播,分别是2月份从欧洲传播到北美洲和10月份从北美洲传播到南美洲,经分析认为这2次跨洲际传播与候鸟迁徙有密切联系。结果表明,本轮H5N1亚型HPAI疫情全球大流行持续时间长、传播范围广,给世界养禽业造成巨大危害和深远影响。

关键词：全球 H5亚型高致病性禽流感疫情分析

乳酸菌肽聚糖对雏鸭饲粮中黄曲霉毒素B 1的脱毒效果研究

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动物营养学报 2024年第7期36卷 4339-4349页

作者：邵怡豪王煜琦张宇豪张广明肖发沂李庆梅山东畜牧兽医职业学院动物科技学院潍坊261061 烟台市牟平区动物疫病预防与控制中心烟台264100

本试验旨在探究乳酸菌肽聚糖对黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))的吸附作用,为乳酸菌肽聚糖的制备和饲粮中AFB_(1)的脱毒提供科学依据及理论基础。试验以4种乳酸菌(嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌)为原料提取乳酸菌肽聚糖,... 详细信息

本试验旨在探究乳酸菌肽聚糖对黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))的吸附作用,为乳酸菌肽聚糖的制备和饲粮中AFB_(1)的脱毒提供科学依据及理论基础。试验以4种乳酸菌(嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌和植物乳杆菌)为原料提取乳酸菌肽聚糖,采用高效液相色谱法比较4种乳酸菌肽聚糖对AFB_(1)的体外吸附率,选取体外吸附效果最好的罗伊氏乳杆菌肽聚糖进行动物试验。选择1日龄健康樱桃谷鸭120只,随机分为5组,每组4个重复,每个重复6只。对照组饲喂基础饲粮,AFB_(1)组在基础饲粮中添加0.10 mg/kg AFB_(1),试验组在AFB_(1)组饲粮中分别添加0.10%(Ⅰ组)、0.15%(Ⅱ组)和0.20%(Ⅲ组)罗伊氏乳杆菌肽聚糖。预试期3 d,正试期21 d。结果表明:1)乳酸菌肽聚糖种类、添加量及二者的交互作用均能够显著影响AFB_(1)的体外吸附率(P<0.05),其中10.0 mg/mL罗伊氏乳杆菌肽聚糖对AFB_(1)的体外吸附率最高,达75.29%。2)与对照组相比,AFB_(1)组的平均日增重、平均日采食量显著降低(P<0.05),料重比显著升高(P<0.05);血浆谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)活性及丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05),肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊指数显著升高(P<0.05),血浆免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及总抗氧化能力(T-AOC)显著降低(P<0.05)。3)与AFB_(1)组相比,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的平均日增重显著升高(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的血浆IgG、IFN-γ、IL-2、IL-4含量和SOD、GSH-Px活性显著升高(P<0.05),血浆AST、AKP、ALT活性及MDA含量显著降低(P<0.05);Ⅱ、Ⅲ组的胸腺和法氏囊指数显著降低(P<0.05)。由此可见,不同乳酸菌肽聚糖对AFB_(1)体外吸附效果不同,饲粮中添加罗伊氏乳杆菌肽聚糖能够部分消除AFB_(1)对雏鸭造成的生长性能下降,改善AFB_(1)所导致的免疫功能降低以及肝脏毒性。

关键词：肽聚糖乳酸菌黄曲霉毒素B 1 生长性能脱毒效果

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渭南市羊小反刍兽疫监测与分析

动物医学进展 2024年第9期45卷 138-141页

作者：徐梦迪王国超南苹瑶秦鸽鸽韦唯吴奇强白鸽渭南市动物疫病预防控制中心陕西渭南714000

为评估渭南市羊小反刍兽疫的免疫抗体水平及病毒感染状况,对2019-2022年在渭南市采集的2 499份血清学样品和606份病原学样品,分别采用阻断ELISA方法和荧光RT-PCR方法进行免疫抗体检测和病毒核酸检测。结果显示,小反刍兽疫免疫抗体个体... 详细信息

为评估渭南市羊小反刍兽疫的免疫抗体水平及病毒感染状况,对2019-2022年在渭南市采集的2 499份血清学样品和606份病原学样品,分别采用阻断ELISA方法和荧光RT-PCR方法进行免疫抗体检测和病毒核酸检测。结果显示,小反刍兽疫免疫抗体个体合格率为88.24%,区域场群合格率为91.99%,不同区域免疫抗体水平合格率均高于农业农村部的免疫要求(≥70%)。分类统计不同年份和不同场点类型的免疫抗体合格率均达到国家免疫效果评估要求。病原学样品病毒核酸均为阴性。结果表明渭南市小反刍兽疫防控效果较好,但仍需持续做好小反刍兽疫的强制免疫及监测,确保养殖安全。

关键词：羊小反刍兽疫监测

鸭疫里默氏杆菌CH-1株37℃和42℃的转录组测序及比较分析

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微生物学报 2024年第7期64卷 2368-2380页

作者：汪思懿郭方程安春刘马峰西南动物疫病防控技术教育部工程研究中心四川成都611130 四川省动物疫病防控国际联合研究中心四川成都611130 动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130 四川农业大学动物医学院禽病防治研究中心四川成都611130

【目的】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)是一种感染鸭的革兰氏阴性菌,给养鸭业造成较大经济损失。由于鸭体内温度为42℃,当鸭疫里默氏杆菌感染鸭后必然会调节自身基因表达来适应鸭体内温度。为鉴定鸭疫里默氏杆菌CH-1株感染... 详细信息

【目的】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)是一种感染鸭的革兰氏阴性菌,给养鸭业造成较大经济损失。由于鸭体内温度为42℃,当鸭疫里默氏杆菌感染鸭后必然会调节自身基因表达来适应鸭体内温度。为鉴定鸭疫里默氏杆菌CH-1株感染鸭的适应性机制,本研究测定和比较了鸭疫里默氏杆菌CH-1株在37℃和42℃下的转录组。【方法】将鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株在37℃培养至对数生长期后,分别在37℃和42℃热应激1 h,收集菌体,提取总RNA。利用转录组测序(RNA-seq)技术获得RA-CH-1在37℃和42℃下的转录组原始数据,筛选得到差异表达基因,通过基因本体论(geneontology,GO)数据库和京都基因与基因组百科全书(Kyotoencyclopediaof genes and genomes,KEGG)数据库对差异表达基因进行富集分析。选取dnaK作为热应激反应基因进行功能初步鉴定。【结果】共筛选获得234个显著差异表达基因,其中169个基因显著上调,65个基因显著下调。显著差异表达基因通过GO富集分析主要富集在核苷代谢过程、糖基化合物代谢过程和核心RNA聚合酶结合转录因子活性等;显著差异表达基因通过KEGG富集分析主要富集在氧化磷酸化、核糖体和细菌分泌系统等通路。与37℃条件下生长能力比较,dnaK缺失后导致鸭疫里默氏杆菌在42℃条件下生长能力受损。【结论】RA-CH-1在37℃和42℃下生长不受影响,通过热休克反应相关蛋白等因子表达上调或下调来应对温度升高后的应激状况。

关键词：鸭疫里默氏杆菌转录组温度

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猫继发性青光眼的诊治

动物医学进展 2024年第2期45卷 142-144页

作者：张维虎廊坊市动物疫病预防控制中心河北廊坊065000

青光眼是小动物临床眼科常见疾病,病因可分为原发性与继发性。在猫科动物中原发性较罕见,临床上更常见的是继发性青光眼,多与眼内炎症有关。现将1例猫继发性青光眼的诊治方法报道,以期为猫青光眼临床诊断和治疗提供参考。

关键词：猫继发性青光眼诊断治疗

牛结节性皮肤病病毒荧光定量PCR方法的建立与应用

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 146-150页

作者：刘存刘孟超张月王晓玲赵梦姣李云岗兰邹然孙圣福刘砚涵山东省动物疫病预防与控制中心济南250100 北京市农业农村局北京100053 烟台市动物疫病预防与控制中心烟台264003

为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10^(1)~3.67×10^(7) co... 详细信息

为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10^(1)~3.67×10^(7) copies/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9905;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为3.67×10 copies/μL;该方法特异性良好,与山羊痘病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒等病毒不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内和批间的变异系数均介于0.133%~1.81%。该方法,临床样品的检测符合率达90%。本试验所建立的LSDV荧光定量PCR方法为临床诊断牛结节性皮肤病提供了一种快速、灵敏的检测方法,为LSDV流行病学调查和监测提供了技术支持。

关键词：牛结节性皮肤病病毒荧光定量PCR GPCR基因诊断