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白蛋白和角蛋白19双标记胚胎干细胞的建立及其向肝祖细胞的分化

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中华肝脏病杂志 2012年第1期20卷 50-54页

作者：兰勇李阳芳李大军韦军民王欣胡以平卫生部北京医院普外科北京100730 第二军医大学细胞生物研究室上海中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所

目的建立白蛋白（Alb）和角蛋白19（CK19）双标记的胚胎干细胞系，并探讨其在肝祖细胞分化中的应用。方法构建含有Alb启动子的绿色荧光蛋白载体，并带有新霉素抗性，同时构建由CK19启动子启动红色荧光的载体，带有潮霉素抗性；将构建好... 详细信息

目的建立白蛋白（Alb）和角蛋白19（CK19）双标记的胚胎干细胞系，并探讨其在肝祖细胞分化中的应用。方法构建含有Alb启动子的绿色荧光蛋白载体，并带有新霉素抗性，同时构建由CK19启动子启动红色荧光的载体，带有潮霉素抗性；将构建好的载体线性化后，同时电转胚胎干细胞E14.1，利用新霉素和潮霉素双筛选后，建立双标记基因修饰胚胎干细胞系E14．1—2；通过拟胚体形成及生长因子（骨形态发生蛋白4和碱性成纤维细胞生长因子）刺激的方法诱导产生肝祖细胞，经过流式细胞术和逆转录-聚合酶链反应检测诱导效率。结果构建了含有Alb启动子启动绿色荧光和CK19启动子启动红色荧光的载体，并证明了Alb和CK19启动子能特异启动各自蛋白的表达}建立了Alb和CK19双标记胚胎细胞系，并证明其具有多能性，显著表达多能性基因八聚体结合转录因子4和阶段特异性胚胎抗原1，在E14．1—2诱导分化22d后通过流式细胞术分选成功得到21．27％Alb和CK19双阳性的肝祖细胞。结论双标记胚胎干细胞的建立可以纯化和定量肝祖细胞，便于改进肝向诱导的方法及研究肝祖细胞特性。

关键词：胚胎干细胞白蛋白类角蛋白19 肝祖细胞

超高分辨率毛细管等电聚焦- 电喷雾质谱联用方法观察蛋白质亚型(英文)

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生物化学与生物物理学报 2002年第4期34卷 423-432页

作者：刘韬邵晓霞曾嵘夏其昌中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组研究分析中心、蛋白质组重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组研?

在线的毛细管等电聚焦电喷雾质谱联用 ,作为一种二维的分离系统 ,对毛细管等电聚焦过程中形成的蛋白质亚型进行了分析。这种分析系统通过使用中性的涂层毛细管 (80cm长 )、动态的毛细管位置调整方法和鞘流液接口得以建立。蛋白质首先... 详细信息

在线的毛细管等电聚焦电喷雾质谱联用 ,作为一种二维的分离系统 ,对毛细管等电聚焦过程中形成的蛋白质亚型进行了分析。这种分析系统通过使用中性的涂层毛细管 (80cm长 )、动态的毛细管位置调整方法和鞘流液接口得以建立。蛋白质首先在毛细管等电聚焦过程中根据它们等电点的差异得到分离 ,然后被电喷雾质谱鉴定。已聚焦好的蛋白质区带通过结合阴极移动和重力移动的方法从毛细管中流出而进入质谱仪。由于在此特定情况下这种方法具有极高的分辨率 ,有三种血红蛋白A和镰刀型血红蛋白的亚型 (具有几乎相同的电荷分布和分子质量 ,但它们的等电点差异在 0 .0 4到 0 .0 8之间 )和两种乳球蛋白A的亚型 (等电点差异为 0 .6 )被检测到。这些蛋白质亚型的等电点、相对含量和分子质量都通过毛细管等电聚焦电喷雾质谱联用方法同时得到了确定。

关键词：毛细管等电聚焦电喷雾质谱蛋白质亚型血红蛋白变种

重组人P-选凝素及P-选凝素糖蛋白配基-1的表达与鉴定

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生理学报 2008年第4期60卷 520-524页

作者：裴新辉林志新耿建国上海交通大学生命科学与技术学院中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子细胞生物学实验室上海200032 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子细胞生物学实验室

P-选凝素表达于血管内皮细胞及血小板膜上,它可以与白细胞膜表面的P-选凝素糖蛋白配基-1(P-selectin glyco-protein ligand-1,PSGL-1)相互作用,在炎症过程中介导白细胞的滚动并启动随后的白细胞迁移级联过程。我们构建了重组人野生型可... 详细信息

P-选凝素表达于血管内皮细胞及血小板膜上,它可以与白细胞膜表面的P-选凝素糖蛋白配基-1(P-selectin glyco-protein ligand-1,PSGL-1)相互作用,在炎症过程中介导白细胞的滚动并启动随后的白细胞迁移级联过程。我们构建了重组人野生型可溶性P-选凝素及其钙离子结合位点突变体,同时构建了重组PSGL-1免疫球蛋白融合分子(PSGL-1-Rg),并应用昆虫杆状病毒表达系统在Sf9细胞中表达这些重组蛋白,最后用镍金属螯和柱或Protein A亲和柱予以纯化。结果显示,用该系统表达的P-选凝素或PSGL-1是有活性的,但是P-选凝素的4个钙离子结合位点突变体却没有活性。该研究证明了P-选凝素钙离子结合位点在其与配基相互作用中的重要性。

关键词： P-选凝素 P-选凝素糖蛋白配基-1 昆虫杆状病毒昆虫细胞Sf9

从体外扩增约2kb长的DNA片段看四种dNTPs和TaqDNA聚合酶对PCR的影响

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细胞生物学杂志 1992年第3期14卷 137-139页

作者：袁亚萍蒋志戎聂慧玲中科院上海细胞生物学研究所 200031 瑞金医院儿科实验室

影响PCR产物特异性和得率的因素很多,本文从实验得到的结果出发,对用PCR钓出较长DNA片段时dNTPs和Taq DNA聚合酶对其特异性和得率的影响进行了讨论。

关键词：聚合酶链反应基因扩增聚合酶

核糖核酸酶抑制蛋白变体RIv在大肠杆菌和家蚕细胞中的表达

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生物化学与生物物理学报 2003年第10期35卷 960-963页

作者：黄广华杨冠珍陈江野吴祥甫中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

人源的核糖核酸酶抑制蛋白 (ribonucleaseinhibitor,RI)是一种富含亮氨酸和半胱氨酸残基的酸性蛋白质 ,分子量为 5 0kD。从人胚胎肝cDNA文库中克隆到一个核糖核酸酶抑制蛋白RI基因的变体 (ribonucleaseinhibitorvari ant,RIv)。序列分... 详细信息

人源的核糖核酸酶抑制蛋白 (ribonucleaseinhibitor,RI)是一种富含亮氨酸和半胱氨酸残基的酸性蛋白质 ,分子量为 5 0kD。从人胚胎肝cDNA文库中克隆到一个核糖核酸酶抑制蛋白RI基因的变体 (ribonucleaseinhibitorvari ant,RIv)。序列分析表明 ,与RI相比较 ,RIv序列中仅有Arg359Ala和Leu36 5Pro两个氨基酸突变 ,而核苷酸同源性较低 ,为 78%。将RIv克隆于pET2 8a(+) ,并转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,利用 6×His亲和层析柱纯化得到了His RIv重组蛋白。将RIv克隆于转移载体pBacPAK8,利用家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)表达系统表达得到重组RIv。体外活性测定实验表明 ,重组RIv具有抑制牛胰RNaseA酶解 2 8S和 18SrRNA的作用。

关键词：核糖核酸酶抑制蛋白大肠杆菌表达家蚕细胞表达

哺乳动物氨基酰-tRNA合成酶复合物中三个辅助因子在分子信号网络中的重要作用

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生物化学与生物物理进展 2009年第4期36卷 398-402页

作者：贺然王恩多中国科学院上海生命科学研究院生物化学和细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

氨基酰-tRNA合成酶是一类古老而保守的蛋白质,它们催化蛋白质生物合成的第一步反应.哺乳动物细胞内存在一个由8种氨基酰-tRNA合成酶和3种辅助因子组成的氨基酰-tRNA合成酶复合物.近年来,陆续发现该复合物中的3个辅助因子p43、p38和p18... 详细信息

氨基酰-tRNA合成酶是一类古老而保守的蛋白质,它们催化蛋白质生物合成的第一步反应.哺乳动物细胞内存在一个由8种氨基酰-tRNA合成酶和3种辅助因子组成的氨基酰-tRNA合成酶复合物.近年来,陆续发现该复合物中的3个辅助因子p43、p38和p18在复合物外的多种生命活动中扮演着重要角色:辅助因子p43是细胞因子内皮单核细胞激活肽Ⅱ的前体,参与了血管生成和细胞凋亡等许多生命过程;辅助因子p38在肺部发育中至关重要,同时它在神经细胞中的不正确积累可能与帕金森病有关.更有趣的是,辅助因子p38和p18可以在时空上高度有序地通过不同的通路参与细胞对DNA损伤的修复.这些研究增加了对于氨基酰-tRNA合成酶和细胞内大分子信号网络之间关系的认识,并将促进对该领域的研究与发展.

关键词：哺乳动物氨基酰-tRNA合成酶辅助因子 DNA损伤修复信号网络

一种简单有效的克隆未知旁侧DNA片段的方法(英文)

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第3期34卷 365-368页

作者：宋保亮戚炜李伯良中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室

操作含长插入片段的DNA克隆时 ,经常需要进行亚克隆和测序实验。通常的方法首先是得到插入片段的限制性内切酶谱 ,然后选择合适的内切酶消化DNA ,分离靶片段 ,将其连接入质粒载体中进行下一步操作。但这种方法工作量大 ,步骤繁琐。在此 ... 详细信息

操作含长插入片段的DNA克隆时 ,经常需要进行亚克隆和测序实验。通常的方法首先是得到插入片段的限制性内切酶谱 ,然后选择合适的内切酶消化DNA ,分离靶片段 ,将其连接入质粒载体中进行下一步操作。但这种方法工作量大 ,步骤繁琐。在此 ,介绍一种不需要做限制性内切酶谱分析 ,而根据靶片段的旁侧序列直接进行亚克隆实验的方法。首先 ,选择合适的限制性内切酶消化含长插入片段的DNA克隆 ,其中一种酶切在已知的旁侧序列上 ,另一为随机选择 ;然后酶切混合物与线性化的质粒载体连接 ,转化细菌得到一“亚克隆库” ;将其中的克隆挑选入 96孔板培养后 ,按行或列混合菌液得到相应的“pool” ;最后 ,用PCR方法筛选获得含靶DNA片段的阳性克隆 ,其中所用的引物一个与已知的旁侧DNA序列配对 ,另一个与质粒载体上序列配对 ,PCR扩增已知的旁侧DNA片段以鉴定阳性克隆。多次独立实验表明该方法简单有效 ,可广泛用于亚克隆和DNA步移实验

关键词：亚克隆筛选步移 ACAT

猴ESc-615基因重组蛋白质片段的表达纯化和多克隆抗体的制备

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第6期34卷 753-747+754-756页

作者：胡志红李彬刘强张永莲中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

ESc 6 15是从猕猴中克隆到的一个在附睾中特异性表达的新基因。为了从蛋白质水平深入研究其在精子成熟中的作用 ,在大肠杆菌中表达了该蛋白质的一条含 310个氨基酸的肽段 ,并用其免疫新西兰大白兔 ,得到了滴度为 10 0 0 0 0的抗血清 ;用... 详细信息

ESc 6 15是从猕猴中克隆到的一个在附睾中特异性表达的新基因。为了从蛋白质水平深入研究其在精子成熟中的作用 ,在大肠杆菌中表达了该蛋白质的一条含 310个氨基酸的肽段 ,并用其免疫新西兰大白兔 ,得到了滴度为 10 0 0 0 0的抗血清 ;用Western印迹方法鉴定发现该抗血清可检测到 3ng的抗原量 ;并在大鼠附睾组织抽提液中检测到一种能与该抗血清作用的大小约 6 3kD的蛋白质 ,此蛋白质大小与作者实验室在大鼠中克隆到的此基因的同源蛋白质相同 ;利用该抗体通过免疫组化分析确定了ESc 6 15为分泌蛋白质 ,并能与精子结合 ;该抗血清经抗原吸附后阳性结果消失。该高滴度多克隆抗体的获得为ESc 6 15功能的探索提供了一条途径。

关键词： ESc-615 附睾重组蛋白质表达多克隆抗体

猪血清转铁蛋白含单一铁结合部位的半分子的制备、鉴定和受体结合能力

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2002年第2期34卷 215-218页

作者：张新堂唐月华冯佑民中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室

用胰蛋白酶水解铁饱和的猪血清转铁蛋白 ,可同时获得含单一铁结合部位的N端和C端半分子。比较了猪血清转铁蛋白及其N端和C端半分子与人胎盘细胞膜转铁蛋白受体的结合能力 ,其受体结合能力依次为 :猪血清转铁蛋白 >C端半分子 >N端半分子

关键词：转铁蛋白半分子受体结合