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肝癌细胞株-乙型肝炎病毒DNA整合事件的高通量靶向捕获测序分析

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陆军军医大学学报 2024年第2期46卷 110-117页

作者：羊泽锐邓海君胡源重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400016

目的采用探针捕获和高通量测序技术研究HepG2.2.15与HepAD38 2个乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)肝癌细胞系中病毒DNA在宿主基因组中的整合位点特征。方法提取HepG2.2.15与HepAD38细胞基因组DNA,采用探针捕获和高通量测序策略对... 详细信息

目的采用探针捕获和高通量测序技术研究HepG2.2.15与HepAD38 2个乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)肝癌细胞系中病毒DNA在宿主基因组中的整合位点特征。方法提取HepG2.2.15与HepAD38细胞基因组DNA,采用探针捕获和高通量测序策略对2个肝癌细胞株中整合的HBV DNA进行捕获测序,使用Trimmomatic、BBAP、BWA(Burrows-Wheeler Aligner)等生物信息学软件进行数据分析;最后通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)及克隆测序对病毒DNA整合特征进行验证。结果利用探针捕获和高通量测序技术分别在HepG2.2.15与HepAD38细胞系中检测出12、7个HBV DNA整合事件,随机分布在chr1、chr2、chr7、chr9、chr16、chr17、chr19、chrX染色体上,整合位点上下游基因出现频率较高的有DPP7、TRIM56、GPC3等。结论成功建立基于探针捕获和高通量测序技术检测HBV DNA在宿主基因组上的整合片段的方法,HepG2.2.15与HepAD38细胞系中HBV整合事件在染色体上随机发生,大部分整合位点发生在HBV基因组上的X基因区域。

关键词：乙型肝炎病毒 HBV整合探针捕获高通量测序克隆测序

卵巢癌结构域蛋白酶-1基因拮抗IFN-α抗病毒效应研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第5期44卷 382-389页

作者：周明慧江彦君宋术义胡源重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400016

目的研究卵巢癌结构域蛋白酶-1(ovarian tumor domain-containing protease-1,OTUD1)基因对Ⅰ型干扰素信号通路的影响以及对IFN-α抗病毒效应的影响。方法双荧光素酶报告试验检测OTUD1基因对IFN-α诱导的干扰素刺激应答元件(interferon-... 详细信息

目的研究卵巢癌结构域蛋白酶-1(ovarian tumor domain-containing protease-1,OTUD1)基因对Ⅰ型干扰素信号通路的影响以及对IFN-α抗病毒效应的影响。方法双荧光素酶报告试验检测OTUD1基因对IFN-α诱导的干扰素刺激应答元件(interferon-stimulated response elements,ISRE)启动子转录活性的影响;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测OTUD1对IFN-α诱导的干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)表达水平的影响;Western blot检测OTUD1对干扰素信号通路关键分子表达的调控作用,qPCR和ELISA检测其对IFN-α抑制乙型肝炎病毒复制的影响。结果在HEK293T和Huh7.0细胞中,OTUD1下调了干扰素信号通路下游的ISRE启动子转录活性以及ISG15和ISG56等抗病毒基因的表达。在HEK293T细胞中,OTUD1降低了磷酸化蛋白质酪氨酸激酶(phospho-Jak1,p-JAK1)的蛋白质表达水平,但是OTUD1酶活突变体C320S不能调控ISGs和p-JAK1的表达。在Huh7.0细胞中,OTUD1降低了IFN-α抑制乙型肝炎病毒复制的效应。结论OTUD1通过其泛素化酶活性下调p-JAK1的蛋白质表达水平,抑制干扰素JAK-STAT信号通路及ISGs表达。OTUD1拮抗IFN-α抑制病毒复制的效应可能与干扰素诱导的JAK-STAT信号通路有关。

关键词：卵巢癌结构域蛋白酶-1(OTUD1) IFN-α JAK-STAT信号通路抗病毒

血小板特异性Rictor敲除抑制小鼠血小板生成和活化及血栓形成

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南方医科大学学报 2024年第8期44卷 1605-1611页

作者：龙清杨峻刘安玲南方医科大学生物化学与分子生物学教研室广东广州510515

目的探究Rictor对血小板活化和血栓形成的影响。方法利用PF4-Cre、Rictorfl/fl转基因小鼠,构建血小板特异性Rictor敲除小鼠和野生型小鼠,分别设为敲除组和对照组(总实验小鼠n=65),用于后续实验。Western blotting检测小鼠Rictor蛋白、... 详细信息

目的探究Rictor对血小板活化和血栓形成的影响。方法利用PF4-Cre、Rictorfl/fl转基因小鼠,构建血小板特异性Rictor敲除小鼠和野生型小鼠,分别设为敲除组和对照组(总实验小鼠n=65),用于后续实验。Western blotting检测小鼠Rictor蛋白、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT的表达水平。血常规检测敲除和对照组小鼠血小板数目。尾静脉出血实验检测敲除和对照小鼠止血功能。构建静脉血栓模型检测Rictor敲除对血栓形成的影响。使用ADP和凝血酶刺激血小板,检测Rictor敲除对血小板聚集的影响。流式细胞术分析敲除组和对照组血小板在静息态和活化态整合素αIIbβ3与CD62P的表达水平。检测血浆中PF4水平。vWF免疫组化标记巨核细胞。用APC-CD41抗体孵育敲除和对照小鼠的巨核细胞,流式细胞术检测细胞倍体。扫描电镜检测敲除和对照组血小板在胶原表面的伸展变化。结果与对照小鼠相比,血小板Rictor特异性敲除小鼠AKT磷酸化降低(P<0.001),血小板生成减少(P<0.05),血栓形成受到抑制(P<0.05),血小板对ADP和凝血酶刺激的活化水平降低(P<0.01),P-选择素蛋白表达水平(P<0.05)、整合素αIIbβ3活化程度(P<0.01)受到抑制,血小板伸展受到抑制(P<0.01),PF4的血浆含量降低(P<0.05),骨髓中巨核细胞数量减少(P<0.01),倍体降低(P<0.05),前血小板平均面积减少(P<0.01)。结论血小板特异性敲除Rictor抑制血小板生成和活化,进而减少血栓形成。抑制mTORC2活性可能是一种潜在的抗血栓靶标。

关键词： Rictor 血小板血栓形成

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肌肽通过AMPK/mTOR信号通路抑制自噬对氧糖剥夺/复糖复氧诱导星形胶质细胞损伤的保护作用

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吉林大学学报（医学版） 2024年第5期50卷 1297-1304页

作者：王宇彤冉睿黎边疆姜晓涵宋俊秋王德威杨菁锦州医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室辽宁锦州121001

目的:探讨肌肽(CAR)对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导的星形胶质细胞(AS)损伤的改善作用,并阐明其可能的作用机制。方法:将AS分为对照组、模型组(OGD/R组)、OGD/R+CAR组(CAR组)和OGD/R+CAR+腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活剂AICAR组(CAR+AICA... 详细信息

目的:探讨肌肽(CAR)对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)诱导的星形胶质细胞(AS)损伤的改善作用,并阐明其可能的作用机制。方法:将AS分为对照组、模型组(OGD/R组)、OGD/R+CAR组(CAR组)和OGD/R+CAR+腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活剂AICAR组(CAR+AICAR组)。MTT法和绿菁染色检测各组AS存活率和绿菁染色阳性细胞率,AnnexinⅤ-FITC/PI法流式细胞术检测各组AS凋亡率,Western blotting法检测各组AS中AMPK、磷酸化AMPK (p-AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR (p-mTOR)、微管相关蛋白轻链3B (LC3B)、Beclin-1和P62蛋白表达水平,免疫荧光染色法观察各组AS中LC3B阳性荧光强度。结果:与对照组比较,OGD/R组AS存活率和绿菁染色阳性细胞率明显降低(P<0.01),AS凋亡率明显升高(P<0.01), AS中p-AMPK/AMPK和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值及Beclin-1蛋白表达水平明显升高(P<0.01),p-mTOR/mTOR比值及P62蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与OGD/R组比较,CAR组AS存活率和绿菁染色阳性细胞率明显升高(P<0.01),AS凋亡率明显降低(P<0.01),AS中p-AMPK/AMPK和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值及Beclin-1蛋白表达水平明显降低(P<0.01),p-mTOR/mTOR比值和p62蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。与CAR组比较,CAR+AICAR组AS存活率和绿菁染色阳性细胞率明显降低(P<0.01),AS凋亡率升高(P<0.01)、AS中p-AMPK/AMPK和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值及Beclin-1蛋白表达水平明显升高(P<0.01),p-mTOR/mTOR比值和P62蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。LC3B免疫荧光染色结果与Westernblotting法检测结果趋势一致。结结论论:CAR对OGD/R所致AS损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制AMPK/mTOR信号途径,进而抑制细胞自噬有关。

关键词：肌肽自噬星形胶质细胞腺苷酸活化蛋白激酶哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

KIAA0753减缓糖尿病抑制的成骨细胞糖代谢和能量代谢

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陆军军医大学学报 2024年第20期 2291-2300页

作者：李梦雪王吉春李乐泰汪长东重庆医科大学基础医学院分子医学与肿瘤研究中心重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室

目的探讨KIAA0753对成骨细胞MC3T3-E1糖代谢及能量代谢的影响。方法由基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)获取Joubert综合征患者基因表达数据集GSE182286并对其进行分析。构建KIAA0753过表达载体，实验分为对照组、高... 详细信息

目的探讨KIAA0753对成骨细胞MC3T3-E1糖代谢及能量代谢的影响。方法由基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)获取Joubert综合征患者基因表达数据集GSE182286并对其进行分析。构建KIAA0753过表达载体，实验分为对照组、高糖组和高糖+过表达KIAA0753组，采用Western blot检测在高糖条件下KIAA0753对MC3T3-E1细胞糖代谢相关蛋白糖原合酶1(glycogen synthase 1, GYS1)、糖原磷酸化酶L(glycogen phosphorylase L, PYGL)、葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter type 4, GluT4)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase muscle, PFKM)、丙酮酸脱氢酶磷酸酶1(pyruvate dehydrogenase phosphatase 1, PDP1)、乙酰辅酶A羧化酶α(acetyl-CoA carboxylase α, ACACA),以及线粒体相关蛋白过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α, PGC-1α)、核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1, NRF1)、线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)的影响；通过检测细胞培养基中葡萄糖含量、细胞内的糖原含量和乳酸含量评估KIAA0753对糖代谢中间产物的影响；采用细胞免疫荧光和ATP含量检测KIAA0753对线粒体活性及功能的影响；采用EdU染色检测KIAA0753对成骨细胞MC3T3-E1增殖的影响。结果 KIAA0753在Joubert综合症患者和高糖条件下表达下调(P<0.05)。高糖抑制蛋白GYS1、ACACA、PFKM、GluT4、PGC-1α、TFAM和NRF1的表达，促进蛋白PDP1和PYGL的表达，减少糖原生成和细胞外葡萄糖的消耗，促进乳酸生成，而过表达KIAA0753后减缓了高糖的作用，促进蛋白GYS1、ACACA、PFKM、GluT4、PGC-1α、TFAM和NRF1的表达，抑制蛋白PDP1和PYGL的表达，增加糖原生成和细胞外葡萄糖的消耗，抑制乳酸生成(P<0.05)。与高糖组相比，过表达KIAA0753在高糖条件下显著提升MC3T3-E1细胞线粒体的活性和膜电位，促进ATP的合成(P<0.05),促进MC3T3-E1细胞的增殖(P<0.05)。结论 KIAA0753能够促进成骨细胞的糖代谢并提升线粒体活性和功能，从而为机体提供更多能量。

关键词： Joubert综合征成骨细胞 KIAA0753 糖代谢线粒体 ATP

沉默FOXK1基因对胃癌HGC-27细胞增殖、迁移和侵袭的影响

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吉林大学学报（医学版） 2024年第2期50卷 371-378页

作者：陈爽李红锦州医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室辽宁锦州121000

目的:探讨沉默叉头框K1(FOXK1)对胃癌HGC-27细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并阐明其可能的机制。方法:基于基因表达水平值的交互式分析平台(GEPIA)数据库查询在胃癌组织和正常胃组织中FOXK1 mRNA表达水平;利用化学合成的si-FOXK1体外转染... 详细信息

目的:探讨沉默叉头框K1(FOXK1)对胃癌HGC-27细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并阐明其可能的机制。方法:基于基因表达水平值的交互式分析平台(GEPIA)数据库查询在胃癌组织和正常胃组织中FOXK1 mRNA表达水平;利用化学合成的si-FOXK1体外转染胃癌HGC-27细胞,实验分为空白对照组、nc-FOXK1组和si-FOXK1组,采用Western blotting法评估各组的转染效率,MTT法检测si-FOXK1转染后各组胃癌HGC-27细胞的增殖能力,克隆形成实验检测si-FOXK1转染后各组胃癌HGC-27细胞的克隆形成数,细胞划痕实验检测si-FOXK1转染后各组胃癌HGC-27细胞的迁移率,Transwell小室实验检测si-FOXK1转染后各组胃癌HGC-27细胞的细胞迁移数和细胞侵袭数,Western blotting法检测si-FOXK1转染后各组胃癌HGC-27细胞中核因子κB(NF-κB)通路相关蛋白[NF-κB p65和磷酸化核因子κB p65(p-NF-κB p65)]的表达水平。结果:GEPIA数据库查询,在胃癌组织中FOXK1 mRNA表达水平高于正常胃组织(P室实验检测,与空白对照组和nc-FOXK1组比较,si-FOXK1组胃癌HGC-27细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数明显减少(P<0.05);Western blotting法检测,与空白对照组和nc-FOXK1组比较,si-FOXK1组胃癌HGC-27细胞中p-NF-κB p65蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:FOXK1在胃癌HGC-27细胞中高表达,沉默FOXK1可抑制胃癌HGC-27细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其作用机制可能与NF-κB通路有关。

关键词：叉头框K1 胃肿瘤细胞增殖细胞迁移细胞侵袭核因子κB

氨基酸代谢在非酒精性脂肪性肝病中的作用机制

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临床肝胆病杂志 2024年第4期40卷 810-815页

作者：张慧谭明程胜桃陈娟重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆010000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球最普遍的慢性肝病之一,影响全球约1/4的人口,预计到2030年将成为肝移植的主要适应证。NAFLD可导致包括支链氨基酸在内的多种氨基酸水平显著异常,进而促进NAFLD的发生发展。提示除葡萄糖代谢和脂质代谢外... 详细信息

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球最普遍的慢性肝病之一,影响全球约1/4的人口,预计到2030年将成为肝移植的主要适应证。NAFLD可导致包括支链氨基酸在内的多种氨基酸水平显著异常,进而促进NAFLD的发生发展。提示除葡萄糖代谢和脂质代谢外,氨基酸代谢也在NAFLD疾病进展中发挥了重要作用。为系统了解氨基酸代谢在NAFLD中的作用及其机制,本文针对氨基酸代谢在NAFLD中的研究进展进行了综述。拟探讨氨基酸代谢在NAFLD疾病进展中发挥的作用及其相关机制,为临床防治提供思路和理论依据。

关键词：非酒精性脂肪性肝病氨基酸类代谢组学

琐琐葡萄多糖对Aβ诱导HT22细胞氧化损伤的改善作用

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海南医学院学报 2024年

作者：马心念高培吴妍陈财井维鑫袁芳新疆医科大学基础医学院生物学教研室新疆医科大学新疆地方病分子生物学重点实验室

目的:探讨脱蛋白后琐琐葡萄多糖（DVTP）对Aβ1-42诱导的阿尔兹海默症细胞模型氧化损伤的影响。方法:将HT22细胞分为对照组，模型组(Aβ1-42)及Aβ1-42+DVTP（20、40、80 μg/mL）组，使用CCK8检测细胞存活率，在光镜、透射电镜下观察... 详细信息

目的:探讨脱蛋白后琐琐葡萄多糖（DVTP）对Aβ1-42诱导的阿尔兹海默症细胞模型氧化损伤的影响。方法:将HT22细胞分为对照组，模型组(Aβ1-42)及Aβ1-42+DVTP（20、40、80 μg/mL）组，使用CCK8检测细胞存活率，在光镜、透射电镜下观察细胞形态和线粒体结构变化，DCFH-DA和JC-10荧光探针法测定细胞中活性氧（ROS）及线粒体膜电位水平，同时利用RT-qPCR和Western blot分析Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC的mRNA和蛋白表达水平。结果:与对照组相比，模型组细胞存活率下降，细胞形态及线粒体结构损伤程度较高；ROS水平升高，线粒体膜电位下降；Keap1 mRNA及蛋白表达水平升高，Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC表达水平降低。同模型组相比，DVTP预处理后细胞存活率显著提升，细胞形态及线粒体结构损伤程度较低；ROS水平降低，线粒体膜电位升高；Keapl mRNA及蛋白表达水平下降，Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC表达水平升高。结论 : DVTP可通过调节抗氧化酶的表达水平改善Aβ1-42诱导的氧化损伤，有望成为一种治疗AD的候选药物。

关键词：琐琐葡萄多糖阿尔兹海默症氧化应激

FAK抑制剂PF-562271减轻老化血小板诱导的人脐静脉内皮细胞损伤

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南方医科大学学报 2024年第2期44卷 252-259页

作者：白钰婷刚保才张梦洁万子雨刘国权顾玮蚌埠医科大学癌症转化医学安徽省重点实验室安徽蚌埠233000 蚌埠医科大学检验医学院生物化学与分子生物学教研室安徽蚌埠233000

目的探究FAK抑制剂对老化血小板诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用。方法实验分为空白对照组、脂多糖(LPS)组、造模组(LPS+Plt)和FAK抑制剂PF-562271组(LPS+Plt+PF-562271)。通过Western blot和免疫荧光检测FAK、pFAK和PECA... 详细信息

目的探究FAK抑制剂对老化血小板诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用。方法实验分为空白对照组、脂多糖(LPS)组、造模组(LPS+Plt)和FAK抑制剂PF-562271组(LPS+Plt+PF-562271)。通过Western blot和免疫荧光检测FAK、pFAK和PECAM-1的蛋白表达。流式细胞术检测HUVEC活性氧(ROS)含量。细胞通透性和跨内皮细胞电阻实验,检测HUVEC屏障功能的变化。RT-qPCR检测炎性因子mRNA表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液中,炎性因子的分泌情况。免疫荧光检测加入ROS抑制剂维生素C(Vit.C)后,PECAM-1的表达。结果脂多糖和老化血小板处理后,FAK、pFAK和PECAM-1的蛋白表达增高,加入PF-562271后,FAK、pFAK和PECAM-1的蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。流式细胞术结果显示,脂多糖和老化血小板可促进ROS的释放,而加入PF-562271后,ROS释放减少(P<0.001)。脂多糖和老化血小板导致内皮细胞屏障受损,PF-562271可缓解内皮细胞屏障功能的损伤(P<0.01)。脂多糖和老化血小板促进内皮细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8的表达,PF-562271可降低炎症因子的表达(P<0.05)。加入维生素C后,PECAM-1蛋白表达降低(P<0.01)。结论FAK抑制剂PF-562271可通过改善氧化应激水平和降低炎症反应,缓解脂多糖和老化血小板诱导的内皮细胞损伤。

关键词： TRALI PF-562271 FAK PECAM-1 老化的血小板人脐静脉内皮细胞