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中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品的研制

中国药学杂志 2013年第1期48卷 68-72页

作者：王兰高凯范文红毕华付志浩李永红饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定法及其标准化重点实验室北京100050

目的建立中国仓鼠卵巢细胞DNA残留量定量测定用国家标准品。方法使用QIAGEN Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备了中国仓鼠卵巢细胞基因组DNA作为标准品原料,通过紫外分光光度法和电泳进行纯度和含量测定后分装,采用紫外分光... 详细信息

目的建立中国仓鼠卵巢细胞DNA残留量定量测定用国家标准品。方法使用QIAGEN Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备了中国仓鼠卵巢细胞基因组DNA作为标准品原料,通过紫外分光光度法和电泳进行纯度和含量测定后分装,采用紫外分光光度法对我国第一批中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品进行协作标定,并评价其稳定性和适用性。结果中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品经检测,A260/A280均在1.7～1.9之间,电泳图谱只有单一条带,符合规定。该标准品经6家实验室协作标定共90次,几何平均含量为93.63μ***-1,平均含量的95%可信区间为92.86～94.40μ***-1,单次测定的95%参考值范围为86.51～100.89μ***-1,平均可信限率为0.81%。加速热稳定实验表明,该标准品在-20、4、25、37℃条件下放置4个月,DNA含量无明显改变,但37℃条件下A260/A280有下降趋势;-20、4、25℃条件下电泳结果为单一条带,37℃条件下DNA有降解条带。-20℃贮存1年的长期稳定性结果显示,标准品DNA浓度及A260/A280无显著性差异,电泳条带单一,因此-20℃条件下长期保存标准品稳定性较好。在标准品适用性研究中,利用该标准品进行荧光染色法测定,标准曲线r值为0.999 0以上,在0.781～100 ***-1之间线性良好,各稀释度RSD均小于10%;利用该标准品进行定量PCR法测定,标准曲线r值为0.990 0以上,在10-2～103pg之间线性良好,熔解曲线可见单一峰出现。结论该批中国仓鼠卵巢细胞DNA国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品用于荧光染色法和定量PCR检测中国仓鼠卵巢细胞DNA残留量,含量定为93.63μ***-1,批号为270026-201101。

关键词：中国仓鼠卵巢细胞DNA 国家标准品 DNA残留量荧光染色法定量聚合酶链式反应法

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致病性钩端螺旋体的多位点序列分型研究

中国人兽共患病学报 2022年第2期38卷 95-101页

作者：李喆张影杜宗利辛晓芳叶强徐颖华中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

目的通过对致病性钩端螺旋体(简称钩体)多位点序列分型(MLST)分析,了解国内与全球致病性钩体种群结构及其分子进化。方法应用16S rRNA基因测序和MLST分析方法对不同来源、不同时期国内钩体分离菌株与国际参考菌株进行分析,并与国内7株... 详细信息

目的通过对致病性钩端螺旋体(简称钩体)多位点序列分型(MLST)分析,了解国内与全球致病性钩体种群结构及其分子进化。方法应用16S rRNA基因测序和MLST分析方法对不同来源、不同时期国内钩体分离菌株与国际参考菌株进行分析,并与国内7株疫苗株结果平行比较,同时收集已公开的来自不同国家和不同时期1238株致病性钩体的基因种与MLST数据进行种群结构分析。结果16S rRNA基因测序分析结果显示7株钩体国际参考菌株和47株国内菌株基因种主要为问号基因种,分别占比71.4%和59.6%。7株国际参考菌株呈现7种不同ST型。而在47株中国钩体分离株中,发现15种ST型及24种尚未报道的新ST型。MLST聚类分析发现问号、波氏和卫氏基因种菌株均各自形成单独分支。7株不同ST的疫苗株也位于问号基因种内不同亚分支中。系统发育进化树表明世界范围内近百年分离的1238株钩体菌株主要包括16个进化簇,分别为ST17、ST34、ST149、ST1和ST37等,而中国236株钩体菌株可分为4个主要进化簇,主要流行基因型为ST1、ST128、ST17和ST143;不同国家流行菌株的基因种和ST型不尽相同。致病性钩体可在不同宿主物种广泛地交叉感染,不同国家间相互传播。结论获得我国致病性钩体基因种和MLST基因多态性资料,并系统地了解国内和全球致病性钩体种群结构和遗传进化关系,为后续致病性钩体监测和溯源提供科学指导。

关键词：致病性钩体多位点序列分型 16S rRNA基因测序进化簇系统发育

国产重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子原液中制品相关蛋白的定性定量分析

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药物分析杂志 2018年第11期38卷 1875-1880页

作者：陶磊韩春梅刘兰史新昌饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:分析鉴定国产重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子原液中的制品相关蛋白,为《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)标准提高提供依据。方法:采用欧洲药典方法测定所征集的样品中制品相关蛋白的含量;采用液相质谱联用法对制... 详细信息

目的:分析鉴定国产重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子原液中的制品相关蛋白,为《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)标准提高提供依据。方法:采用欧洲药典方法测定所征集的样品中制品相关蛋白的含量;采用液相质谱联用法对制品相关蛋白进行鉴定,色谱柱为Waters BEH300 C4(2.1 mm×150 mm,1.7μm),以0.1%的三氟乙酸水溶液(A)-0.1%的三氟乙酸90%乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱,流速0.2 mL·min^(-1)。质谱仪采用Waters公司Xevo G2-S质谱仪,正离子电喷雾离子源,毛细管电压3.0 kV,Cone电压40 V,去溶剂气体温度350℃,去溶剂气体流速800 L·h^(-1),扫描范围(m/z):500～3 000。结果:对4家生产企业的7批原液进行了检测,其中3家企业的5批原液符合欧洲药典标准,2家企业的2批原液不符合欧洲药典标准;相对分子质量测定结果显示,样品中普遍存在的制品相关蛋白为氧化形式及乙酰化形式,个别批次中存在相对分子质量不一的肽段。结论:本次征集的样品有71%符合欧洲药典标准,可以考虑将制品相关蛋白检测纳入新版《中国药典》,以提高国产重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的产品质量。

关键词：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子制品相关蛋白原液欧洲药典质量标准

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基因治疗产品中病毒颗粒的微粒特性研究

药物分析杂志 2020年第1期40卷 62-69页

作者：于雷裴德宁王光裕胡金盼李永红饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:研究基因治疗产品中病毒颗粒的微粒特性及粒径分布情况。方法:采用扫描电镜、动态光散射法、微流数字成像法、光阻法及目测法对腺病毒(adenovirus,AdV)、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)和单纯疱疹病毒(herpes simplex vir... 详细信息

目的:研究基因治疗产品中病毒颗粒的微粒特性及粒径分布情况。方法:采用扫描电镜、动态光散射法、微流数字成像法、光阻法及目测法对腺病毒(adenovirus,AdV)、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)和单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)基因治疗产品中病毒颗粒的微粒特性、粒径分布及制剂外观进行观察研究。结果:扫描电镜结果显示,AdV、AAV、HSV均存在不完整颗粒(空心病毒颗粒、衣壳碎片),HSV病毒存在包膜脱落或融合的情况;动态光散射法结果显示AdV对温度敏感,易形成聚集体,AAV的粒径分布不均一,变异度大,HSV实测粒径偏大且分布不均一;微流数字成像法、光阻法及目测法结果提示样品中存在的50μm以上的微粒,与典型的蛋白聚集体形态相似,且50μm以上的颗粒数与液体的浊度呈正相关,100μm以上颗粒与絮状沉淀物相关。结论:不同病毒的微粒特性也不相同,微粒分布情况及动态变化过程与聚集体的形成有关,可采用多种方法优势互补,对微粒进行全范围监测。

关键词：基因治疗产品病毒颗粒微粒特性聚集体不溶性微粒可见异物

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重组人抗血栓蛋白质控方法和质量标准研究

中国新药杂志 2014年第19期23卷 2238-2241+2245页

作者：丁有学韩春梅李响毕华史新昌饶春明中国食品药品检定研究院重组药物室卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室

目的:建立重组人抗血栓蛋白(recombinant human antithrombus protein,rHAP)的质控方法和质量标准。方法:采用活化部分凝血活酶时间法(APTT法)测定生物学活性;还原型SDS-PAGE测定相对分子质量;非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度... 详细信息

目的:建立重组人抗血栓蛋白(recombinant human antithrombus protein,rHAP)的质控方法和质量标准。方法:采用活化部分凝血活酶时间法(APTT法)测定生物学活性;还原型SDS-PAGE测定相对分子质量;非还原SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度;胰蛋白酶酶切后用反相高效液相色谱法分析肽图;其余检测项目按2010年版《中华人民共和国药典》三部规定进行。结果:用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和2010年版《中华人民共和国药典》三部的要求。结论:建立的质控方法和质量标准能够保证产品安全、有效、质量可控,可用于注射用重组人抗血栓蛋白产品的常规检定。

关键词：重组人抗血栓蛋白质量控制生物学活性纯度肽图

U-2 OS细胞/CCK-8法测定1型单纯疱疹病毒溶瘤活性

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药物分析杂志 2020年第1期40卷 31-36页

作者：胡金盼李永红史新昌李响于雷郑红梅饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:建立U-2 OS细胞/CCK-8比色法,用于测定1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)溶瘤活性。方法:选择3株对HSV-1敏感的的细胞株,在细胞培养板上以梯度浓度的HSV-1感染一定时间后,加入CCK-8进行显色,用酶标仪检测后采用... 详细信息

目的:建立U-2 OS细胞/CCK-8比色法,用于测定1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)溶瘤活性。方法:选择3株对HSV-1敏感的的细胞株,在细胞培养板上以梯度浓度的HSV-1感染一定时间后,加入CCK-8进行显色,用酶标仪检测后采用四参数曲线法进行量效关系拟合。在选择出量效关系最好的细胞株基础上,对方法的各项实验条件进行优化,并采用活性测定标准品对结果进行校正分析。对建立的方法初步验证准确性和精密度,并用上述方法对3批样品的溶瘤活性进行检测。结果:优化后的实验采用U-2 OS细胞株,1∶4的样品系列稀释比例,5×10^4 PFU·mL^-1的样品系列稀释初始浓度,每孔2.5×10^4个细胞的铺板数量,72 h感染时间和4 h CCK-8试剂反应时间等条件进行样品测定,得到的四参数方程拟合的量效关系曲线R^2大于0.99,信噪比较高,初步验证结果显示该方法的回收率为113.4%,日间精密度分析的几何变异系数(GCV)为21.8%。3批测试样品的溶瘤活性分别为3.52×10^3、3.93×10^4和1.61×10^5 U·mL^-1。结论:建立的U-2 OS细胞/CCK-8法可用于以HSV-1为载体的基因治疗药物溶瘤活性测定。

关键词： 1型单纯疱疹病毒(HSV-1) 溶瘤活性标准品校正量效关系拟合四参数曲线法 U-2 OS细胞 CCK-8显色法

复制型慢病毒VSV-G qPCR检测方法的验证及初步应用

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中华微生物学和免疫学杂志 2021年第7期41卷 538-544页

作者：吴雪伶赵翔孟淑芳中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的建立复制型慢病毒(replication competent lentivirus,RCL)VSV-G qPCR检测方法,并进行方法学性能验证及初步应用。方法以慢病毒载体包膜VSV-G基因为目标序列,建立荧光定量PCR检测方法,并对方法的专属性、线性、扩增效率、精密度、... 详细信息

目的建立复制型慢病毒(replication competent lentivirus,RCL)VSV-G qPCR检测方法,并进行方法学性能验证及初步应用。方法以慢病毒载体包膜VSV-G基因为目标序列,建立荧光定量PCR检测方法,并对方法的专属性、线性、扩增效率、精密度、准确度、线性范围、检测限、定量限及耐用性进行验证。利用所建立的方法进行CAR-T细胞、慢病毒载体生产终末细胞及慢病毒载体收获液样品的初步应用性研究。结果建立的VSV-G荧光定量PCR法,专属性较好,对293T细胞、PBMC细胞及C8166细胞均无特异性扩增,线性范围为1×10^(2)拷贝/test~1×10^(9)拷贝/test,R2能够达到0.998以上,扩增效率在93%~98%之间,精密度RSD方法的耐用性较好。各项验证结果均表明该方法能够满足检测的要求。利用该方法对54批样品(包括CAR-T细胞、慢病毒载体及载体生产终末细胞)进行RCL C8166细胞培养法的终点检测,结果显示54批样品均为阴性。结论成功建立了VSV-G实时荧光定量PCR法,各项验证参数均可满足检测要求,该方法的应用将进一步提高慢病毒载体相关产品的安全性。

关键词：复制型慢病毒 VSV-G 嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

吸附破伤风疫苗效价测定方法比较及发展趋势分析

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中国药学杂志 2013年第13期48卷 1041-1044页

作者：董国霞马霄田霖谭亚军侯启明中国食品药品检定研究院百白破疫苗与毒素室卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的了解目前吸附破伤风疫苗效价测定采用的方法、最新的研究进展及其发展趋势。方法主要以中国、欧洲、英国、日本和印度药典、WHO百白破疫苗质量控制指南、美国采用的方法及国内外该领域的文献为依据,进行归纳、总结和分析。结果与... 详细信息

目的了解目前吸附破伤风疫苗效价测定采用的方法、最新的研究进展及其发展趋势。方法主要以中国、欧洲、英国、日本和印度药典、WHO百白破疫苗质量控制指南、美国采用的方法及国内外该领域的文献为依据,进行归纳、总结和分析。结果与结论吸附破伤风疫苗效价测定方法在不久的将来可能以完全体外检测代替体内检测,进行相关方面的研究已经成为当务之急。

关键词：吸附破伤风疫苗效价测定方法比较发展趋势分析

生产用细胞基质中猪细小病毒污染检测方法的建立及应用

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中华微生物学和免疫学杂志 2015年第4期35卷 127-132页

作者：吴雪伶樊金萍冯建平赵翔孟淑芳中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心、卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的：建立生产用细胞基质中猪细小病毒（ porcine parvovirus，PPV）污染的检测方法，并进行方法学性能验证分析及初步应用。方法针对编码非结构蛋白NS1保守序列设计引物和探针，建立荧光定量PCR方法，对方法的线性、精密度、最低检出... 详细信息

目的：建立生产用细胞基质中猪细小病毒（ porcine parvovirus，PPV）污染的检测方法，并进行方法学性能验证分析及初步应用。方法针对编码非结构蛋白NS1保守序列设计引物和探针，建立荧光定量PCR方法，对方法的线性、精密度、最低检出限等参数进行验证，并分析待测样品对试验的干扰。将PPV毒种感染ST细胞，制备病毒。以ST细胞为敏感细胞，建立PPV ST细胞感染性试验，并将ST细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合，建立ST细胞感染-PCR法，分析感染-PCR方法的灵敏度。利用所建立的方法进行生产用细胞样本的初步应用研究。结果 PPV荧光定量PCR法的特异性较好，与其他种属的细小病毒、猴SV40病毒及其他猪源病毒无明显的交叉反应，在109～104拷贝／μl范围内线性较好，R2达到0．98以上，灵敏度为1×10^4拷贝／μl，试验内和试验间的Ct的精密度均＜5％，试验内病毒定量拷贝数的精密度为5％～15％，试验间为30％～40％，最低感染性病毒滴度检测限为1CCID50／ml。待测细胞样品成分对病毒检测无明显的干扰性。 ST细胞感染-PCR法的灵敏度为0．01CCID50／ml。利用荧光定量PCR法对22份细胞样品进行检测，结果均为阴性。结论成功建立了PPV荧光定量PCR检测法及ST细胞感染-PCR法，能够用于细胞中PPV的检测，有助于进一步提高生产用或治疗用细胞的安全性。

关键词：猪细小病毒荧光定量PCR ST细胞感染性试验感染-PCR

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