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人间充质干细胞体外成软骨分化能力综合评价策略研究

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中国新药杂志 2017年第18期26卷 2196-2203页

作者：张可华刘静纳涛袁宝珠中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心

目的:探索人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)成软骨细胞诱导分化能力评价技术和评价策略,为hMSCs生物学有效性体外评价提供方法学参考。方法:高密度体外接种hMSCs,促使其形成软骨样3D微球结构,并在此基础上对其成软... 详细信息

目的:探索人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)成软骨细胞诱导分化能力评价技术和评价策略,为hMSCs生物学有效性体外评价提供方法学参考。方法:高密度体外接种hMSCs,促使其形成软骨样3D微球结构,并在此基础上对其成软骨细胞诱导分化能力进行评价。评价内容有:(1)微球的自发形成能力以及成软骨诱导分化过程中外观形态学分析。(2)以阿辛蓝及番红O染色为基础的组织结构分析,用于软骨细胞外基质形成能力分析。(3)通过Real-time PCR对软骨细胞特定基因(ACAN,COL1A2,COL2A1,COL10A1和MIA)表达水平的分析。在对以上评价结果综合分析和软骨组织学方法验证的基础上,对hMSCs体外成软骨细胞诱导分化能力进行综合准确评价。结果:具备软骨细胞诱导分化能力的hMSCs可表现为:(1)具有自发形成软骨样细胞微球能力,并在诱导分化过程中形成白色光滑致密软骨样结构,阿辛蓝染色呈深蓝色。(2)组织学上可观察到细胞微球外周呈同心圆排列的软骨细胞外基质层。(3)成软骨诱导分化过程中软骨细胞特定基因表达显著上调。不同hMSCs在上述三方面的综合特性上存在较大差异。结论:对hMSCs成软骨细胞诱导分化过程中的形态学、组织学和特定基因表达水平的检测较单一方法的检测能够更加客观准确地评价hMSCs的成软骨细胞分化能力。

关键词：间充质干细胞质量评价生物学有效性诱导分化

人间充质干细胞调控Treg细胞功能评价方法和质量标准的研究

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中国新药杂志 2021年第17期30卷 1605-1615页

作者：韩晓燕纳涛吴婷婷袁宝珠中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心

目的:建立人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)调控调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)功能的标准评价方法和相关质量属性标准。方法:利用hMSCs与同种异体人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)共培养技术、流式细胞技术,和hMSCs生物学有效性质量属性研究用标准细胞株CCRC-hMSC-S1(CCRC1),建立hMSCs调控Treg功能的标准评价技术,并对不同来源hMSCs调控Treg功能的质量属性标准进行研究。结果:确立不同来源hMSCs促进Treg增殖的初级质量属性标准值为(47.9±23.3)%;不同研发者、不同组织来源、不同代次的hMSCs在调控Treg功能方面存在一定差异;不同培养基条件对相关功能影响也较大。结论:通过建立标准化评价方法,在国际上首次提出了hMSCs调控Treg功能的初级质量属性标准,而基于标准评价方法和初级质量属性标准的标准化评价体系,可量化、客观地评价不同来源、不同工艺情况下hMSCs调控Treg的功能。

关键词：间充质干细胞调节性T细胞质量评价评价方法质量属性标准

人间充质干细胞生物学有效性质量评价用标准细胞株CCRC-hMSC-S1的建立及评价

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中国新药杂志 2020年第21期29卷 2502-2510页

作者：张可华纳涛韩晓燕吴婷婷张丽霞陈平赵楠袁宝珠中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心

目的:生物学有效性评价是人间充质干细胞(human mesenchymal stem cell,h MSCs)质量评价的重要组成部分。本研究尝试建立一株h MSCs标准细胞,用于h MSCs生物学有效性质量研究和质量标准制定。方法:对多株符合现阶段基本质量要求的hMSCs... 详细信息

目的:生物学有效性评价是人间充质干细胞(human mesenchymal stem cell,h MSCs)质量评价的重要组成部分。本研究尝试建立一株h MSCs标准细胞,用于h MSCs生物学有效性质量研究和质量标准制定。方法:对多株符合现阶段基本质量要求的hMSCs诱导分化功能和免疫调控功能进行综合评价,选择各项质量属性均具有代表性的细胞株作为标准h MSCs细胞株。研究其传代稳定性、冻存复苏稳定性,确立该细胞成骨诱导分化功能和Th1淋巴细胞增殖抑制功能的标准值。结果:本研究确立了CCRC-hMSC-S1作为标准hMSCs细胞株,该细胞株相关活性在第10～20代次传代过程和在2年间液氮冻存和复苏过程中均具有明确的稳定性;通过多次独立检测,可确定该细胞成骨诱导分化功能和Th1淋巴细胞增殖抑制功能的标准值;应用该细胞株作为h MSCs生物学有效性评价用标准对照细胞,可判断相关质量评价试验是否成立,也可对所评价细胞质量属性结果进行合理校正,以保障评价结果的准确性和可比性。结论:CCRC-hMSC-S1在多种hMSCs生物学有效性质量属性方面具有明确的代表性和稳定性,经实践证明可作为不同hMSCs相关生物学有效性评价用标准细胞株,并可为未来全面的hMSCs质量标准研究、标准制定奠定坚实基础。

关键词：间充质干细胞标准细胞生物学有效性质量评价质量标准

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人间充质干细胞生物学有效性的质量评价

中国新药杂志 2018年第21期27卷 2511-2518页

作者：韩晓燕纳涛张可华袁宝珠中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏及研究中心

人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,h MSCs)是一类存在于不同组织间质或血管周围、形态类似于成纤维细胞的成体干细胞。hMSCs具有独特的、与治疗疾病密切相关的生物学有效性(biological effectiveness),因此已成为临床研究... 详细信息

人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,h MSCs)是一类存在于不同组织间质或血管周围、形态类似于成纤维细胞的成体干细胞。hMSCs具有独特的、与治疗疾病密切相关的生物学有效性(biological effectiveness),因此已成为临床研究中发展最为迅速的一类干细胞。其生物学有效性可归为三大类:多向分化潜能、免疫调控功能和组织再生功能,而每一类别中又含有细化的内容(或质量属性)。生物学有效性是临床前研究阶段hMSCs产品综合质量评价的重要内容,而相关质量评价的目的是用于预测或确保相关产品临床治疗有效性的重要依据。由于如何有效预测干细胞临床治疗的有效性是影响其产品研发的重要瓶颈因素,因此对hMSCs"生物学有效性"的评价在其产品研发中变得非常重要。本文首先总结了目前国际上有关hMSCs生物学有效性相关质量属性的共识,进而提出了一些有效评价hMSCs生物学有效性不同方面的评价技术和评价策略,以帮助建立综合性hMSCs生物学有效性质量评价技术体系。

关键词：间充质干细胞生物学有效性关键质量属性质量控制评价技术

表达荧光素酶的胰腺癌细胞系的建立及其在免疫细胞杀伤效力检测中的应用

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第1期44卷 58-66页

作者：梁谦许崇凤李国亚张丽霞吴雪伶周小雅孟淑芳中国食品药品检定研究院生物制品检定研究所细胞资源保藏研究中心北京102600

目的构建表达报告基因荧光素酶和肿瘤相关抗原间皮素(mesothelin,MSLN)基因的胰腺癌细胞系,评估其作为靶细胞在评价免疫细胞的肿瘤杀伤效力中的应用。方法构建表达荧光素酶、MSLN基因的慢病毒载体,包装慢病毒,感染胰腺癌细胞系,抗生素... 详细信息

目的构建表达报告基因荧光素酶和肿瘤相关抗原间皮素(mesothelin,MSLN)基因的胰腺癌细胞系,评估其作为靶细胞在评价免疫细胞的肿瘤杀伤效力中的应用。方法构建表达荧光素酶、MSLN基因的慢病毒载体,包装慢病毒,感染胰腺癌细胞系,抗生素筛选后,有限稀释法获得单细胞克隆,并验证目的基因的稳定表达。实时无标记细胞分析(real-time cell analysis,RTCA)和荧光素酶活性检测方法体外检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效力。将构建的细胞系接种B-NDG小鼠建立表达荧光素酶的胰腺癌肿瘤模型,利用活体成像技术检测荧光素酶表达水平,监测小鼠体内胰腺癌肿瘤生长情况。在胰腺癌小鼠模型中验证嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞的肿瘤杀伤能力。结果本研究建立了稳定表达荧光素酶和MSLN基因的胰腺癌细胞系panc-1-luc、panc-1-luc-MSLN和capan-2-luc细胞。3种细胞的报告基因表达水平较高,与细胞数量呈正相关,panc-1-luc-MSLN细胞的MSLN阳性率达95.6%。体外肿瘤细胞杀伤试验结果表明MSLN-CAR-T细胞能特异性杀伤MSLN抗原阳性的panc-1-luc-MSLN细胞和capan-2-luc细胞,最小杀伤率分别为(70.00±18.19)%和(57.00±5.29)%,而对MSLN阴性的panc-1-luc细胞无杀伤作用。RTCA结果显示MSLN-CAR-T细胞对构建的3种胰腺癌细胞均有杀伤能力,最小杀伤率分别为(56.33±7.64)%、(93.00±2.65)%和(26.33±28.15)%;NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤不受MSLN限制。免疫缺陷小鼠胰腺癌模型结果显示,体内杀伤效力与体外荧光素酶活性检测结果一致。体内外试验证明,检测靶细胞荧光素酶表达活性,可以反映免疫细胞对靶细胞的杀伤效力。结论本研究建立了稳定表达荧光素酶的多株胰腺癌单克隆细胞系,可用于体内外免疫治疗产品肿瘤杀伤效力的研究评价。

关键词：胰腺癌荧光素酶间皮素活体成像技术免疫治疗

人间充质干细胞抑制同种异体人外周血Th17淋巴细胞增殖活性的质量标准体系的建立

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中国生物制品学杂志 2021年第2期34卷 192-201页

作者：吴婷婷韩晓燕李欣纳涛袁宝珠中国食品药品检定研究院细胞资源保藏及研究中心北京100050

目的构建人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)体外抑制同种异体人外周血Th17淋巴细胞增殖活性的质量标准体系。方法基于hMSCs与同种异体人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)体外共培养和标... 详细信息

目的构建人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)体外抑制同种异体人外周血Th17淋巴细胞增殖活性的质量标准体系。方法基于hMSCs与同种异体人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)体外共培养和标准人间充质干细胞株CCRC-hMSCs-S1(简称CCRC1)的标准化分析,建立hMSCs对Th17细胞增殖抑制能力的标准评价技术,并对不同来源hMSCs抑制Th17增殖的质量属性标准进行研究。结果首先建立了CCRC1体外抑制Th17细胞增殖的质量参数,再依据该参数对其他50个不同来源hMSCs抑制Th17增殖的检测值进行校正,最终提出以平均抑制率为(51.98±12.99)%的hMSCs抑制Th17增殖质量属性的初级标准值。结论建立了hMSCs抑制Th17细胞增殖的标准化评价体系,填补了目前国内外相关空白,为客观评价hMSCs生物学有效性质量属性和构架hMSCs综合质量评价体系奠定了又一项重要基础。

关键词：人间充质干细胞标准细胞株CCRC-hMSC-S1 Th17淋巴细胞人外周血单个核细胞免疫调控质量标准

基于免疫调控功能的间充质干细胞生物学有效性质量评价策略

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中国新药杂志 2016年第3期25卷 283-290+296页

作者：张可华纳涛韩晓燕袁宝珠中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一类具有自我更新/多向分化潜能和独特免疫调控功能的成体干细胞,并已成为近年来临床研究中发展最为迅速的干细胞类型。由于其独特的免疫调控功能,MSC已被用于治疗多种类型的免疫异常或炎症... 详细信息

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一类具有自我更新/多向分化潜能和独特免疫调控功能的成体干细胞,并已成为近年来临床研究中发展最为迅速的干细胞类型。由于其独特的免疫调控功能,MSC已被用于治疗多种类型的免疫异常或炎症反应失控所致的疾病。MSC在不同类型的炎症环境中,可由静息状态转变成激活状态,通过细胞间相互作用和分泌可溶性免疫调控因子,调节多种免疫细胞的增殖、分化、活化以及炎症因子的分泌功能。MSC的免疫调控功能是其临床应用中重要的生物学有效性质量属性,对这一质量属性的有效评价,是指导MSC产品研发及临床应用中最为相关的质量控制内容之一。本文综述了近年来人们对MSC免疫调控功能的认识及其与临床应用的相关性,在此基础上提出了针对治疗性MSC产品免疫调控功能的评价策略,为在我国建立和完善MSC生物学有效性评价体系奠定基础。

关键词：间充质干细胞免疫调控细胞治疗质量控制检验规范

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达肝素钠和肝素钠对小鼠毒性的比较

中国药理学与毒理学杂志 2016年第11期30卷 1172-1175页

作者：张媛纳涛吴彦霖游赣花刘倩贺庆高华中国食品药品检定研究院药理室北京100050 中国食品药品检定研究院细胞资源保藏研究中心北京100050 贵州食品药品检验所药理室贵州贵阳550004

目的比较达肝素钠和肝素钠对小鼠毒性的差异。方法采用半数致死量(LD_(50))法测定两药对小鼠的急性毒性,达肝素钠设6个剂量组,最低剂量为2.54×10~5U·kg^(-1);肝素钠设5个剂量组,最低剂量为2.05×10~5U·kg^(-1);剂量间距均为1.25;达... 详细信息

目的比较达肝素钠和肝素钠对小鼠毒性的差异。方法采用半数致死量(LD_(50))法测定两药对小鼠的急性毒性,达肝素钠设6个剂量组,最低剂量为2.54×10~5U·kg^(-1);肝素钠设5个剂量组,最低剂量为2.05×10~5U·kg^(-1);剂量间距均为1.25;达肝素钠和肝素钠干预L-929细胞48 h,CCK-8法检测细胞存活率并计算半数抑制浓度(IC_(50)),达肝素钠设7个浓度,最低浓度为0.78×10~5U·L^(-1),肝素钠设6个浓度,最低浓度为0.39×10~5U·L^(-1);剂量间距均为2;采用碘化丙啶染色用流式细胞仪对L-929细胞进行细胞周期分析。结果达肝素钠和肝素钠对小鼠的LD_(50)分别为4.44×10~5和3.68×10~5U·kg^(-1);对L-929细胞的IC_(50)分别为1.42×10~6和3.54×10~5U·L^(-1)。L-929细胞经达肝素钠处理后,G_2/M期细胞百分率增加137.6%(P细胞百分率增加33.8%(P细胞的毒性均小于肝素钠,达肝素钠和肝素钠对细胞周期的影响分别阻滞在G_2/M期和G_0/G_1期。

关键词：达肝素钠肝素钠急性毒性细胞毒性细胞周期

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治疗性干细胞产品的相关风险因素

中国生物制品学杂志 2013年第5期26卷 736-739页

作者：袁宝珠中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心北京100050

近年来国内外以干细胞为主的细胞治疗研究发展迅速,在治疗退行性疾病、缺血性心脑血管疾病、肝硬化及糖尿病等领域已开展了多项临床试验研究,但作为新型治疗性产品,干细胞产品在治疗的安全性和有效性方面还存在若干风险因素。本文对常... 详细信息

近年来国内外以干细胞为主的细胞治疗研究发展迅速,在治疗退行性疾病、缺血性心脑血管疾病、肝硬化及糖尿病等领域已开展了多项临床试验研究,但作为新型治疗性产品,干细胞产品在治疗的安全性和有效性方面还存在若干风险因素。本文对常见的干细胞种类、特性以及与临床应用相关的内在和外在风险因素进行了综述,旨在以现有的理论和技术条件,探讨治疗性干细胞产品基本的质量控制要求和策略。

关键词：干细胞治疗风险质量控制