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基于ITS和ITS2序列的药用石斛DNA条形码鉴定研究

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中草药 2024年第2期55卷 575-587页

作者：张高曼赵立佳刘光富王正亮中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室浙江杭州310018

目的探讨内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)片段作为DNA条形码鉴别我国41种药用石斛种类的可行性。方法通过PCR扩增测序结合GenBank公共序列筛选分别获得我国41种... 详细信息

目的探讨内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)片段作为DNA条形码鉴别我国41种药用石斛种类的可行性。方法通过PCR扩增测序结合GenBank公共序列筛选分别获得我国41种药用石斛的核基因ITS和ITS2序列433条和410条,以Kimura-2-parameter(K2P)模型计算种间和种内遗传距离,以邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统发育树,并对ITS2二级结构进行预测分析。结果基于遗传距离和NJ树分析结果均显示,ITS和ITS2作为DNA条形码可分别有效区分待测的30和31种药用石斛,物种鉴定效率分别为73.2%和75.6%。联合系统发育树和ITS2序列二级结构分析,药用石斛种类的鉴定效率可提升至87.8%。结论 ITS2作为DNA条形码对药用石斛的物种分辨率优于ITS,物种取样数量可显著影响DNA条形码对药用石斛的物种鉴定效率。结果丰富了我国石斛属植物的DNA条形码数据库,为保障药用石斛种质资源和药用安全提供了科学基础和技术支撑。

关键词：石斛药材石斛属 DNA条形码 ITS ITS2 物种鉴定

(p)ppGpp——“魔斑”核苷酸在细菌中的研究进展

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微生物学报 2024年第2期64卷 378-390页

作者：宋阳王译婕王瑞申屠旭萍俞晓平中国计量大学生命科学学院、浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室浙江杭州310018

鸟苷四磷酸(guanosine tetraphosphate,ppGpp)/鸟苷五磷酸(guanosine pentaphosphate,pppGpp)是细菌严谨反应的信号分子,其合成和水解由Rel/SpoT同系物(RelA/SpoT homologue,RSH)家族的蛋白质合成和水解活性控制。(p)ppGpp介导的严谨反应能够提高细菌对营养匮乏的适应能力和抗生素抗性。近年来发现(p)ppGpp与细菌生长和细胞分裂、抗生素合成等都密切相关,是细胞内重要的全局调控因子。(p)ppGpp在细菌细胞中有许多靶点,使其可以调节DNA复制、转录、细胞周期、核糖体生物合成以及抗生素合成基因簇的表达。然而,(p)ppGpp如何控制转录和其他代谢过程取决于细菌种类,并在不同的微生物中通过不同的机制调节相同的过程。因此,本文通过综述(p)ppGpp的合成/水解酶的种类和调节机制,(p)ppGpp对微生物代谢调控机制、对细胞周期的影响机制,以及(p)ppGpp对抗生素合成和耐受性的调控机制,为细菌耐药性研究和细胞生理学研究奠定基础。

关键词： (p)ppGpp 细菌细胞周期代谢调控严谨反应抗生素耐药性

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血清蛋白质组高丰度蛋白去除方法比较研究

质谱学报 2024年第4期45卷 519-530,I0004页

作者：赵佳威陆澳赵洋孟波叶子弘中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室浙江杭州310018 中国计量科学研究院前沿计量科学中心国家市场监管技术创新中心(质谱)北京100029

基于健康人群(HC)和肝癌人群(HCC)的血清样本,本研究比较了高选择Top14高丰度蛋白去除试剂盒(Top14)、DMB低丰度蛋白富集试剂盒(DMB)2种血清蛋白质组前处理方案的优劣势。对于HC样本,DMB处理组鉴定的蛋白质数量是Top14处理组的2.6倍,是... 详细信息

基于健康人群(HC)和肝癌人群(HCC)的血清样本,本研究比较了高选择Top14高丰度蛋白去除试剂盒(Top14)、DMB低丰度蛋白富集试剂盒(DMB)2种血清蛋白质组前处理方案的优劣势。对于HC样本,DMB处理组鉴定的蛋白质数量是Top14处理组的2.6倍,是未处理血清原液(Blank)样本的3.9倍;对于HCC样本,DMB处理组鉴定的蛋白质数量是Top14处理组的3.7倍,Blank组的6.2倍。通过分析蛋白组的丰度排序散点图,发现Top14预处理对高丰度蛋白质的去除效果显著;但相较于DMB预处理,低丰度蛋白质的鉴定覆盖率较低。在蛋白质组鉴定频率方面,DMB处理样本中可定量蛋白质数量明显多于Top14处理组和Blank组。Top14处理组和Blank组中鉴定的蛋白质超过50%可在DMB处理组中被鉴定到,且其鉴定蛋白质的KEGG分析结果基本可在DMB方案中被覆盖。在DMB预处理的肝癌血清中鉴定到47个差异蛋白质,而在Top14处理组和Blank组中分别只鉴定到15、17个差异蛋白质。通过对各组差异蛋白质编码基因的KEGG分析,DMB、Top14预处理组和Blank样本的差异蛋白质分别富集到21、5、1条通路,表明DMB预处理更适用于血清样本蛋白质组的分析。基于DMB预处理方法,本研究发现HSP90AB1、SPP1、ACTR3、SNCA、PECAM1和SRC在肝癌血清样本中显著上调,可作为肝癌筛查候选生物标志物。

关键词：血清蛋白质组液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)

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UePep1对菰黑粉菌致病力的调控作用

农业生物技术学报 2024年第7期32卷 1614-1625页

作者：黄琳钰汤近天夏文强崔海峰叶子弘张雅芬中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量与检验检疫技术重点实验室

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)专性侵染菰(Zizania latifolia)后可诱导形成膨大肉质茎—茭白，且菰黑粉菌的致病力与茭白的表型、产量等密切相关。穿透过程必需蛋白1 (protein essential during penetration 1, Pep1)作为真菌效应因子... 详细信息

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)专性侵染菰(Zizania latifolia)后可诱导形成膨大肉质茎—茭白，且菰黑粉菌的致病力与茭白的表型、产量等密切相关。穿透过程必需蛋白1 (protein essential during penetration 1, Pep1)作为真菌效应因子，在黑粉菌属(Ustilago)真菌的致病力调控上起着重要作用。本研究先通过BLASTP定位及基因克隆分析，获得了菰黑粉菌中Pep1的同源蛋白编码基因UePep1 (GenBank No. OR088111)，其开放阅读框为528 bp，编码175个氨基酸，无内含子序列。进一步通过PEG介导的原生质体转化方法构建UePep1的敲除突变体，进行体外生长及侵染试验，发现该基因的缺失不影响菰黑粉菌单倍体形态与生长速率，也不影响体外菌丝形成与丝状生长能力，但显著减缓了菰黑粉菌入侵菌丝的增殖，无法诱导寄主形成膨大肉质茎。进一步将UePep1回补至玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)SG200ΔPep1菌株中，部分恢复了SG200ΔPep1菌株的侵染力，表明UePep1是玉米瘤黑粉菌Pep1的功能性互补蛋白。上述研究明确了UePep1在菰黑粉菌致病力调控中的作用，同时进一步证实了该效应因子在黑粉菌属真菌中功能的保守性，为研究菰黑粉菌与菰互作机制进而解析膨大肉质茎形成机理提供借鉴和理论支持。

关键词：菰黑粉菌穿透过程必需蛋白1(Pep1) 菰致病性

群体感应信号分子3-oxo-C8-HSL对褐飞虱肠道共生菌多样性的影响

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中国生物防治学报 2024年

作者：范琳琳宋阳申屠旭萍俞晓平中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室

由酰基高丝氨酸内酯（AHL）介导的细菌群体感应（quorum sensing，QS）是革兰氏阴性细菌中广泛存在的调控系统。然而，对于QS感应与昆虫肠道菌群的互作以及QS与肠道免疫的关系尚未明确。本试验通过向褐飞虱Nilaparvata lugens St?l饲喂... 详细信息

由酰基高丝氨酸内酯（AHL）介导的细菌群体感应（quorum sensing，QS）是革兰氏阴性细菌中广泛存在的调控系统。然而，对于QS感应与昆虫肠道菌群的互作以及QS与肠道免疫的关系尚未明确。本试验通过向褐飞虱Nilaparvata lugens St?l饲喂细菌群体感应信号分子——三氧代辛酰基高丝氨酸内脂（3-oxo-C8-HSL），探索QS对昆虫肠道微生物群落多样性及肠道免疫的影响。结果表明，3-oxo-C8-HSL处理第5 d的褐飞虱死亡率较对照组高61.39%，生存时间缩短5 d。褐飞虱肠道微生物菌门、菌属和物种数（ASV）较对照组减少，细菌多样性升高，真菌多样性降低；细菌和真菌群落的原优势菌属相对丰度降低。与此同时，3-oxo-C8-HSL激活肠道免疫，导致免疫效应物大量表达。综上所述，3-oxo-C8-HSL通过改变褐飞虱肠道微生物群落的多样性并激活褐飞虱的肠道免疫响应，实现有效的杀虫效果，该方法为未来寻找到更有效的害虫防治方法的提供新策略。

关键词：褐飞虱细菌群体感应肠道共生菌免疫基因微生物多样性

磷酸化蛋白质的定量与化学计量分析方法的研究进展

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分析化学 2024年第5期52卷 609-623页

作者：刘媛翟睿吴帆楚占营赵洋戴新华方向俞晓平中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室中国计量科学研究院前沿计量科学中心国家市场监管技术创新中心(质谱)

蛋白质翻译后修饰是赋予蛋白质生理功能的关键机制，其中可逆的磷酸化修饰在众多生命活动中起着开/关的作用，其异常变化通常与多种重大疾病过程密切相关。近年来，借助蛋白质组学技术和方法，磷酸化蛋白质的高通量、高精度定性与定量... 详细信息

蛋白质翻译后修饰是赋予蛋白质生理功能的关键机制，其中可逆的磷酸化修饰在众多生命活动中起着开/关的作用，其异常变化通常与多种重大疾病过程密切相关。近年来，借助蛋白质组学技术和方法，磷酸化蛋白质的高通量、高精度定性与定量分析方法也得到了快速发展。本文综述了近年来基于“自下而上”策略的磷酸化蛋白质定量与化学计量分析方法的研究进展，包括磷酸化肽的富集方法、磷酸化肽质谱碎裂方式、定量分析方法以及磷酸化位点的化学计量分析方法，并对磷酸化蛋白质研究的发展趋势进行了讨论。

关键词：磷酸化蛋白质富集方法质谱定量方法化学计量评述

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菰黑粉菌细胞核和线粒体的荧光标记菌株构建

农业生物技术学报 2024年第5期32卷 1188-1197页

作者：汤近天杨芙容章蕾蕾李钰康张雅芬傅慧兰夏文强崔海峰叶子弘中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量与检验检疫技术重点实验室

菰(Zizania latifolia)的茎部膨大形成可食用的茭白，与菰黑粉菌(Ustilago esculenta)的侵染有关，而侵染与否取决于菰黑粉菌的二型态转换。在二型态转换过程中，细胞核与线粒体的变化动态仍然未知。本研究将定位于细胞核的组蛋白H1编... 详细信息

菰(Zizania latifolia)的茎部膨大形成可食用的茭白，与菰黑粉菌(Ustilago esculenta)的侵染有关，而侵染与否取决于菰黑粉菌的二型态转换。在二型态转换过程中，细胞核与线粒体的变化动态仍然未知。本研究将定位于细胞核的组蛋白H1编码基因和线粒体定位信号(mitochondrial targeting signa, MTS)编码序列，分别连接GFP和mCherry荧光蛋白基因后，构建细胞核和线粒体荧光标记载体。采用根癌农杆菌介导遗传转化法(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT)，以菰黑粉菌野生型菌株UeT14和UeT55为出发菌株来进行遗传转化，得到细胞核或线粒体中稳定表达红、绿色荧光蛋白的重组菌株：UeT55-H1-GFP、UeT14-H1-mCherry、UeT55-MTS-GFP和UeT14-MTS-mCherry。在UeT55-H1-GFP和UeT14-H1-mCherry菌株中，孢子中央有明亮的荧光点，与DAPI染色所形成的蓝色荧光共定位。在UeT55-MTS-GFP、UeT14-MTS-mCherry菌株中，孢子内可见小点状荧光，且绿色荧光与MitoTracker形成的红色荧光共定位。本研究获得了细胞核及线粒体能稳定表达荧光蛋白标记的菰黑粉菌，为研究菰黑粉菌生长发育、融合和侵染的分子机制提供了重要的参考和材料。

关键词：菰黑粉菌菰细胞核线粒体荧光蛋白标记

茶小绿叶蝉粘样蛋白EfMLP基因的克隆、鉴定及功能分析

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昆虫学报 2024年第2期67卷 151-162页

作者：何雪怡雷雨欢宋仕月夏露霞王世宇马成文魏可欣王梦馨潘铖韩宝瑜中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室杭州310018

【目的】探明茶小绿叶蝉Empoasca flavescens粘样蛋白EfMLP基因的分子特征、表达模式和生物学功能。【方法】基于茶小绿叶蝉转录组数据,PCR克隆获得4条EfMLP基因的全长cDNA序列并进行生物信息学分析;qRT-PCR检测EfMLP基因在茶小绿叶蝉... 详细信息

【目的】探明茶小绿叶蝉Empoasca flavescens粘样蛋白EfMLP基因的分子特征、表达模式和生物学功能。【方法】基于茶小绿叶蝉转录组数据,PCR克隆获得4条EfMLP基因的全长cDNA序列并进行生物信息学分析;qRT-PCR检测EfMLP基因在茶小绿叶蝉不同发育阶段(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)及初羽化成虫不同组织(体壁、脂肪体、唾液腺、肠道、卵巢和精巢)中的表达量;通过饲喂法利用RNAi沉默茶小绿叶蝉5龄若虫EfMLP2和EfMLP4,生物测定分析EfMLP基因沉默后茶小绿叶蝉的存活率。【结果】获得4条茶小绿叶蝉EfMLP基因全长cDNA序列,分别命名为EfMLP1(GenBank登录号:OR504428),EfMLP2(GenBank登录号:OR504429),EfMLP3(GenBank登录号:OR504430)和EfMLP4(GenBank登录号:OR504431),这4条EfMLP基因编码蛋白均具有O-联糖基化位点形成粘蛋白结构域(mucin domain, MD)且该结构域包含高度重复的串联重复序列,其中EfMLP3和EfMLP4的氨基酸序列含有保守的2型几丁质结合域(chitin binding domain, CBD)。系统发育分析结果表明,EfMLP被分到两个不同的分支上,属于两种不同的MLP类型,该结果与昆虫的分类地位无相关性,猜测可能与其功能分化相关。EfMLP1和EfMLP2在茶小绿叶蝉初羽化雌雄成虫和初羽化成虫唾液腺中均特异性高表达,而EfMLP3和EfMLP4的表达在卵、若虫和成虫等不同发育阶段和初羽化成虫脂肪体等多个组织中均可被检测到。与饲喂dsGFP对照组比较,饲喂dsEfMLP2和dsEfMLP4可分别有效抑制茶小绿叶蝉体内EfMLP2和EfMLP4的表达量,并可显著降低茶小绿叶蝉的存活率。【结论】EfMLP在茶小绿叶蝉取食中扮演重要的角色,可作为开发基于RNAi的叶蝉防治技术的潜在靶标。

关键词：茶小绿叶蝉粘样蛋白基因克隆表达模式 RNA干扰

褐飞虱凝集素基因NlCTL4的克隆及功能分析

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中国生物防治学报 2024年第2期40卷 337-346页

作者：王彦丹邵珠龙王正亮俞晓平中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室杭州310018

C型凝集素(C-type lectins,CTLs)是广泛存在于昆虫体内一类含糖识别结构域的蛋白超家族,通常作为模式识别受体,在识别外来病原微生物并启动昆虫先天免疫过程中发挥重要功能。本研究克隆并鉴定了一条褐飞虱CTL编码基因NlCTL4(GenBank登录... 详细信息

C型凝集素(C-type lectins,CTLs)是广泛存在于昆虫体内一类含糖识别结构域的蛋白超家族,通常作为模式识别受体,在识别外来病原微生物并启动昆虫先天免疫过程中发挥重要功能。本研究克隆并鉴定了一条褐飞虱CTL编码基因NlCTL4(GenBank登录号:OQ032531),其c DNA序列全长936 bp,编码311个氨基酸。序列分析显示,Nl CTL4蛋白N端存在一段由21个氨基酸残基组成的信号肽,C端仅具有一个典型的糖识别结构域,属于S型CTLs。系统发育分析表明,Nl CTL4与半翅目其他昆虫的CTLs聚为一支,其中与玻璃翅叶蝉CTL亲缘关系最近。q RT-PCR分析显示,Nl CTL4基因在褐飞虱不同发育阶段和不同组织中均有表达。Nl CTL4在5龄若虫期的表达量最高,且在高龄若虫期(4~5龄)的表达量显著高于低龄若虫(1~3龄),但在雌、雄成虫中其表达量无显著差异。Nl CTL4在褐飞虱雌成虫肠道中表达量最高,脂肪体次之,在血淋巴中表达量最低。大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)、金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)和金龟子绿僵菌(丝状病原真菌)均能显著诱导Nl CTL4的表达水平,其中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在诱导36 h时Nl CTL4的表达量达到顶峰,金龟子绿僵菌接种24 h时的诱导水平最高。RNAi分析结果显示,抑制Nl CTL4表达后褐飞虱5龄若虫存活率及对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力显著降低。本研究结果初步证实了褐飞虱Nl CTL4在宿主生长发育和免疫防御过程中发挥重要调控作用,且在开发褐飞虱RNAi抗虫和病原真菌防虫技术中具有重要的潜在应用价值。

关键词：褐飞虱 C型凝集素基因克隆表达模式 RNA干扰

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