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我国口蹄疫流行血清型RT-PCR的鉴别诊断技术

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我国口蹄疫流行血清型RT-PCR的鉴别诊断技术

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：程凯慧王洪梅何洪彬山东省农业科学院奶牛研究中心

引言/目的口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、羊、猪等家畜和象、牦牛、梅花鹿等野生偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病,给我国畜牧业造成巨大的经济损失,严重危害畜牧业的发展。因此对口蹄疫的快速、准确诊断是控制...

引言/目的口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的牛、羊、猪等家畜和象、牦牛、梅花鹿等野生偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病,给我国畜牧业造成巨大的经济损失,严重危害畜牧业的发展。因此对口蹄疫的快速、准确诊断是控制疫情蔓延扩散的必要前提,也是制定畜牧免疫计划的基础。本研究建立我国口蹄疫流行株不同血清型RT-PCR的鉴别诊断技术,为口蹄疫的防控提供有力的技术支持。材料与方法参考GenBank中的A型、O型、Asia1型FMDV的全基因组核酸序列,进行比对,确定保守区和变异区。采用Primer 5.0设计A型、O型、Asia1型FMDV的通用引物及分型引物,优化FMDV通用、分型RT-PCR的反应体系及反应条件,结合DNA测序技术对引物的特异性和广谱性进行分析。结果与讨论FMDV通用引物均能特异性扩增A型、O型、Asia1型FMDV,扩增目的目的片段与预期大小一致为457bp。分型引物仅能扩增相应A型、O型、Asia1型FMDV,扩增的目的片段分别为320bp、240bp、460bp。通过对扩增片段进行测序分析及Blast比对,分型引物扩增到的序列与相应的血清型FMDV相符,相似性达849%。本研究所建立的FMDV鉴别诊断方法,在FMDV通用型检测具有广谱性,在分型检测具有特异性,可有效检出我国2013年大流行的A型FMDV;能快速判断临床样品是否感染FMDV,并能进行血清型分型,可应用于FMDV急性及亚临床感染的诊断及流行病学调查。结论建立了我国口蹄疫流行血清型RT-PCR的鉴别诊断技术,为口蹄疫病毒临床样品的检测、流行病学的调查奠定了基础。

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犬瘟热病毒检测方法研究进展

中国病原生物学杂志 2012年第4期7卷 305-308页

作者：李天松王磊王胜乐姜雪许微微李元果高玉伟王铁成黄耕赵永坤夏咸柱吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 中国人民解放军中国军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 北华大学化学与生物学院吉林吉林132013 吉林省人畜共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122

犬瘟热病毒属副粘病毒科麻疹病毒属成员,食肉目各科动物均有感染报道,但主要感染犬、狼、貂、狐等动物,发病率、死亡率较高,给养殖业带来巨大的经济损失。因此注射疫苗、尽早诊断本病并及时采取相应的防治措施是减少损失的有效手段。本... 详细信息

犬瘟热病毒属副粘病毒科麻疹病毒属成员,食肉目各科动物均有感染报道,但主要感染犬、狼、貂、狐等动物,发病率、死亡率较高,给养殖业带来巨大的经济损失。因此注射疫苗、尽早诊断本病并及时采取相应的防治措施是减少损失的有效手段。本文阐述了犬瘟热病毒的检测方法,以期为该病毒的研究提供参考。

关键词：犬瘟热病毒检测方法血清学 PCR 综述

牛流行热病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

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牛流行热病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十六次学术研讨会

作者：侯佩莉王洪梅何洪彬山东省农业科学院奶牛研究中心

引言/目的牛流行热是由牛流行热病毒(BEFV)引起的牛的急性、热性传染病,在我国多个省市爆发流行,给养牛业造成巨大的经济损失,被农业部2014年印发的《牛羊常见疫病防控技术指导意见》列为牛重点防控的疫病。目前对该病的防治尚无特效药...

引言/目的牛流行热是由牛流行热病毒(BEFV)引起的牛的急性、热性传染病,在我国多个省市爆发流行,给养牛业造成巨大的经济损失,被农业部2014年印发的《牛羊常见疫病防控技术指导意见》列为牛重点防控的疫病。目前对该病的防治尚无特效药,只能对病牛采取对症治疗以缓解症状。因此,建立准确、灵敏、特异的检测方法是防治本病的前提条件。材料与方法根据GeneBank中牛流行热病毒G基因(GenBank:JX234571.1,)保守序列,应用PrimerPremier5.0软件设计并合成引物对RT1和RT1-R。应用病毒RNA提取试剂盒提取BEFV的RNA,并进行RT-PCR反应合成cDNA。以合成的BEFVcDNA为模板,优化反应条件,建立SYBR-GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和溶解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。应用该方法对临床采集的10份疑似牛流行热病毒感染的牛全血进行检测。结果与讨论以合成的BEFV cDNA(10TCID/mL)为模板,优化反应条件,确定最佳引物终浓度均为0.25μmol/L,最佳退火温度为65℃,扩增片段大小为163bp。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异。以建立的该方法对BVDV等病毒进行特异性试验,均未见其他病毒的扩增,具有较好的特异性。取不同稀释度病毒的cDNA为模板进行荧光定量RT-PCR扩增,可检测到1TCID。同时进行3次批内重复试验和批间重复试验,同一浓度的S型曲线相似,Ct值基本相同,重复性好。应用该方法对临床采集的10份疑似BEFV感染的牛全血进行检测,检测阳性4份,高于普通RT-PCR方法的检出率(检出阳性3份)。实时荧光定量RT-PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高效扩增、荧光技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点,极大地提高了检测的敏感性和特异性。在BEFV所有基因组中,G基因高度保守,故选用G基因保守区为参考。本实验分离获得了BEFV流行毒株,通过测定病毒的TCID,对病毒直接定量,用于对临床上牛感染流行热病毒早期病毒含量较低时的诊断。结论本研究成功建立了BEFV SYBR-GreenI荧光定量RT-PCR检测方法。具有较好的灵敏度、特异性和重复性,可用于牛流行热病毒临床血液、组织等样本的检测,对牛流行热病毒的流行与传播进行实时监测,为相关的基础研究提供技术支持。

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鸡白痢沙门菌研究进展

中国兽医学报 2016年第9期36卷 1624-1629页

作者：殷俊磊李求春耿士忠潘志明焦新安扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

鸡白痢沙门菌是鸡白痢的病原,具有高度适应专一宿主的特点。它可引起雏鸡的急性全身性感染,发病率和病死率极高;成年鸡被感染后可引起体质量下降、产蛋率和孵化率降低、组织病变、白痢和生殖道畸形等,给很多国家的养鸡业带来巨大危害,... 详细信息

鸡白痢沙门菌是鸡白痢的病原,具有高度适应专一宿主的特点。它可引起雏鸡的急性全身性感染,发病率和病死率极高;成年鸡被感染后可引起体质量下降、产蛋率和孵化率降低、组织病变、白痢和生殖道畸形等,给很多国家的养鸡业带来巨大危害,并引起严重的经济损失。为了更好的预防和控制、甚至最终净化该病,需要对鸡白痢沙门菌进行深入的研究。本文从病原学及其基因组特征、流行病学、致病性及毒力基因、检测方法和防控措施等方面介绍了鸡白痢沙门菌的研究进展,并对其研究趋势进行了展望。

关键词：鸡白痢沙门菌鸡白痢流行病学

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小反刍兽疫病毒蛋白及其功能研究进展

信阳师范学院学报（自然科学版） 2009年第1期22卷 152-156页

作者：杭柏林胡建和姚四新王宪文王丽荣王选年刘兴友河南科技学院动物科学学院河南新乡453003 中国农业大学动物医学院北京100094 河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种烈性传染病,呈高发病率和高死亡率,给小反刍动物的养殖及国家的经济贸易带来巨大的经济损失.目前,该病在我国已经发生,应引起重视.介绍了小反刍兽疫病毒的蛋白及其功能等方面的研究进展.

关键词：小反刍兽疫病毒蛋白功能

基于Sod C单克隆抗体的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法的建立及应用

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中国农业科学 2021年第20期54卷 4478-4486页

作者：李敏雪李剑男周红肖宁蔺辉星马喆范红结南京农业大学动物医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学

【目的】胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)是引起猪增生性肠炎(porcine proliferative enteritis,PPE)的肠道病原菌,主要表现为动物福利下降,给世界养猪业造成严重的经济损失。研究通过制备鼠抗LI SodC的单克隆抗体,建立一种针... 详细信息

【目的】胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)是引起猪增生性肠炎(porcine proliferative enteritis,PPE)的肠道病原菌,主要表现为动物福利下降,给世界养猪业造成严重的经济损失。研究通过制备鼠抗LI SodC的单克隆抗体,建立一种针对LI的免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)抗原检测方法,检验其在临床上的应用性,从而为LI的病原诊断提供一种科学有效的手段。【方法】选取胞内劳森菌弱毒疫苗为研究对象,通过PCR扩增其sodc片段,将其克隆至原核表达载体pGex-6p-1上,成功构建出pGex-6p-1-sodc重组质粒,诱导表达重组蛋白SodC。Western Blot分析重组蛋白的反应原性,一抗使用鼠抗GST标签的抗体。以该重组蛋白为免疫原,免疫4—6周龄BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术、有限稀释法和间接ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞,并制备腹水。通过间接免疫荧光(IFA)鉴定该单抗的特异性。以该单抗为一抗,摸索并建立了LI IPMA抗原检测方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。用优化后的IPMA方法对来自江苏周边地区猪场回肠组织样品进行检测,评价该方法的临床价值。【结果】纯化后SodC蛋白浓度较高,与鼠抗GST标签的抗体发生特异性结合,表明该蛋白反应原性较好。经3次亚克隆后最终共筛选获得2株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1D6和1F7。单抗亚型鉴定结果显示:1D6亚型为IgA,1F7亚型为IgG3;ELISA检测1D6单抗效价为1﹕1 024 000;1F7单抗效价为1﹕1 024 000;间接免疫荧光(IFA)结果表明2株单抗均与LI菌株发生特异性反应,与猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Cholerasuis,S. Cholerasuis)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见病原无交叉反应。优化后IPMA反应条件为:一抗稀释倍数为1﹕800,作用45min;二抗稀释倍数为1﹕2 500,作用1h,此时IPMA检测效果最佳。用该方法检测S. Cholerasuis、PEDV、TGEV、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2(PCV2)均为阴性;最低检测限为103个/mL,说明该方法特异性强、敏感性高。临床样品检测结果显示146份病料中共检测出92份阳性样品,3个不同猪场的阳性样品检出率分别为65.6%、68.2%和53.7%,总体阳性率为63.0%。普通PCR方法检测出82份阳性样品,两种方法的阳性符合率为94.6%。【结论】成功制备了鼠抗LI SodC蛋白的单克隆抗体,建立了针对LI抗原的IPMA检测方法,并对临床样品进行了检测。该方法具有良好的特异性和敏感性,并具有一定的临床价值,为实验室LI的分离鉴定、在感染细胞中的定位以及流行病学调查和相关检疫提供一种有效的技术手段。

关键词：胞内劳森菌 SodC蛋白单克隆抗体免疫过氧化物酶细胞单层试验

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清肺颗粒质量标准的研究

中国兽药杂志 2023年第2期57卷 39-46页

作者：薛沾枚张艳刘雪松张备郝敬友苏景张国华唐伟刘彦凯孙洪杰王岩史同瑞黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院黑龙江齐齐哈尔161005 黑龙江省兽用药物重点实验室黑龙江齐齐哈尔161005 黑龙江省动物疫病控制中心哈尔滨150069 哈尔滨绿达生动物药业有限公司哈尔滨150039

为开展对清肺颗粒进行质量标准研究。采用薄层色谱法(TLC)对清肺颗粒中板蓝根、贝母、桔梗、甘草定性鉴别研究,采用高效液相色谱法(HPLC)对清肺颗粒中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷进行含量测定。结果显示,TLC鉴别各组分... 详细信息

为开展对清肺颗粒进行质量标准研究。采用薄层色谱法(TLC)对清肺颗粒中板蓝根、贝母、桔梗、甘草定性鉴别研究,采用高效液相色谱法(HPLC)对清肺颗粒中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷进行含量测定。结果显示,TLC鉴别各组分条带斑点清晰,具有专属性,阴性对照无干扰。建立HPLC含量测定方法,槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷在1~12.5μg/mL范围内与峰面积呈线性关系良好(R2=0.9998),平均回收率为98.6%,RSD为0.44%。该方法操作简单、灵敏度高、重复性好,可作用于清肺颗粒的质量控制。

关键词：清肺颗粒质量标准薄层色谱法高效液相色谱法

一例牙鲆淋巴囊肿病例的诊断及病毒MCP基因遗传进化分析

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中国动物检疫 2019年第10期36卷 98-103页

作者：孟凡亮曹龙龙焦秋林李焱王宏宇刘照虎马梓承刘思当山东农业大学动物科技学院山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心

2019年1月,山东省某牙鲆鱼场出现疑似淋巴囊肿病例。患病鱼体表长有灰白色菜花样瘤状物,死亡率超过30%,给养殖场造成了较为严重的经济损失。为确定发病原因,对该鱼场病死鱼进行了病理组织学诊断和病毒检测,并对病毒MCP基因进行了序列测... 详细信息

2019年1月,山东省某牙鲆鱼场出现疑似淋巴囊肿病例。患病鱼体表长有灰白色菜花样瘤状物,死亡率超过30%,给养殖场造成了较为严重的经济损失。为确定发病原因,对该鱼场病死鱼进行了病理组织学诊断和病毒检测,并对病毒MCP基因进行了序列测定及遗传变异分析。结果显示:眼观及组织学病变符合淋巴囊肿病的病变特征;所检测到的病毒与选定的参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为78.7%~99.9%和86.8%~100%。MCP基因遗传进化分析显示,检测到的病毒与LCDV-C、JF00Kuma、JF03Yoshi、JF03GunNeA、JF、LCDV-K1等毒株同属于淋巴囊肿病毒基因II型,且与我国分离株LCDV-C有较高的同源性。经综合诊断,确定该流行病由淋巴囊肿病毒基因II型所致。该研究为该病的综合诊断及流行病学调查提供了新资料,为下一步进行该病毒相关分子生物学研究以及疫苗制备等提供了理论依据。

关键词：淋巴囊肿病毒牙鲆综合诊断 MCP基因病理组织学遗传进化分析

牛结核菌素酶联免疫吸附反应方法用于诊断奶牛结核病的研究

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牛结核菌素酶联免疫吸附反应方法用于诊断奶牛结核病的研究