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半巢式多重PCR法对A组轮状病毒VP7基因的分型

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中国生物制品学杂志 2021年第2期34卷 213-215页

作者：谷长维胡博中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室吉林长春130112

目的采用半巢式多重PCR法对A组轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP7基因进行分型。方法根据GenBank中RVA VP7基因5′端保守区设计合成多组基因分型引物,提取11个RVA代表流行毒株病毒的RNA,采用半巢式多重PCR方法进行RVA的VP7基因分型,使... 详细信息

目的采用半巢式多重PCR法对A组轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP7基因进行分型。方法根据GenBank中RVA VP7基因5′端保守区设计合成多组基因分型引物,提取11个RVA代表流行毒株病毒的RNA,采用半巢式多重PCR方法进行RVA的VP7基因分型,使用BLAST在线软件与GenBank上相应VP7核苷酸序列比对。结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,11株RVA的多重PCR产物大小均与预期一致,能正确鉴别具有代表性的流行毒株VP7基因型[G1、G2、KN105(Wa-like G3)、To16-01(equine-like,DS-1-likeG3)、G4、G8、G9及G12];经BLAST在线软件比对,RVA病毒株VP7基因序列与设计的上游引物匹配,并与下游引物互补,引物特异性良好。结论利用设计的引物成功建立的半巢式多重PCR方法能正确识别RVA的VP7基因型。

关键词：轮状病毒 VP7基因型半巢式多重PCR 引物设计

水貂出血性肺炎大肠杆菌毒力基因测定和H基因分型

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中国动物传染病学报 2022年第1期30卷 141-149页

作者：张海威程悦宁王晓旭周玉成乔连江周曼莉程世鹏杨艳玲中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室长春130112

为了分离鉴定引起水貂出血性肺炎的大肠杆菌,并对其致病性、血清型和毒力基因进行鉴定。本研究主要通过细菌分离鉴定试验对具有典型肺炎症状的死亡水貂的病原体进行分离,利用16S rRNA对进行细菌鉴定,并通过PCR方法对分离细菌的血清型和... 详细信息

为了分离鉴定引起水貂出血性肺炎的大肠杆菌,并对其致病性、血清型和毒力基因进行鉴定。本研究主要通过细菌分离鉴定试验对具有典型肺炎症状的死亡水貂的病原体进行分离,利用16S rRNA对进行细菌鉴定,并通过PCR方法对分离细菌的血清型和毒力基因进行检测,分析分离菌对动物的致病性。结果显示:28例水貂肺炎病例中分离出8株大肠杆菌,分离率为26.6%;H血清型分析显示:8株大肠杆菌的H基因型分别为H5、H11、H16、H25,其中H11为主要基因型,比率为50%(4/8);共有4种大肠杆菌的主要毒力基因,分别是iutA、papC、irp2、fyuA,其中H11血清型菌株含有iutA、irp2和fyuA 3种主要毒力基因。通过本研究我们明确了引起水貂肺炎的大肠杆菌主要血清型为H11,主要的毒力基因为iutA、papC、irp2和fyuA。

关键词：水貂出血性肺炎大肠杆菌 H基因分型毒力基因检测

猪流行性腹泻病毒血清中特异性IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

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中国动物传染病学报 2022年第3期30卷 106-112页

作者：谷长维谷长乐胡博中国农业科学院特产研究所长春130112 农业农村部经济动物疫病重点实验室长春130112

本研究旨在开发和优化新型间接ELISA,使其成为一种简单、快速、灵敏、特异的检测抗PEDV抗体的方法,并评价其作为诊断PED方法的有效性。以Vero细胞培养全病毒抗原(LNCT2株)间接ELISA检测方法为基础,以中和试验(NT)为参照,通过受试者工作... 详细信息

本研究旨在开发和优化新型间接ELISA,使其成为一种简单、快速、灵敏、特异的检测抗PEDV抗体的方法,并评价其作为诊断PED方法的有效性。以Vero细胞培养全病毒抗原(LNCT2株)间接ELISA检测方法为基础,以中和试验(NT)为参照,通过受试者工作特征曲线(ROC)分析,确定截断值为0.320,敏感性为92.6,特异性为90.1%。曲线下面积(AUC)为0.949,说明间接ELISA检测具有较好的准确性。间接ELISA与中和试验呈正相关(R=0.815,P研究开发的间接ELISA检测可作为PEDV感染的血清学调查和疾病控制的可靠检测手段,且我们的抗原包被ELISA板可在4℃保存至少6个月。

关键词：猪流行性腹泻病毒 ELISA 中和试验预包被板长期保存

梅花鹿激活素A重组蛋白真核表达、纯化及其生物活性的测定

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中国农业科学 2020年第5期53卷 1058-1070页

作者：张宇飞曹满园王丽英赵伟刚李晓霞常彤许保增中国农业科学院特产研究所/中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的c... 详细信息

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。

关键词：梅花鹿激活素A 颗粒细胞真核表达蛋白纯化

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纳米抗体及其在动物传染病防控中的应用

中国兽医学报 2024年第2期44卷 377-385页

作者：李甜甜邓效禹李智杰许丽文孙亚杰胡博白雪中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室吉林长春130112

纳米抗体是存在于骆驼科外周血中的一种天然缺失轻链的重链抗体可变区结构域,因其特殊的结构特点具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性强、易于可溶性重组表达等优点,近年来在轮状病毒、流感病毒、新型冠状病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽... 详细信息

纳米抗体是存在于骆驼科外周血中的一种天然缺失轻链的重链抗体可变区结构域,因其特殊的结构特点具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性强、易于可溶性重组表达等优点,近年来在轮状病毒、流感病毒、新型冠状病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒、狂犬病病毒、金黄色葡萄球菌以及沙门菌等传染性病原体的诊断与治疗中取得了较好的应用效果。现主要介绍纳米抗体的结构与特点、制备与表达技术,在传染病诊断与治疗中的应用研究现状与发展趋势,以及优缺点,为传染病的防控技术提供参考。

关键词：纳米抗体病毒诊断治疗

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犬细小病毒颗粒疫苗的研制与免疫效果评价

中国兽医科学 2023年第12期53卷 1516-1522页

作者：李昀真代昕宇李双双许丽文张成琪胡博白雪中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室吉林长春130112

犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒(CPV)引起的一种高度传染性疾病,目前最为有效的防控方法为疫苗接种。本研究将CPV VP2基因克隆于pQB3载体中,将鉴定正确的pQB3-VP2重组质粒与qBac-ⅢG杆粒共转染至sf9昆虫细胞中,拯救获得表达CPV VP2蛋... 详细信息

犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒(CPV)引起的一种高度传染性疾病,目前最为有效的防控方法为疫苗接种。本研究将CPV VP2基因克隆于pQB3载体中,将鉴定正确的pQB3-VP2重组质粒与qBac-ⅢG杆粒共转染至sf9昆虫细胞中,拯救获得表达CPV VP2蛋白和绿色荧光蛋白的重组杆状病毒rBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞可出现明显的细胞病变,在荧光显微镜下可见明显的绿色荧光,间接免疫荧光鉴定显示rBac-VP2感染的sf9细胞可见明显的红色荧光。对细胞表达的VP2蛋白进行Western-blot鉴定,结果显示在约65 ku处可见明显的目标蛋白条带,电镜下可见与天然细小病毒形态大小相似的粒子,表明rBac-VP2感染昆虫细胞后可组装形成病毒样颗粒(VLPs),收获的VLPs血凝效价可达1∶210。将CPV VLPs免疫小鼠后诱导机体产生血凝抑制抗体,效价达1∶27,与宠必威幼犬保商业化疫苗产生的免疫效果相当。本研究为犬细小病毒新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。

关键词：犬细小病毒新型疫苗病毒样颗粒杆状病毒

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狂犬病颗粒样疫苗的制备及免疫评价

畜牧与兽医 2024年第7期56卷 44-51页

作者：代昕宇李昀真孙亚杰胡博张成琪许丽文白雪中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室吉林长春130112

为研发高免疫原性的新型狂犬病颗粒样疫苗,利用PCR方法扩增狂犬病病毒HEP-Flury株的G蛋白和M蛋白基因序列,将其依次克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统穿梭载体pFastBac dual上,构建重组质粒pFD-GM。制备基于pFD-GM的重组杆粒,转染至Sf9... 详细信息

为研发高免疫原性的新型狂犬病颗粒样疫苗,利用PCR方法扩增狂犬病病毒HEP-Flury株的G蛋白和M蛋白基因序列,将其依次克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统穿梭载体pFastBac dual上,构建重组质粒pFD-GM。制备基于pFD-GM的重组杆粒,转染至Sf9细胞,得到重组杆状病毒rb-GM,在Sf-9细胞中表达获得病毒样颗粒VLP-GM。经SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光鉴定,重组杆状病毒成功表达了G蛋白(约56 kDa)和M蛋白(约23 kDa);经电镜观察,VLP-GM大小约为100 nm×50 nm,呈表面带有纤突的子弹形状,与典型的狂犬病病毒粒子类似。将VLP-GM免疫犬,经测定犬在二次免疫后产生较灭活疫苗更高的中和抗体水平,达到7.81 U/mL,并且与单独免疫G蛋白相比可刺激更多细胞因子如白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)生成。本研究成功表达了狂犬病病毒的病毒样颗粒VLP-GM,证明了其免疫原性,为后续的疫苗研制和抗体制备奠定了基础。

关键词：狂犬病病毒病毒样颗粒 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因真核表达载体构建及生物信息学分析

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中国畜牧兽医 2021年第7期48卷 2313-2323页

作者：乔连江陈晨张如崔立恒徐丽杨艳玲中国农业科学院特产研究所农业部经济动物疫病重点实验室长春130000

为深入研究Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family,member A,Rhoa)和环氧合酶2(cyclooxygenase 2,Ptgs2)分子在布鲁菌逃逸机体免疫中发挥的作用,试验对RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因进行扩增与克隆,构建真核表达载体并预测生物... 详细信息

为深入研究Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family,member A,Rhoa)和环氧合酶2(cyclooxygenase 2,Ptgs2)分子在布鲁菌逃逸机体免疫中发挥的作用,试验对RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因进行扩增与克隆,构建真核表达载体并预测生物信息学功能。根据GenBank数据库中公布的RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因CDS区序列(登录号:JN971019.1和NM_011198)设计引物,提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,经RT-PCR扩增Rhoa和Ptgs2片段并测序,将纯化的Rhoa和Ptgs2片段分别与线性化pcDNA3.1质粒相连接,对重组质粒进行测序分析和双酶切鉴定后,利用LipofectamineTM2000转染293T细胞,经实时荧光定量PCR和Western blotting验证Rhoa和Ptgs2基因的表达情况,并应用生物信息学软件对Rhoa和Ptgs2基因进行预测分析。结果显示,试验成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达质粒;实时荧光定量PCR检测均在转录水平上表达;Western blotting可见Ptgs2蛋白在70 ku处有一明显条带,而Rhoa蛋白未出现条带。生物信息学预测显示,Rhoa和Ptgs2基因核苷酸序列相似性较高,在不同物种之间较为保守;Rhoa不具有信号肽,为不稳定蛋白,而Ptgs2在第17-18位氨基酸处存在信号肽,为稳定蛋白;Rhoa和Ptgs2蛋白分别有12和53个潜在的磷酸化位点;二级结构、三级结构均以无规则卷曲为主。本研究成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达载体,均在转录水平上表达,并分析了其生物学功能,为后续开展RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因在布鲁菌免疫机制方面的研究提供了工具。

关键词： RAW264.7细胞 Rhoa基因 Ptgs2基因真核表达载体生物信息学

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犬细小病毒疫苗的研究进展

中国兽医学报 2023年第7期43卷 1567-1573页

作者：李昀真胡博李虹晔许丽文张成琪代昕宇白雪中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室吉林长春130112

犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)是引起的犬腹泻是导致犬类死亡的高度接触性传染病病原之一。针对这种疫病目前最为有效的防控方法就是疫苗接种,然而由于多种因素的影响如病毒变异、母源抗体干扰等因素导致的免疫后感染发生率仍然... 详细信息

犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)是引起的犬腹泻是导致犬类死亡的高度接触性传染病病原之一。针对这种疫病目前最为有效的防控方法就是疫苗接种,然而由于多种因素的影响如病毒变异、母源抗体干扰等因素导致的免疫后感染发生率仍然较高。目前已应用的传统疫苗如灭活疫苗或弱毒疫苗具有其不足之处,开发新型疫苗提高免疫效力是较为有效的防控措施。因此,现从细小病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程亚单位疫苗及核酸疫苗等角度介绍CPV疫苗的研究进展,为细小病毒防控产品的研制提供借鉴。

关键词：犬细小病毒新型疫苗病毒样颗粒