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新城疫病毒F48E9株M和NP基因的原核表达

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中国兽医科学 2008年第3期38卷 181-185页

作者：闻晓波吴芬芳闫丽辉曹殿军刘培欣刘春国孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

根据新城疫病毒(NDV)F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,转化***21(DE3),筛选表达NDV F48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分... 详细信息

根据新城疫病毒(NDV)F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,转化***21(DE3),筛选表达NDV F48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDV M蛋白在***21(DE3)内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达。用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDV M和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。

关键词：新城疫病毒 M基因 NP基因原核表达

3种基因型鸡传染性支气管炎病毒免疫对tl/CH/LDT3/03株的保护性

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中国兽医科学 2007年第12期37卷 1024-1028页

作者：李成仁张晓楠王钰韩宗玺刘乔然邵昱昊刘胜旺孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因比较为基础,分析了IBV tl/CH/LDT3/03型毒株与中国其他流行IBV毒株之间的关系,选择5株代表3种基因型的毒株进行动物免疫攻毒试验,以发病率、死亡率、抗体产生及在不同脏器中的病毒检出率作为指标来评... 详细信息

以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因比较为基础,分析了IBV tl/CH/LDT3/03型毒株与中国其他流行IBV毒株之间的关系,选择5株代表3种基因型的毒株进行动物免疫攻毒试验,以发病率、死亡率、抗体产生及在不同脏器中的病毒检出率作为指标来评价异种毒株对tl/CH/LDT3/03株的保护性。结果显示,同种致弱毒株对tl/CH/LDT3/03强毒株具有良好的保护性,而异种毒株对tl/CH/LDT3/03强毒株的保护性低。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 S1基因交叉保护

利用单基因组扩增法对马传染性贫血病毒疫苗株异质性的分析

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病毒学报 2012年第4期28卷 431-438页

作者：韦华冕王雪峰王珊珊杜承刘海芳刘强周建华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

前期研究发现,马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus EIAV)中国弱毒疫苗株并非单一病毒,而是由多种准种(quasispecies)组成的种群。阐明该疫苗株的具体构成,对于确定优势疫苗株和分析其在体内的进化具有重要意义。本研究比... 详细信息

前期研究发现,马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus EIAV)中国弱毒疫苗株并非单一病毒,而是由多种准种(quasispecies)组成的种群。阐明该疫苗株的具体构成,对于确定优势疫苗株和分析其在体内的进化具有重要意义。本研究比较了传统RNA病毒测序法(即bulk PCR)和单基因组扩增法(Single-genome amplifica-tion,SGA)在扩增EIAV疫苗株囊膜表面蛋白gp90基因V3～V5区序列上的差异。结果发现,利用SGA法和bulk PCR法获得的序列在组内差异率分别为1.84%和1.88%。进一步序列比较发现,SGA法扩增的序列中除了含有与bulk PCR法中同源性较高的序列外,还存在bulk PCR法未检出的含强毒株LN40特异性位点,以及单个氨基酸缺失的序列。上述序列的存在为该疫苗株"多克隆构成"假说提供了佐证。此外,在对抽样偏差分析中发现,由于疫苗株中各种病毒准种在量上的差异,使得传统bulk PCR法不能有效的扩增组成比例较低的病毒准种,而导致测得的序列组成不能完全代表实际情况。SGA法通过对单基因组分的扩增和测序,可避免bulk PCR法的以上缺陷,在分析以准种形式存在的RNA病毒序列方面具有独特的优势。

关键词：单基因组扩增 Bulk PCR 马传染性贫血病毒多样性

鸡传染性贫血病毒VP2基因的表达及其免疫活性分析

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微生物学报 2006年第5期46卷 841-843页

作者：王晓艳王笑梅高玉龙高宏雷陆桂丽中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001 新疆农业大学乌鲁木齐830052

利用特异性引物从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒核酸经PCR扩增得到VP2基因,BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理,纯化后,克隆至BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理的表达载体pET-28a中,构建了原核表达质粒pET-28-VP2。将pET-28-VP2转化至感受态***21(DE3)... 详细信息

利用特异性引物从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒核酸经PCR扩增得到VP2基因,BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理,纯化后,克隆至BamHⅠ和SalⅠ双酶切处理的表达载体pET-28a中,构建了原核表达质粒pET-28-VP2。将pET-28-VP2转化至感受态***21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约31kDa的目的蛋白以可溶性形式表达于上清中。Western blot分析发现,表达产物与鸡传染性贫血的阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白免疫小鼠后制得的多抗可以与全病毒发生反应,证明其具有免疫原性,为进一步研究VP2蛋白的功能及开展CIAV疫苗及诊断试剂的研制奠定了基础。

关键词：鸡传染性贫血病毒 VP2基因克隆表达

猪圆环病毒2型Cap蛋白核定位信号区抗原表位的鉴定

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中国农业科学 2010年第7期43卷 1480-1486页

作者：郭龙军陆月华黄立平危艳武刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪传染病研究室/兽医生物技术国家重点实验室

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。【方法】本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免... 详细信息

【目的】猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原,其基因组ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。【方法】本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备5株单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。【结果】5株单抗中有4株针对同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36;另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。【结论】本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,为以后Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。

关键词：猪圆环病毒2型 Cap蛋白抗原表位多肽扫描核定位信号

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家禽MHC结构研究进展

遗传 2012年第6期34卷 673-678页

作者：武永淑韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物研究室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

禽主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)的结构与禽病防控、禽免疫学、禽类遗传学研究密切相关。文章对鸡、火鸡、鹌鹑、鸭和鹅的MHC结构方面的研究进展进行了综述,表明其有以下共同特点:都有保守的MHC区域,包括... 详细信息

禽主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)的结构与禽病防控、禽免疫学、禽类遗传学研究密切相关。文章对鸡、火鸡、鹌鹑、鸭和鹅的MHC结构方面的研究进展进行了综述,表明其有以下共同特点:都有保守的MHC区域,包括MHC I基因和MHC II基因及一些功能未知基因;基因排列简单而紧凑;MHC I基因内含子的长度都比哺乳动物小;鸡、火鸡、鸭和鹅的MHC I基因组序列都有8个外显子和7个内含子,MHC IIβ基因组序列都有6个外显子和5个内含子;鸡、火鸡和鹌鹑的BG基因结构模式相同;都存在微卫星重复单元。但也存在种属差异:鸡的MHC I基因和MHC II基因是双拷贝,而鸭、鹅和鹌鹑有若干个拷贝;BG基因的拷贝数及其外显子数目不同。对主要家禽MHC结构进行分析比较,将有利于对禽病学及禽免疫遗传学的进究。

关键词：家禽 MHC 结构

高致病性PRRSV与PCV2共感染协同致病性研究

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中国农业科学 2012年第18期45卷 3859-3872页

作者：范培虎危艳武郭龙军吴洪丽黄立平刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

【目的】为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。【方法】选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、H... 详细信息

【目的】为阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的协同致病作用,澄清两种病毒不同时间顺序共感染与其协同致病力之间的关系。【方法】选取35日龄阴性健康猪30头,随机分6组,PCV2/HP-PRRSV顺序共感染组、HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组、HP-PRRSV+PCV2同时共感染组、HP-PRRSV感染组、PCV2感染组、未接种对照组。感染后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重、采血。用流式细胞仪检测血液中的CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、γδT、NK细胞及粒细胞和单核细胞变化;免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测这两种病毒抗体变化;用ELISA法检测血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、GM-CSF细胞因子变化;用荧光定量PCR法检测血清和组织中病毒载量。对各组试验猪进行组织病理学观察。【结果】HP-PRRSV/PCV2顺序共感染组临床症状最严重,死亡率达60%;组织和血清中病毒载量显著高于其它组,抗体滴度明显低于其它组;淋巴细胞亚群及细胞因子(尤以TNF-α)变化也最为明显。【结论】HP-PRRSV和PCV2之间存在协同致病作用,且猪群先感染HP-PRRSV后感染PCV2可明显提高猪群发病率和死亡率。本研究对临床HP-PRRSV和PCV2的综合防制提供科学依据。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型共感染协同致病性

猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03全长cDNA克隆的构建

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中国预防兽医学报 2007年第12期29卷 929-933,942页

作者：吴波平冯力时洪艳陈建飞孙东波高秀春白兴华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室

为构建猪捷申病毒(Porcine testhovirus,PTV)感染性克隆,进行病毒基因组结构、功能及新型疫苗研究,根据NCBI发表的PTV Swine/CH/IMH/03株及Talfan株核苷酸序列,设计并合成了4对特异性引物,PCR扩增并克隆覆盖PTV Swine/CH/IMH/03全长基... 详细信息

为构建猪捷申病毒(Porcine testhovirus,PTV)感染性克隆,进行病毒基因组结构、功能及新型疫苗研究,根据NCBI发表的PTV Swine/CH/IMH/03株及Talfan株核苷酸序列,设计并合成了4对特异性引物,PCR扩增并克隆覆盖PTV Swine/CH/IMH/03全长基因组的4个片段。经过反复拼接和测序,最终将PTV全长cDNA定向克隆到pBluescript SK(+)中。PCR、双酶切及测序鉴定证明PTV全长cDNA克隆构建成功。与Swine/CH/IMH/03亲本株及NCBI登录的其他PTV毒株序列比对发现,该克隆只有3个位点存在核苷酸及氨基酸突变,分别位于2A、2C及3D中。

关键词： PTV 全长cDNA克隆感染性克隆

鹅β-防御素3基因的分离、鉴定及其表达产物的生物学特性

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生物工程学报 2011年第12期27卷 1711-1721页

作者：张名岳周财源韩宗玺邵昙昊刘胜旺马得莹东北农业大学动物营养研究所哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

为了克隆鹅β-防御素(AvBD)3基因,并在原核表达重组鹅AvBD3蛋白,进一步研究鹅AvBD3蛋白的生物学特性,利用RT-PCR方法从鹅脾脏和法氏囊组织中扩增到鹅AvBD3基因片段,其cDNA片段大小为182 bp,编码60个氨基酸残基。经同源性分析发现鹅AvBD... 详细信息

为了克隆鹅β-防御素(AvBD)3基因,并在原核表达重组鹅AvBD3蛋白,进一步研究鹅AvBD3蛋白的生物学特性,利用RT-PCR方法从鹅脾脏和法氏囊组织中扩增到鹅AvBD3基因片段,其cDNA片段大小为182 bp,编码60个氨基酸残基。经同源性分析发现鹅AvBD3氨基酸序列与鸡AvBD3氨基酸序列同源性最高,为100%。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的BamHⅠ和SalⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX-goose AvBD3。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,重组鹅AvBD3蛋白在原核高效表达(分子量约31 kDa)。该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性与理化特性,结果显示,重组鹅AvBD3蛋白具有广谱的抗菌活性,对12种细菌,包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌作用。高盐离子浓度显著降低重组鹅AvBD3蛋白的抗菌活性。此外,该重组蛋白的溶血活性极低,并对酸碱度具有较高的稳定性。

关键词：鹅AvBD3 β一防御素3基因分离鉴定表达产物生物学特性