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表达猪瘟病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析

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生物化学与生物物理进展 2009年第7期36卷 916-922页

作者：李淼王宇飞王煜高辉李娜孙元梁冰冰仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001

含具有哺乳动物细胞活性的启动子的重组杆状病毒(BacMam病毒)可有效转导多种哺乳动物细胞,并被广泛用于开发新型非复制型载体疫苗.将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因插入多角体启动子下游,得到经修饰的杆状病毒转移载体,将对虾白斑综合... 详细信息

含具有哺乳动物细胞活性的启动子的重组杆状病毒(BacMam病毒)可有效转导多种哺乳动物细胞,并被广泛用于开发新型非复制型载体疫苗.将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因插入多角体启动子下游,得到经修饰的杆状病毒转移载体,将对虾白斑综合症病毒(WSSV)ie1启动子控制下的猪瘟病毒E2基因表达盒插入此载体中,构建了BacMam病毒BacMam/G-ie1-E2,以其感染Sf9细胞和转导HeLa细胞,通过间接免疫荧光试验和Western blot分析检测E蛋白的表达,同时用BacMam病毒直接免疫小鼠,用检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体,用基于CFSE和WST-8的淋巴细胞增殖试验评价其细胞免疫应答.结果显示,BacMam/G-ie1-E2能同时在昆虫细胞和哺乳动物细胞中高效表达E2蛋白,免疫小鼠能诱导产生针对猪瘟病毒的特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经猪瘟病毒刺激后能诱导特异性的淋巴细胞增殖.这表明,由BacMam病毒介导的基因转移有望用于开发针对猪瘟病毒的非复制型载体疫苗.

关键词：猪瘟病毒 E2蛋白重组杆状病毒免疫原性

鸡马立克氏病病毒814株细菌人工染色体的构建

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生物工程学报 2008年第4期24卷 569-575页

作者：崔红玉王云峰石星明童光志兰德松何来仇华吉刘长军王玫中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

为构建全基因组鸡马立克氏病病毒814株感染性细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC),首先通过构建表达Eco-gpt(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase,XGPRT,gpt)的哺乳动物细胞基因转移遗传选择标记(1-3 kb)和带有细菌人工染色体的基本功能基因序列的鸡马立克氏病病毒重组病毒转移载体pUAB-gpt-BAC11,将重组病毒转移载体与鸡马立克氏病病毒细胞总DNA共转染鸡胚成纤维细胞,在选择培养基中经过8轮加压筛选,获得并纯化重组病毒;将重组病毒细胞总DNA电转化大肠杆菌,筛选共获得38个BAC分子克隆化病毒,提取BAC-DNA转染鸡胚成纤维细胞以拯救重组病毒。结果表明,MDV-BAC2 DNA再次启动病毒感染,拯救了重组鸡马立克氏病病毒。成功构建了鸡马立克氏病病毒814株基因组全长感染性细菌人工染色体,为方便利用现代RED/ET基因重组系统对病毒进行反向遗传操作提供了技术平台;同时为研究鸡马立克氏病病毒的基因功能和开发新型马立克氏病疫苗奠定了基础。

关键词：鸡马立克氏病病毒细菌人工染色体分子克隆化病毒感染性分子克隆

几种鸡传染性支气管炎病毒活疫苗对中国流行毒株CK／CH／LDL／97I的保护作用评价

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病毒学报 2008年第2期24卷 111-116页

作者：张晓楠王钰李成仁刘乔然韩宗玺邵昱昊刘胜旺孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

选择我国应用的五株鸡传染性支气管炎活疫苗毒株（JAAS、IBN、Jilin、J9和H120）和当地流行毒株（CK／CH／LDL／97I）作为研究对象，对其S1基因进行序列比对分析，结果表明疫苗株与流行毒株的核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别不... 详细信息

选择我国应用的五株鸡传染性支气管炎活疫苗毒株（JAAS、IBN、Jilin、J9和H120）和当地流行毒株（CK／CH／LDL／97I）作为研究对象，对其S1基因进行序列比对分析，结果表明疫苗株与流行毒株的核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别不超过76．4％和78．7％。Sl基因的核苷酸系统发育树显示，疫苗株与流行毒株分属不同进化群，亲缘关系较远，属于不同的基因型。用这五株活疫苗进行针对强毒株CK／CH／LDL／97I株的免疫保护实验，可见临床发病率为30％～100％；攻毒5d后每组随机扑杀10只鸡，采集器官，应用RT-PCR法检测病毒，气管样品病毒检出率为50％～90％，肾脏样品病毒检出率为10％～30％。由此可见：我国目前使用的主要活疫苗对异种IBV分离株的感染不能提供完全的保护作用。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 Sl基因疫苗交叉保护

4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析

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病毒学报 2008年第2期24卷 117-125页

作者：施维松刘长军张艳萍秦运安张晓巍李晶梅陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

根据鸡马立克氏病病毒（MDV）GA株Meq基因序列，设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物，利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段，进行克隆测序，对4株MDV分离毒... 详细信息

根据鸡马立克氏病病毒（MDV）GA株Meq基因序列，设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物，利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段，进行克隆测序，对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析。序列比较显示，不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守，它们相互间氨基酸序列的同源性在96．5％～99．7％之间。4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变；3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变，这两处点突变是国内近几年分离株所特有的，国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化。分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性，但是这些规律性还有待进一步研究。

关键词：马立克氏病病毒 Meq基因序列比较定点突变

中国1995-2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析

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病毒学报 2007年第4期23卷 298-304页

作者：聂磊张庆霞韩宗玺邵昱昊荣骏弓刘胜旺孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

应用RT-PCR方法扩增到了我国1995-2004年20株IBV现地分离株的膜蛋白（Membrane,M）基因片段。序列测定表明,20株IBV分离株M基因开放阅读框由672-681bp组成,编码由223-226个氨基酸残基组成的多肽。与我国分离株LX4相比,M基因推导氨基酸... 详细信息

应用RT-PCR方法扩增到了我国1995-2004年20株IBV现地分离株的膜蛋白（Membrane,M）基因片段。序列测定表明,20株IBV分离株M基因开放阅读框由672-681bp组成,编码由223-226个氨基酸残基组成的多肽。与我国分离株LX4相比,M基因推导氨基酸序列的变异主要发生在2-17位、221-223位,其中4-6位存在氨基酸的插入和缺失,导致IBV毒株间M蛋白糖基化位点的差异。与GenBank中34株IBV参考毒株M蛋白基因推导氨基酸序列进行比较和分析,系统进化关系显示54株IBV毒株分属于5个进化群。我国IBV分离株M基因在进化关系上较为独立,主要分布在第Ⅱ群和第Ⅳ群,其中第Ⅱ群分离株和中国台湾毒株进化关系密切。此外,参考IBV国内分离株S1基因及N基因系统发育进化树的研究结果,并与M基因进行比较,表明我国IBV也存在着基因重组现象,尤其是疫苗毒和流行毒之间的重组。

关键词：传染性支气管炎病毒膜蛋白基因基因重组遗传变异

禽流感、新城疫二联五价灭活疫苗的免疫效果研究

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中国农业科学 2025年第1期 182-191页

作者：于晴晴周祥瑜李文昕刘艳晶王燕和新文何晨邓国华施建忠田国彬包红梅曾显营陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室/国家禽类实验动物资源库农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室哈尔滨维科生物技术有限公司

【背景】H5、H7、H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）是严重危害禽业的重要病原，接种油乳剂型灭活疫苗是预防禽流感和新城疫的主要手段。当前养殖场预防这些传染病至少需要... 详细信息

【背景】H5、H7、H9亚型禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）是严重危害禽业的重要病原，接种油乳剂型灭活疫苗是预防禽流感和新城疫的主要手段。当前养殖场预防这些传染病至少需要2种以上疫苗，导致家禽接种疫苗次数多，免疫负担重；另外，制备油乳剂型灭活疫苗的白油主要依赖进口，存在“卡脖子”风险。【目的】为了减少疫苗接种次数，降低免疫负担，对比国产和进口白油佐剂效果，本研究制备并评估了同时预防禽流感（H5+H7+H9）、新城疫的不同白油佐剂二联五价灭活疫苗，以期达到“一针防多病”的免疫效果，并为实现动物疫苗进口白油佐剂国产化替代提供数据支撑。【方法】将已构建的禽流感H5-Re13、H5-Re14、H7-Re4、H9-GX11583株和新城疫ND rLa-VII株共5株疫苗株分别接种鸡胚，收获尿囊液，经浓缩灭活后，按照1份抗原3份佐剂的比例加入不同的矿物油佐剂（Total、Marcol 52和HTM70），混合乳化，制成二联五价灭活疫苗，并分别以2 mL/只和0.5 mL/只的剂量通过肌肉注射接种3周龄SPF鸡，评价疫苗的安全性和有效性。【结果】免疫效力试验结果显示，3种白油佐剂制备的二联五价灭活疫苗对鸡均具有良好的安全性；3种白油佐剂疫苗接种鸡或免疫后均可产生针对H5-Re13株、H5-Re14株、H7-Re4株、H9-GX11583株和ND rLa-VII株有效的HI抗体，均可获得对效力检验毒株攻击的完全免疫保护。HI抗体持续期结果显示，3种白油佐剂灭活疫苗均可持续诱导高水平抗体半年以上，与进口白油（Total、Marcol 52）相比，国产白油HTM70诱导的HI抗体水平与进口白油Total差异不显著，高于进口白油Marcol 52，且国产白油佐剂HTM70批次间无明显差异。【结论】制备的禽流感（H5+H7+H9）、新城疫二联五价灭活疫苗对SPF鸡具有良好的免疫效果，且有望实现进口白油佐剂国产化替代。

关键词：禽流感新城疫多联多价灭活疫苗佐剂免疫效果

SARS冠状病毒S蛋白受体结合结构域的表达及其表位作图

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生物化学与生物物理进展 2005年第11期32卷 1030-1037页

作者：华荣虹童光志王云峰周艳君中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

严重急性呼吸综合征(SARS)是一种新出现的人类传染病,该病的病原是SARS冠状病毒(SARS-CoV).S蛋白是SARS冠状病毒的一种主要结构蛋白,它在病毒与宿主细胞受体结合以及诱导机体产生中和抗体中起重要作用.研究表明S蛋白与受体结合的核心区... 详细信息

严重急性呼吸综合征(SARS)是一种新出现的人类传染病,该病的病原是SARS冠状病毒(SARS-CoV).S蛋白是SARS冠状病毒的一种主要结构蛋白,它在病毒与宿主细胞受体结合以及诱导机体产生中和抗体中起重要作用.研究表明S蛋白与受体结合的核心区域为第318￣510氨基酸残基的片段.首先克隆并用pGEX-6p-1载体融合表达了该受体结合结构域,并且通过蛋白质印迹分析表明,该受体结合结构域融合蛋白能被SARS康复患者血清和S蛋白特异的单克隆抗体所识别.为了对这一区域进行抗原表位作图,进一步设计了一套23个覆盖受体结合结构域的长16个氨基酸残基的部分重叠短肽,并进行了GST融合表达.用免疫动物血清和单克隆抗体D3D1对23个融合蛋白进行蛋白质印迹和ELISA免疫反应性分析,结果鉴定出两个抗原表位SRBD3(F334PSVYAWERKKISNCV349)和表位D3D1(K447LRPFERDI455).其结果对进一步分析S蛋白结构与功能以及诊断试剂和基因工程疫苗的研究有一定意义.

关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS—CoV) 纤突蛋白(S蛋白) 表位

PEDV S蛋白B细胞抗原表位的筛选和鉴定

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生物化学与生物物理进展 2007年第9期34卷 971-977页

作者：孙东波朗洪武时洪艳陈建飞崔晓辰王承宝佟有恩冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001 中国兽医药品监察所北京100081

以猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S基因的免疫优势区S1(1～2367bp)为靶基因,利用基于gⅢ表达外源多肽的fd丝状噬菌体展示系统,构建S1基因噬菌体展示肽库,以纯化病毒制备的兔抗PEDV多克隆血清为靶蛋白,对S1基... 详细信息

以猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S基因的免疫优势区S1(1～2367bp)为靶基因,利用基于gⅢ表达外源多肽的fd丝状噬菌体展示系统,构建S1基因噬菌体展示肽库,以纯化病毒制备的兔抗PEDV多克隆血清为靶蛋白,对S1基因噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选,结果获得3个高亲和力的序列,分别命名为S1P1(248～280位氨基酸)、S1P2(442～499位氨基酸)和S1P3(697～742位氨基酸).ELISA和蛋白质印迹结果显示,S1P1、S1P2和S1P3短肽都能被兔抗PEDV多克隆血清识别,其中S1P3反应性最强.为了进一步揭示S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性,制备了3个短肽GST融合蛋白和它们串连后GST融合蛋白的单因子血清,间接免疫荧光试验(IFA)结果证实,抗S1P2-GST、S1P3-GST和S1P123-GST融合蛋白的单因子血清能够识别Vero细胞培养物中天然的PEDV.

关键词：猪流行性腹泻病毒 S蛋白抗原表位噬菌体展示

不同启动子在昆虫杆状病毒表达系统中的活性分析

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生物工程学报 2008年第4期24卷 598-603页

作者：王煜高辉陈川赵和平李淼孙元仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室

为了比较不同启动子在杆状病毒/昆虫细胞中的活性,利用对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,wssv)的ie1启动子及其截短的mie1启动子、杆状病毒ETL启动子及其加长的mETL启动子以及杆状病毒多角体启动子P_(PH),构建了含有不同... 详细信息

为了比较不同启动子在杆状病毒/昆虫细胞中的活性,利用对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,wssv)的ie1启动子及其截短的mie1启动子、杆状病毒ETL启动子及其加长的mETL启动子以及杆状病毒多角体启动子P_(PH),构建了含有不同启动子控制下的EGFP报告基因的重组杆状病毒,分别感染Sf9昆虫细胞,利用流式细胞术检测报告基因的表达水平。结果表明,WSSV的ie1启动子和杆状病毒的mETL启动子在昆虫细胞sf9细胞中都具有较强而旱的启动子活性,能够控制报告基因早期高效表达,而P_(PH)在感染后期才表现较强活性。并且研究中发现,杆状病毒同源重复区(hr1)可以增强ETL启动子的活性。

关键词：重组杆状病毒启动子活性流式细胞术