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毒力岛基因SPI-1和SPI-2双缺失对肠炎沙门菌形态、毒力和免疫原性影响的研究

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中国预防兽医学报 2024年第6期46卷 553-560页

作者：刘高松吕雪莲田秋丰衣菲于申业中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

沙门菌毒力岛基因SPI-1和SPI-2分别编码Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的T3SS-1和T3SS-2,T3SS可以将沙门菌分泌的效应蛋白转运至宿主细胞中。为分析毒力岛基因SPI-1和SPI-2缺失对肠炎沙门菌生物学特性、致病性和免疫原性的影响,本实验室前期构建... 详细信息

沙门菌毒力岛基因SPI-1和SPI-2分别编码Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的T3SS-1和T3SS-2,T3SS可以将沙门菌分泌的效应蛋白转运至宿主细胞中。为分析毒力岛基因SPI-1和SPI-2缺失对肠炎沙门菌生物学特性、致病性和免疫原性的影响,本实验室前期构建了肠炎沙门菌SM6株毒力岛基因SPI-1和SPI-2双缺失株(SM6ΔT3SS),本研究通过绘制亲本株和缺失株的生长曲线,采用扫描电镜观察二者的形态,并测定二者对人结直肠腺癌细胞(Caco-2细胞)的黏附性与侵袭力。生长曲线结果显示,培养5 h时,SM6ΔT3SS株的生长速度显著快于亲本株SM6(P实验期SM6ΔT3SS免疫组鸡均存活且无明显的临床症状、无死亡,肝脏和肠黏膜仅出现轻微病理损伤,对照组鸡组鸡攻毒后14 d内死亡率达80%,肝脏和肠黏膜均出显较明显的病变。上述结果表明,SM6ΔT3SS株能够刺激SPF鸡产生较高水平的体液免疫和细胞免疫反应,对SPF鸡的致病性降低,并对鸡有较好的免疫保护效力。本研究为阐明沙门菌致病机制和研发安全有效的沙门菌减毒活疫苗奠定了良好基础,也为沙门菌病的防控提供了新思路。

关键词：肠炎沙门菌 Ⅲ型分泌系统毒力岛形态毒力免疫效力减毒疫苗

非洲猪瘟病毒消毒策略及活病毒鉴别检测技术研究进展

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中国兽医学报 2024年第4期44卷 823-833页

作者：樊高成高晓薇杨玉莹罗玉子仇华吉长江大学动物科学学院湖北荆州434023 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室黑龙江哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种出血性、高度接触性传染病。由于目前我国尚无针对ASF的有效疫苗,猪场仍以生物安全防控为主,消毒则是生物安全防控中极其... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和野猪引起的一种出血性、高度接触性传染病。由于目前我国尚无针对ASF的有效疫苗,猪场仍以生物安全防控为主,消毒则是生物安全防控中极其重要的一环。当前,猪场的消毒方式众多,但对消毒效果的评价技术甚少,无法辨别消毒后病毒是否具有感染性,存在巨大的安全隐患。通过对灭活病毒的方式、常见的活病毒鉴别方法及局限性进行综述,并探讨光敏核酸染料结合分子检测技术运用到ASFV灭活效果评价中的可行性,以期对ASF的防制提供帮助。

关键词：非洲猪瘟病毒活病毒鉴别消毒

非洲猪瘟病毒毒力相关基因的鉴定及其功能研究进展

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中国兽医学报 2024年第4期44卷 834-846页

作者：蓝靖陆战豪罗瑞宋鑫孙元杨玉莹王涛仇华吉长江大学动物科学学院湖北荆州434023 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室黑龙江哈尔滨150069

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪所引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病。自2018年ASF传入我国以来,已经流行了5年多,病毒已经演化出了低毒力的基因Ⅱ型和基因Ⅰ型弱毒... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪所引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病。自2018年ASF传入我国以来,已经流行了5年多,病毒已经演化出了低毒力的基因Ⅱ型和基因Ⅰ型弱毒株,以及基因Ⅱ型和Ⅰ型重组毒株,这为该病的防制和疫苗研发带来了巨大挑战。ASF减毒活疫苗(live attenuated vaccines,LAVs)能够诱导良好的免疫保护,具备商品化疫苗的潜力。鉴定和研究毒力相关基因(virulence-associated genes,VAGs)对于LAVs的研发至关重要,也是ASFV研究的热点和难点。因此,对已鉴定的ASFV VAGs进行全面系统的综述,总结VAGs编码蛋白的作用机制,同时展望如何全面鉴定ASFV VAGs及其编码蛋白的作用机制,以及如何利用已知的VAGs科学设计安全高效的LAVs,以期为ASFV的致病机制及LAVs研发提供参考。

关键词：非洲猪瘟非洲猪瘟病毒毒力相关基因减毒活疫苗致病机制

山羊源伪结核棒状杆菌的分离鉴定及其毒力评价

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黑龙江畜牧兽医 2024年第10期 65-70,114,115页

作者：崔宁党光辉鹿萍郭若男姜艳艳陈凡若刘思国新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室哈尔滨150069

为了确定齐齐哈尔市某山羊养殖场疑似患有伪结核病病羊的病原及其毒力,试验从不同病羊的皮下脓包中采集脓汁病料3份,通过细菌的分离与纯化、生化鉴定、16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析确定病原,并通过致病性试验对分离株的毒力进行评... 详细信息

为了确定齐齐哈尔市某山羊养殖场疑似患有伪结核病病羊的病原及其毒力,试验从不同病羊的皮下脓包中采集脓汁病料3份,通过细菌的分离与纯化、生化鉴定、16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析确定病原,并通过致病性试验对分离株的毒力进行评价。结果表明:共得到3株分离株,其菌落形态和生化特性菌与伪结核棒状杆菌相符,分别命名为CP045、CP073、CP969;分离株CP045、CP073、CP969的16S rDNA基因序列与伪结核棒状杆菌参考株的相似性分别高达98.8%、100%、99.8%,进一步确定3株分离株均为伪结核棒状杆菌。注射分离株CP073的3只小鼠中有2只于注射后36~48 h陆续死亡,1只精神极度沉郁、食欲不振;注射分离株CP045、CP969的3只小鼠于注射后5 d内均未见死亡,但状态不佳。注射分离株CP045、CP073、CP969的小鼠肝脏均不同程度出血、肿大,脾脏轻微出血;注射分离株CP073的小鼠皮肤表面有黄色脓汁渗出,皮下有黄白色玉米粒大小的结核样脓肿;注射分离株CP045和CP969的小鼠皮下未见明显脓肿。说明该山羊养殖场疑似患有伪结核病的病羊感染了伪结核棒状杆菌,分离到的3株伪结核棒状杆菌毒力不同,其中分离株CP073可引起小鼠死亡,毒力较分离株CP045、CP969强。

关键词：伪结核棒状杆菌伪结核病分离鉴定 16S rDNA 致病性试验生化鉴定

鸡chNHE1精准基因编辑细胞系的构建及其抗ALV-J感染的研究

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畜牧兽医学报 2024年

作者：张学富陈运通范文瑞张子博于蒙蒙王素艳祁小乐李留安高玉龙天津农学院动物科学与动物医学学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室禽免疫抑制病创新团队

为构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系，本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统，在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变、W38进行缺失，同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞... 详细信息

为构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系，本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统，在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变、W38进行缺失，同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞分选获得48株单克隆细胞系，PCR及测序分析结果显示，其中有14株单克隆细胞系的chNHE1成功发生V33突变、W38缺失以及34-37位氨基酸的密码子同义替换，基因编辑效率为29%。为了验证chNHE1基因编辑DF-1细胞系的遗传稳定性及增殖水平，对传至第25代的细胞系进行测序分析，结果显示，chNHE1基因未发生回复性突变；进一步细胞计数分析结果显示，chNHE1基因编辑细胞系增殖水平未受到影响；为了评价chNHE1基因编辑细胞系抗ALV-J感染的能力，分别利用ALV-J荧光报告病毒（ALV-J-GFP）及ALV-J原型毒株（HPRS-103）对其进行病毒感染试验，荧光观察结果及流式细胞分析结果显示，chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI ALV-J-GFP的感染；进一步间接免疫荧光试验、PCR扩增试验以及病毒滴度测定试验结果显示，chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI HPRS-103毒株及0.1 MOI JL08CH3-1毒株的感染。本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统结合流式细胞分选，成功构建了chNHE1基因编辑细胞系，其可完全抵抗ALV-J的感染，且该细胞系遗传稳定性及增殖活性良好，为建立抗ALV-J感染的新技术提供了理论支持及基因编辑靶点。

关键词： DF-1 chNHE1 ALV-J 基因编辑

一株基因Ⅲ型禽呼肠孤病毒变异株的分离及其灭活疫苗免疫原性初步评价

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中国家禽 2024年第8期46卷 69-75页

作者：刘芮李晓涵高金慧刘长军祁小乐李凯张艳萍崔红玉王素艳高玉龙高立中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室禽免疫抑制病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况及其生物学特性和致病特点,试验采集黑龙江省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR、序列分析及常见禽类外源病毒检测鉴定,进一步通过对体外复制能力、致病... 详细信息

为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况及其生物学特性和致病特点,试验采集黑龙江省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR、序列分析及常见禽类外源病毒检测鉴定,进一步通过对体外复制能力、致病性、血清交叉中和能力及灭活疫苗免疫抗体水平检测,分析其致病性、抗原性和免疫原性。结果显示:成功从病鸡关节组织中分离到1株ARV,命名为ARV-HLJ21-1690401,该分离株位于基因Ⅲ型分支,与基因Ⅲ型参考株ISR5233和42563-4-2005遗传距离较近,氨基酸序列相似性为83.4%和81.7%,而与其他基因型分离株遗传距离较远;该分离株在LMH细胞上增殖良好,对鸡胚和SPF鸡均具有明显的致病性,可引起接种鸡胚90%死亡,接种6周龄SPF鸡可引起100%发病;该分离株具有良好的免疫原性,其制备的灭活疫苗免疫SPF鸡可诱导产生较好的抗体水平。综上所述,研究成功分离到一株具有致病性和良好免疫原性的基因Ⅲ型ARV变异株,为了解我国ARV变异株的流行及遗传进化特征提供了重要理论依据。

关键词：禽呼肠孤病毒基因Ⅲ型变异株致病性灭活疫苗

IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响

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中国农业科学 2024年第7期57卷 1407-1416页

作者：张晓战董轩志吕楠楠刘懿雯马新甜王林青夏艳勋蒋增海郭运泽赵攀登宋予震杨德成边传周河南牧业经济学院动物医药学院郑州师范学院/分子生物学郑州市重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

【背景】塞内卡病毒（senecavirus A, SVA）是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区（untranslated region, UTR）中的内部核糖体进入位点（IRES）元件在病毒复制过程中发挥重要作用。... 详细信息

【背景】塞内卡病毒（senecavirus A, SVA）是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区（untranslated region, UTR）中的内部核糖体进入位点（IRES）元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年我国出现IRES核心区Domain II 12个碱基非连续插入的自然突变SVA毒株，在病毒复制和致病性方面存在明显改变。【目的】探讨IRES Domain II区域发生的突变对SVA的复制及细胞嗜性的影响，为进一步了解SVA致病机制奠定基础。【方法】以实验室前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础，通过定点突变的方式，逐步将其IRES Domain II核心区域308—317 nt的9个碱基（ACTCAAGCG）替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基（CACGCCTGCCGATAGACGATT），构建重组载体pHeN-1/2018-i12并进行了病毒拯救。随后，利用病毒基因组克隆测序、间接免疫荧光试验和Western blot试验对所拯救病毒进行鉴定，同时验证了IRES核心区12个碱基插入突变对SVA病毒体外复制能力和细胞嗜性的影响。【结果】将构建完成的重组载体pHeN-1/2018-i12转染细胞，盲传至P2代，获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的IRES突变病毒rHeN-1/2018-i12。病毒连续传代后测序结果表明rHeN-1/2018-i12遗传稳定，P5代病毒基因组序列未发生碱基突变，P10代病毒IRES区域没有出现突变现象。用低代次的突变病毒rHeN-1/2018-i12体外感染本体动物猪源细胞系PK-15和IBRS-2，及仓鼠源细胞系BHK-21，进行细胞感染试验，结果表明rHeN-1/2018-i12与亲本毒株rHeN-1/2018在PK-15、IBRS-2和BHK-21中均能导致明显的细胞病变，表现出相似的生长曲线趋势，表明IRES核心区Domain II 12个碱基突变不能够改变对上述细胞的嗜性；但SVA突变病毒和亲本株在不同细胞中的病变时间及病毒滴度上存在较大的差异，rHeN-1/2018-i12株在细胞中生长能力较其亲本株rHeN-1/2018差，诱使细胞病变的时间较晚，在感染24 hpi，两者病毒滴度相差可达10倍。【结论】本研究基于SVA反向遗传操作系统构建并拯救SVA IRES突变毒株，确定了IRES突变对SVA生物学特性的影响，有助于我们更好地了解SVA致病机制，拓宽我们对病毒IV型IRES功能的认识。

关键词：塞内卡病毒内部核糖体进入位点反向遗传操作系统病毒复制细胞嗜性

鸡肠炎沙门菌毒力蛋白SipD生物信息学分析及原核表达

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中国畜牧兽医 2024年第7期51卷 2998-3007页

作者：原亮韩晓玺巩颖超樊夏楠郝蓓莉郝双双李昌文常轶聪李睿刘芳萍东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030 黑龙江省动物疾病防控技术与制剂创制重点实验室哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所哈尔滨150069

【目的】预测肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis, SE)SipD蛋白的潜在生物学功能,并表达纯化该蛋白,为探索SipD蛋白作为抗沙门菌纳米抗体的候选抗原提供理论依据。【方法】利用DNAStar软件对GenBank中公布的不同血清型沙门菌株SipD蛋白... 详细信息

【目的】预测肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis, SE)SipD蛋白的潜在生物学功能,并表达纯化该蛋白,为探索SipD蛋白作为抗沙门菌纳米抗体的候选抗原提供理论依据。【方法】利用DNAStar软件对GenBank中公布的不同血清型沙门菌株SipD蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并通过在线软件对SipD蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中SipD基因序列设计引物,以鸡肠炎沙门菌标准菌株(ATCC 13076)为模板,PCR扩增SipD基因,构建pET-32a(+)-SipD重组质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。应用IPTG诱导重组SipD蛋白的表达,并利用Ni^(2+)亲和层析法纯化。应用SDS-PAGE和Western blotting检测SipD蛋白的表达情况。【结果】SipD蛋白在不同血清型沙门菌之间高度保守;SipD蛋白分子式为C_(1619)H_(2573)N_(441)O_(540)S_(8),无跨膜区,为膜外蛋白,不存在信号肽,该蛋白的第1~343位氨基酸具有来自超家族侵袭质粒抗原IpaD的保守结构域;SipD蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲占比分别为59.18%、6.41%、3.21%和31.20%;SipD蛋白与B细胞结合的抗原表位有12个。SipD基因长1 029 bp,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以可溶性蛋白的形式表达;经纯化、透析、浓缩后蛋白浓度为8.6 mg/mL。SDS-PAGE和Western blotting分析发现,SipD蛋白纯度较高,可用于免疫羊驼制备纳米抗体。【结论】SipD蛋白为膜外蛋白,具有较多抗原结合位点;经表达纯化得到纯度较高的SipD重组蛋白,为进一步制备靶向鸡肠炎沙门菌SipD蛋白的纳米抗体提供材料。

关键词：鸡肠炎沙门菌 SipD蛋白生物信息学原核表达

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二氢杨梅素对雏鸡免疫功能的影响

中国畜牧兽医 2024年第6期51卷 2409-2417页

作者：郝双双曹传保巩颖超樊夏楠蒋欣茹嵇正华常轶聪李睿李昌文刘芳萍东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030 黑龙江省动物疾病防控技术与制剂创制重点实验室哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所哈尔滨150069

【目的】探究二氢杨梅素(DHM)对雏鸡免疫器官指数、免疫器官组织学形态及血清中免疫因子含量的影响。【方法】选取150只7日龄海兰白蛋雏鸡,雌雄各半,随机分为5组,每组30只,对照组给予基础饲粮,给药组分别在基础饲粮中添加0.025%、0.05%... 详细信息

【目的】探究二氢杨梅素(DHM)对雏鸡免疫器官指数、免疫器官组织学形态及血清中免疫因子含量的影响。【方法】选取150只7日龄海兰白蛋雏鸡,雌雄各半,随机分为5组,每组30只,对照组给予基础饲粮,给药组分别在基础饲粮中添加0.025%、0.05%、0.1%、0.2%DHM。试验于给药7、14、21、28及35 d时,每组随机选取6只雏鸡心脏采血,收集免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊)分别称重,计算不同给药组雏鸡免疫器官指数,检测血清免疫球蛋白G(IgG)、补体(C3、C4)含量,并对给药35 d时雏鸡免疫器官进行HE染色观察组织形态。【结果】与对照组相比,0.2%DHM组在给药35 d时雏鸡胸腺指数显著升高(P<0.05),0.2%DHM组在给药28和35 d时雏鸡脾脏指数均显著升高(P<0.05),0.1%、0.2%DHM组雏鸡法氏囊指数在给药7 d时显著增高(P<0.05)。饲粮中添加DHM后雏鸡免疫器官细胞排列整齐、淋巴细胞数量增多、结构更加致密。与对照组相比,0.05%、0.1%、0.2%DHM组在给药28和35 d时雏鸡血清IgG含量均显著增加(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清IgG含量在给药21和28 d时显著高于其他组,在35 d时显著高于0.025%和0.05%DHM组(P<0.05)。与对照组相比,0.1%、0.2%DHM组雏鸡血清中补体C3含量在不同给药时间均显著升高(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清补体C3含量在给药14和28 d时显著高于其他组,在21和35 d时显著高于0.025%和0.05%DHM组(P<0.05)。与对照组相比,0.05%、0.1%和1.2%DHM组在14、28和35 d时雏鸡血清补体C4含量显著升高(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清补体C4含量在给药14、21和28 d时显著高于其他组,在35 d时显著高于0.025%DHM组(P<0.05)。【结论】饲粮中添加0.2%DHM能促进雏鸡免疫器官生长发育,并且能提高雏鸡免疫因子的表达,增强雏鸡免疫功能。

关键词：二氢杨梅素免疫功能雏鸡

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