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2019-2022年中国H6N1亚型禽流感病毒的生物学特性分析

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中国农业科学 2024年第9期57卷 1820-1832页

作者：陈源崔鹏飞施建忠张元成于晴晴颜成张亚萍王丛丛张洁王燕邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室/国家禽类实验动物资源库

【背景】H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）广泛流行于我国南方地区，是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配，并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段，产生新型重组病毒，进而威胁... 详细信息

【背景】H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）广泛流行于我国南方地区，是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配，并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段，产生新型重组病毒，进而威胁人类健康。【目的】通过对我国H6N1亚型AIV的演化动态及其相关生物学特性分析研究，为我国禽流感的综合防控提供数据支持。【方法】采集2019—2022年我国25个省（直辖市、自治区）的活禽交易市场及养殖场家禽喉和泄殖腔拭子，通过接种鸡胚分离到7株H6N1亚型AIVs并对其进行全基因组测序，分析其遗传演化特征、受体结合特性及其对SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性。【结果】遗传演化分析表明，7株病毒的基因与分离于北美及东南亚地区的野鸟源病毒基因同源性较高，基因来源复杂，具有明显的遗传多样性。贝叶斯演化分析表明，H6亚型AIV HA基因曾发生过多次的跨洲际传播，欧亚谱系病毒在北美地区也有着较长时间流行。1株病毒HA基因与北美地区毒株基因高度同源，根据贝叶斯演化分析结果，推测该病毒在野鸟体内经历了复杂的基因重配后形成，后经野鸟传入我国。特殊氨基酸位点分析结果显示，病毒HA蛋白裂解位点序列均为PQIETR↓GLF，符合低致病性AIV特征；此外，另有1株病毒的NP蛋白发生Y52H突变，据报道，该突变对AIV获得抵抗人干扰素刺激基因BTN3A3的能力起到关键作用。受体结合特性分析表明，部分毒株具有双受体结合特性，但结合人源受体能力弱于结合禽源受体能力。病毒对SPF鸡的感染性试验表明，鸡感染A/chicken/Jiangxi/S40445/2019(H6N1)后能通过呼吸道及消化道排毒，并且病毒可在鸡群内通过接触传播。鸡感染A/duck/Jiangxi/S10941/2019(H6N1)后仅有少数鸡通过呼吸道排毒，病毒无法在鸡群间通过接触传播。BALB/c小鼠的感染性试验表明，H6N1亚型AIV无需提前适应便可在小鼠呼吸道内有效复制，但对小鼠仍呈低致病力。【结论】2019—2022年分离于我国的H6N1亚型AIV基因大部分来源于野鸟源病毒，候鸟可经东亚-澳大利亚迁徙路线将病毒传入我国；部分病毒能够结合人源唾液酸受体并在小鼠呼吸道内有效复制，表明该亚型病毒对公共卫生安全构成潜在威胁。

关键词： H6N1 禽流感病毒跨洲际传播重配感染性

猪急性腹泻综合征冠状病毒S蛋白多克隆抗体的制备及在检测该病毒感染中的应用

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中国预防兽医学报 2024年第5期46卷 499-504页

作者：刘大凯韩郁茹张记宇张燎原冯廷帅杨小曼曾苗苗时洪艳秦毅斌石达冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 广西兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530001

为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和... 详细信息

为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb),本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp),并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中,构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD,经双酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达,通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性。结果显示,r S1-CTD以包涵体的形式表达,在40 ku处出现特异性条带。诱导表达后的r S1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心,SDS-PAGE检测后切胶纯化,得到纯化的重组蛋白。利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33μg/m L。将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔,并在3免一周后采血,分离血清获得S1-CTD蛋白PAb。将SADS-Co V感染Vero E6细胞24 h后,以获得的兔PAb为一抗,分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性。Western blot结果显示,在约250 ku处出现特异性条带,而阴性对照组无该条带;IFA结果显示,SADS-Co V感染的细胞中出现绿色荧光,而阴性对照细胞无绿色荧光。将SADS-Co V感染仔猪的回肠组织制备病理切片,以制备的PAb为一抗,通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-Co V的抗原。结果显示,该组织切片中出现棕色阳性信号,而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号。表明该PAb可与感染SADS-Co V的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应。综上所述,本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性,可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-Co V的感染,为后续SADS-Co V检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础。

关键词：猪急性腹泻综合征冠状病毒 S蛋白原核表达多克隆抗体初步应用

基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 300-310页

作者：白昀谢青云欧阳伟甘源袁厅赵东明步志高邵国青冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建... 详细信息

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。

关键词：非洲猪瘟 sIgA抗体 ELISA 早期诊断

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纳米抗体结构特征与制备研究进展

农业生物技术学报 2024年第1期32卷 209-219页

作者：孔静郑楠王加启赵圣国中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室

纳米抗体是仅由重链组成的具有特异性识别抗原的小分子物质，具有广泛的应用前景。本文介绍了骆驼(Camelus)体内3种不同的抗体亚型，揭示了传统抗体与纳米抗体在二硫键种类与位置、骨架区及互补决定区组成中的异同，论述了纳米抗体生产... 详细信息

纳米抗体是仅由重链组成的具有特异性识别抗原的小分子物质，具有广泛的应用前景。本文介绍了骆驼(Camelus)体内3种不同的抗体亚型，揭示了传统抗体与纳米抗体在二硫键种类与位置、骨架区及互补决定区组成中的异同，论述了纳米抗体生产简便、特异性强、稳定性高、溶解度高等特性，阐述了纳米抗体的筛选表达方法，即可以运用噬菌体展示、酵母双杂交等技术，筛选得到特异性的纳米抗体，因其结构简单，故可以在大肠杆菌(Escherichia coli)及酵母菌(Saccharomyces)等生物中进行表达，从而可以更好地研究其功能。本文为今后纳米抗体的开发和应用提供理论依据。

关键词：纳米抗体结构特征制备

植物提取物抑制反刍动物瘤胃甲烷排放研究进展

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动物营养学报 2024年第5期36卷 2752-2760页

作者：肖莉刘子豪南雪梅熊本海黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室北京100193

植物及其次生代谢产物含有多种生物活性物质,具有多能效性,可作为天然饲草资源或饲料添加剂,用于反刍动物营养补充及疾病防治。自2019年“禁抗”目标提出以来,植物提取物成为替代抗生素的首要研究对象,发挥着不可或缺的重要作用。此外,... 详细信息

植物及其次生代谢产物含有多种生物活性物质,具有多能效性,可作为天然饲草资源或饲料添加剂,用于反刍动物营养补充及疾病防治。自2019年“禁抗”目标提出以来,植物提取物成为替代抗生素的首要研究对象,发挥着不可或缺的重要作用。此外,由于近年来温室效应愈演愈烈,给人类社会带来了巨大的危害,而多种植物提取物凭借其调节瘤胃菌群、有效抑制产甲烷菌群丰度的特性引起重视。植物提取物具有来源广、无污染、低毒性等特点,使其成为一类极具潜力的绿色、天然甲烷抑制剂。本文就植物提取物抑制甲烷排放的研究进展进行了综述总结,为实现甲烷减排提供理论参考和实践指导。

关键词：植物提取物反刍动物甲烷产甲烷菌活性物质瘤胃发酵

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口蹄疫病毒O型全自动磁微粒CLIA抗体定量检测方法的建立

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中国农业科学 2024年第4期57卷 810-819页

作者：包艳芳蒋韬何莉吕律李涛善李昕孙燕燕杨光魏婷潘晓乐林密兰州兽研生物科技有限公司中国农业科学院兰州兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室/国家口蹄疫参考实验室

【背景】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、烈性传染病，疫苗接种是预防临床口蹄疫的有效措施。免疫抗体水平监测则是评估疫苗免疫效果、制定免疫程序的重要依据，是免疫工作和疫情防控必不可少... 详细信息

【背景】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、烈性传染病，疫苗接种是预防临床口蹄疫的有效措施。免疫抗体水平监测则是评估疫苗免疫效果、制定免疫程序的重要依据，是免疫工作和疫情防控必不可少的关键环节，因此建立高效、快速、全自动的抗体检测方法具有重要意义。【目的】基于磁微粒(micromagnetic particles,MPs)化学发光免疫分析技术(CLIA)，建立一种新型、全自动、可定量的口蹄疫病毒O型抗体检测方法，为口蹄疫免疫监测和疫情防控提供技术支撑。【方法】使用纳米材料磁微粒为固相载体和分离载体包被捕获抗体，用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)标记检测抗体，经过条件优化建立了一种新型磁微粒CLIA检测方法(magnetic particle chemiluminescence immunoassay,MP-CLIA)。本方法首先加入磁微粒-兔抗偶联物(magnetic particle-polyclonal antibodies,MPs-p Abs)、待测样本、口蹄疫病毒O型抗原，37℃孵育；再加入适量酶标抗体(ALP-p Abs),37℃孵育；最后加入化学发光底物AMPPD，检测相对发光强度(relative light unit,RLU)。研究通过检测标准品拟合标准曲线，并应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)确定检测方法的判定标准；利用质控样本进行方法学评价，同时检测田间样本，并和液相阻断ELISA(LPB-ELISA)比对，验证临床检测效果。【结果】优化后最佳反应条件为磁微粒浓度0.25 mg·m L-1、口蹄疫病毒O型抗原1﹕1 000稀释、酶标抗体1﹕2 000稀释、加样量20μL。整个检测过程均在全自动化学发光免疫分析仪中完成，反应时间20 min，在抗体含量0—1 280 U(效价0—1﹕2 048)范围内标准曲线R2>0.99，可进行定量检测。该方法敏感性为94.66%；特异性为97.10%，检测口蹄疫A型、Asia I型血清型特异性为97.14%，与塞内卡病毒(SVV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、牛流行热病毒(BEFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、羊痘病毒(QRFV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体阳性血清无交叉反应；重复检测变异系数CV值<10%；田间样本检测结果与LPB-ELISA符合率为94.69%，定量结果相关系数R2为0.8473,P<0.0001，相关性显著。【结论】建立的MP-CLIA方法耗时短、操作简便，配套国产全自动化学发光仪，可进行全自动化检测，是一种新型、高效的口蹄疫病毒O型抗体定量检测方法，本方法对应的试剂盒已经完成中试生产和临床检测试验，在全国不同区域试用效果较好，具有较高的临床应用价值。

关键词：磁微粒化学发光免疫分析法口蹄疫磁微粒全自动化

非洲猪瘟病毒pE120R蛋白单克隆抗体的制备

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 388-394页

作者：刘传霞王晓李雪雯鲍苗菲李婷婷陈欣翁长江郑君中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、动物疫病预防控制国家重点实验室国家非洲猪瘟专业实验室基础免疫创新团队哈尔滨150069

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)衣壳蛋白pE120R,并制备单克隆抗体,为其功能研究提供材料。以pCAGGS-Flag-pE120R为模板扩增pE120R基因片段,构建原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达为可溶性pE... 详细信息

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)衣壳蛋白pE120R,并制备单克隆抗体,为其功能研究提供材料。以pCAGGS-Flag-pE120R为模板扩增pE120R基因片段,构建原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达为可溶性pE120R蛋白,采用GST Beads纯化pE120R蛋白,免疫BALB/c小鼠,然后取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA方法筛选获得了1株能够稳定分泌pE120R单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果表明,成功构建了原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R,并获得较高纯度的pE120R蛋白。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果显示,pE120R单抗能特异性识别HEK293T细胞转染质粒表达的Flag-pE120R蛋白和肺泡巨噬细胞(PAMs)感染ASFV后表达的pE120R蛋白。该单抗的结合位点在30~60aa区域,并且该单抗亚类鉴定重链为IgG2a。本研究成功表达并纯化了可溶性的pE120R蛋白;制备了抗pE120R的单抗隆抗体,该抗体具有良好的特异性,为深入探讨ASFV pE120R蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 pE120R蛋白原核表达单抗隆抗体

绵羊PRSS12基因多态性及其与生长性状的关联分析

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农业生物技术学报 2024年第7期32卷 1587-1595页

作者：熊金珂鲍晶晶毕亚珍胡文萍张莉中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/畜禽生物育种全国重点实验室

绵羊(Ovis aries)生长性状相关分子标记的鉴定对于提高绵羊产业的经济效益具有重要意义。丝氨酸蛋白酶12 (serine protease 12, PRSS12)，又称为神经胰蛋白酶，在中枢神经系统特异性表达，与多种神经功能相关。为探究PRSS12基因的多态... 详细信息

绵羊(Ovis aries)生长性状相关分子标记的鉴定对于提高绵羊产业的经济效益具有重要意义。丝氨酸蛋白酶12 (serine protease 12, PRSS12)，又称为神经胰蛋白酶，在中枢神经系统特异性表达，与多种神经功能相关。为探究PRSS12基因的多态性及其与湖羊和乌珠穆沁羊生长性状之间的相关性，本研究采用基因芯片技术对1 008只湖羊和336只乌珠穆沁羊进行基因分型，并与生长性状进行关联分析，以鉴定绵羊生长发育相关分子标记。基因分型结果表明，在乌珠穆沁羊群体中检测到2个SNP位点，其中rs402399470G>A位点呈现低度多态，rs418440631G>A位点呈现中度多态；在湖羊群体中仅检测到1个SNP位点，即rs418440631G>A，表现为低度多态。使用一般线性模型将乌珠穆沁羊和湖羊的基因型和生长性状数据进行相关性分析，结果表明，rs402399470G>A位点与乌珠穆沁羊4月龄体重和6月龄胸宽显著相关(PA位点与乌珠穆沁羊4月龄胸围和管围以及6月龄胸围显著相关(P所述，PRSS12基因的rs402399470G>A和rs418440631G>A位点可作为绵羊生长性状的潜在分子遗传标记。本研究为肉羊育种和选育提供了参考依据。

关键词：丝氨酸蛋白酶12基因(PRSS12) 湖羊乌珠穆沁羊生长发育性状关联分析

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单细胞转录组测序技术在家养动物中的应用

畜牧兽医学报 2024年

作者：张肖旭李昊冯平捷杨豪李新月吕冉潘章源储明星中国农业科学院北京畜牧兽医研究所畜禽生物育种全国重点实验室

单细胞转录组测序技术（single cell RNA sequencing， scRNA-seq）可以以高精度分辨率鉴定单个细胞类型和细胞状态，打破普通转录组测序（bulk RNA sequencing， RNA-seq）无法探究目标细胞具体表达特征的困境，在各个领域的探索中起... 详细信息

单细胞转录组测序技术（single cell RNA sequencing， scRNA-seq）可以以高精度分辨率鉴定单个细胞类型和细胞状态，打破普通转录组测序（bulk RNA sequencing， RNA-seq）无法探究目标细胞具体表达特征的困境，在各个领域的探索中起到重要作用，目前广泛应用于人类及小鼠发育生物学、肿瘤学、免疫学、复杂疾病、肠道微生物组及临床应用等诸多领域。近年来scRNA-seq在畜牧业领域也开展了一些开创性的研究并获得了一系列的成果，主要集中在动物繁殖性能、胚胎发育、关键性状解析等方面，但相较于在人类上的应用还较为薄弱，在其他领域的应用也仍有待深入。本文主要综述了scRNA-seq的工作流程及其在家养动物中应用的研究进展，以期为提高scRNA-seq分析效率以及在家养动物中的创新应用提供参考。

关键词：单细胞转录组测序家养动物