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一株基因Ⅲ型禽呼肠孤病毒变异株的分离及其灭活疫苗免疫原性初步评价

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中国家禽 2024年第8期46卷 69-75页

作者：刘芮李晓涵高金慧刘长军祁小乐李凯张艳萍崔红玉王素艳高玉龙高立中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室禽免疫抑制病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况及其生物学特性和致病特点,试验采集黑龙江省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR、序列分析及常见禽类外源病毒检测鉴定,进一步通过对体外复制能力、致病... 详细信息

为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况及其生物学特性和致病特点,试验采集黑龙江省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR、序列分析及常见禽类外源病毒检测鉴定,进一步通过对体外复制能力、致病性、血清交叉中和能力及灭活疫苗免疫抗体水平检测,分析其致病性、抗原性和免疫原性。结果显示:成功从病鸡关节组织中分离到1株ARV,命名为ARV-HLJ21-1690401,该分离株位于基因Ⅲ型分支,与基因Ⅲ型参考株ISR5233和42563-4-2005遗传距离较近,氨基酸序列相似性为83.4%和81.7%,而与其他基因型分离株遗传距离较远;该分离株在LMH细胞上增殖良好,对鸡胚和SPF鸡均具有明显的致病性,可引起接种鸡胚90%死亡,接种6周龄SPF鸡可引起100%发病;该分离株具有良好的免疫原性,其制备的灭活疫苗免疫SPF鸡可诱导产生较好的抗体水平。综上所述,研究成功分离到一株具有致病性和良好免疫原性的基因Ⅲ型ARV变异株,为了解我国ARV变异株的流行及遗传进化特征提供了重要理论依据。

关键词：禽呼肠孤病毒基因Ⅲ型变异株致病性灭活疫苗

鸡chNHE1精准基因编辑细胞系的构建及其抗ALV-J感染的研究

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畜牧兽医学报 2024年

作者：张学富陈运通范文瑞张子博于蒙蒙王素艳祁小乐李留安高玉龙天津农学院动物科学与动物医学学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室禽免疫抑制病创新团队

为构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系，本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统，在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变、W38进行缺失，同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞... 详细信息

为构建ALV-J受体分子chNHE1精准基因编辑细胞系，本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统，在DF-1细胞中将chNHE1介导ALV-J进入宿主细胞的关键氨基酸V33进行突变、W38进行缺失，同时将编码第34-37位氨基酸的密码子同义替换。通过流式细胞分选获得48株单克隆细胞系，PCR及测序分析结果显示，其中有14株单克隆细胞系的chNHE1成功发生V33突变、W38缺失以及34-37位氨基酸的密码子同义替换，基因编辑效率为29%。为了验证chNHE1基因编辑DF-1细胞系的遗传稳定性及增殖水平，对传至第25代的细胞系进行测序分析，结果显示，chNHE1基因未发生回复性突变；进一步细胞计数分析结果显示，chNHE1基因编辑细胞系增殖水平未受到影响；为了评价chNHE1基因编辑细胞系抗ALV-J感染的能力，分别利用ALV-J荧光报告病毒（ALV-J-GFP）及ALV-J原型毒株（HPRS-103）对其进行病毒感染试验，荧光观察结果及流式细胞分析结果显示，chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI ALV-J-GFP的感染；进一步间接免疫荧光试验、PCR扩增试验以及病毒滴度测定试验结果显示，chNHE1基因编辑细胞系可完全抵抗0.1 MOI HPRS-103毒株及0.1 MOI JL08CH3-1毒株的感染。本研究利用荧光标记的CRISPR/Cas9系统结合流式细胞分选，成功构建了chNHE1基因编辑细胞系，其可完全抵抗ALV-J的感染，且该细胞系遗传稳定性及增殖活性良好，为建立抗ALV-J感染的新技术提供了理论支持及基因编辑靶点。

关键词： DF-1 chNHE1 ALV-J 基因编辑

非洲猪瘟病毒pE120R蛋白单克隆抗体的制备

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 388-394页

作者：刘传霞王晓李雪雯鲍苗菲李婷婷陈欣翁长江郑君中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、动物疫病预防控制国家重点实验室国家非洲猪瘟专业实验室基础免疫创新团队哈尔滨150069

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)衣壳蛋白pE120R,并制备单克隆抗体,为其功能研究提供材料。以pCAGGS-Flag-pE120R为模板扩增pE120R基因片段,构建原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达为可溶性pE... 详细信息

本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)衣壳蛋白pE120R,并制备单克隆抗体,为其功能研究提供材料。以pCAGGS-Flag-pE120R为模板扩增pE120R基因片段,构建原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达为可溶性pE120R蛋白,采用GST Beads纯化pE120R蛋白,免疫BALB/c小鼠,然后取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,采用间接ELISA方法筛选获得了1株能够稳定分泌pE120R单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果表明,成功构建了原核表达质粒pGEX-6p1-pE120R,并获得较高纯度的pE120R蛋白。Western blot和间接免疫荧光(IFA)试验结果显示,pE120R单抗能特异性识别HEK293T细胞转染质粒表达的Flag-pE120R蛋白和肺泡巨噬细胞(PAMs)感染ASFV后表达的pE120R蛋白。该单抗的结合位点在30~60aa区域,并且该单抗亚类鉴定重链为IgG2a。本研究成功表达并纯化了可溶性的pE120R蛋白;制备了抗pE120R的单抗隆抗体,该抗体具有良好的特异性,为深入探讨ASFV pE120R蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 pE120R蛋白原核表达单抗隆抗体

基于16S rDNA分析饲喂唾液乳杆菌XP132对白羽肉种鸡肠道菌群的影响

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畜牧兽医学报 2024年第9期 4091-4099页

作者：何塔娜胡馨匀米洁兰高立张艳萍祁小乐崔红玉杨桂连高玉龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室吉林农业大学动物医学院

旨在评估1株替抗专利菌株唾液乳杆菌XP132对健康白羽肉种鸡肠道菌群的影响。选取12只6月龄白羽肉种鸡，随机平均分为试验组和对照组，每组6只。试验组白羽肉种鸡每日饲喂活菌数为1×10～9 CFU的唾液乳杆菌XP132发酵液，对照组饲喂PBS,... 详细信息

旨在评估1株替抗专利菌株唾液乳杆菌XP132对健康白羽肉种鸡肠道菌群的影响。选取12只6月龄白羽肉种鸡，随机平均分为试验组和对照组，每组6只。试验组白羽肉种鸡每日饲喂活菌数为1×10～9 CFU的唾液乳杆菌XP132发酵液，对照组饲喂PBS,连续饲喂4周后，基于16S rDNA测序方法，比较两组鸡肠道菌群发生的相对改变。结果表明，在饲喂唾液乳杆菌XP132后，通过α多样性分析物种丰富度，试验组菌群丰富程度高于对照组。在菌群组成的属水平上，饲喂唾液乳杆菌XP132的肉种鸡肠道菌群中，螺旋体科NK4A136属、梭状芽胞杆菌属、副拟杆菌属、罗氏菌属等有益物种丰度增加；在种水平上，饲喂唾液乳杆菌XP132组的肉种鸡肠道菌群中乳杆菌、拟杆菌、鼠李糖乳杆菌类等有益物种丰度增加。结果提示，本试验条件下，饲喂唾液乳杆菌XP132改变了白羽肉种鸡肠道菌群的丰富度，增加了有益菌菌群的物种丰度。

关键词：肠道菌群唾液乳杆菌 16S rDNA 白羽肉种鸡

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B亚型禽偏肺病毒减毒株对商品肉鸡免疫效果的评价

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畜牧兽医学报 2024年

作者：许壮壮王素艳陈运通张涛于蒙蒙孟令宅范文瑞祁小乐高玉龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室禽免疫抑制病创新团队黑龙江八一农垦大学动物科技学院

为研究B亚型禽偏肺病毒减毒株（LN16-A株）对商品肉鸡的免疫效果。本研究从规模化养殖场选取3周龄的商品肉鸡，将B亚型禽偏肺病毒减毒株（LN16-A株）通过滴鼻方式免疫(200 μL，病毒含量≥103TCID50·只-1)，空白对照组以同样剂量的PBS... 详细信息

为研究B亚型禽偏肺病毒减毒株（LN16-A株）对商品肉鸡的免疫效果。本研究从规模化养殖场选取3周龄的商品肉鸡，将B亚型禽偏肺病毒减毒株（LN16-A株）通过滴鼻方式免疫(200 μL，病毒含量≥103TCID50·只-1)，空白对照组以同样剂量的PBS滴鼻。免疫21 d后，翅下采集血液分离血清，利用ELISA方法及中和试验检测相应抗体；在6周龄时，通过滴鼻方式使用B亚型禽偏肺病毒强毒（LN16-V株）(200 μL，5 000 TCID50·只-1)进行攻毒，攻毒后连续观察7 d，并利用RT-qPCR检测各组鸡鼻腔拭子的病毒拷贝数，攻毒后第9天各组随机选取2只鸡进行剖杀，采集鼻甲骨、气管和肺组织，通过HE染色制作病理切片，观察组织病理学变化。抗体检测结果显示，在疫苗免疫后21 d，免疫组ELISA抗体和中和抗体阳性率均为100%，平均ELISA抗体效价为1 860，平均中和抗体效价为7.44 log 2；临床症状观察结果显示，对照组商品肉鸡出现混浊、黏稠、牵丝状的鼻液等明显临床症状，发病率为100%，而免疫组肉鸡无临床症状；RT-qPCR结果表明，免疫组鸡鼻腔拭子病毒基因组拷贝数相较于对照组降低了78%～96%；病理切片结果显示，对照组肉鸡鼻甲骨、气管以及肺脏均出现不同程度的病理损伤，免疫组肉鸡各组织器官未见明显病理变化。上述结果表明，B亚型禽偏肺病毒减毒株（LN16-A株）可以诱导商品肉鸡产生特异性抗体，能显著降低攻毒后的排毒水平，对商品肉鸡具有良好的保护效果。本研究结果将为肉鸡养殖场禽偏肺病毒病的防控提供重要理论指导和技术支撑。

关键词： B亚型禽偏肺病毒减毒株商品肉鸡免疫效果

基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 300-310页

作者：白昀谢青云欧阳伟甘源袁厅赵东明步志高邵国青冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建... 详细信息

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。

关键词：非洲猪瘟 sIgA抗体 ELISA 早期诊断

禽白血病病毒J亚群感染鸡组织中细胞受体chNHE 1的表达分析

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畜牧兽医学报 2024年第8期55卷 3631-3639页

作者：张莉于蒙蒙王颖王素艳许壮壮刘鹏陈运通祁小乐李留安高玉龙天津农学院动物科学与动物医学学院、天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300392 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、动物疫病防控全国重点实验室禽免疫抑制病创新团队哈尔滨150069

旨在研究鸡钠氢交换蛋白1(chicken sodium hydrogen exchanger isoform 1,chNHE1)在不同类型鸡组织内的表达情况,J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)的组织嗜性及ALV-J感染后组织chNHE1的mRNA变化情况。本研究利用qPCR技术,检测了商品肉鸡、商品蛋鸡和SPF鸡脏器内的chNHE1转录量,ALV-J感染鸡后各组织的病毒载量及组织chNHE1的转录量的变化。结果显示,chNHE1在3种类型鸡的心、肝、脾、肺、肾、盲肠扁桃体、胸腺和法氏囊中均能检测到,但转录量高低存在较大差异,其中,免疫器官内的chNHE1转录量相对较高;SPF鸡接种ALV-J后,心、脾、肾和盲肠扁桃体中的病毒载量相对较高,而肝、肺、胸腺和法氏囊中的病毒载量相对较低;ALV-J感染后,脾、肾和盲肠扁桃体中的chNHE1转录量明显上调,但心中的转录量与空白对照相比无明显变化。本研究分析了3种类型鸡chNHE1的组织转录特点及ALV-J感染对组织内chNHE1转录的影响,该研究结果为探究受体chNHE1的转录与ALV-J的组织嗜性的关系提供重要的理论依据。

关键词： J亚群禽白血病病毒鸡钠氢交换蛋白1 组织表达转录量变化

表达基因Ⅰ亚型禽呼肠孤病毒σB和σC的重组4型禽腺病毒的拯救及鉴定

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中国兽医科学 2024年第9期54卷 1175-1181页

作者：许壮壮郭茹王素艳高立陈运通张涛高宁玉吴龙波祁小乐张艳萍崔红玉刘永振段雨路王牟平高玉龙黑龙江八一农垦大学动物科技学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室禽免疫抑制病创新团队

为获得1株能够融合表达基因Ⅰ亚型禽呼肠孤病毒（avian reovirus Ⅰ-sub,ARV GCⅠ-sub）σB和σC的重组4型禽腺病毒（fowl adenovirus 4,FAdV-4）株，以禽腺病毒rHN20为病毒载体，构建表达σB和σC蛋白的重组黏粒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-... 详细信息

为获得1株能够融合表达基因Ⅰ亚型禽呼肠孤病毒（avian reovirus Ⅰ-sub,ARV GCⅠ-sub）σB和σC的重组4型禽腺病毒（fowl adenovirus 4,FAdV-4）株，以禽腺病毒rHN20为病毒载体，构建表达σB和σC蛋白的重组黏粒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub，使用新型Fosmid黏粒拯救系统进行病毒拯救。通过PCR、间接免疫荧光试验（ⅠFA）、Western-blot以及体外复制动力学曲线鉴定重组毒株。结果显示，在感染的LMH细胞中成功检测到ARVGCⅠ-sub的σB和σC基因；Western-blot结果显示，在感染重组病毒的LMH细胞中成功检测到FAdV-4的Fiber蛋白、ARVGCⅠ-subσB和σC蛋白；ⅠFA结果显示，能特异性检测到FAdV-4的Fiber蛋白、ARVGCⅠ-subσB和σC蛋白；重组毒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub与亲本毒rHN20的复制能力无明显差异；表明重组病毒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub拯救成功。重组病毒rHN20-r1966-ARV GCⅠ-sub的成功构建为同时靶向ARVσB和σC蛋白的ARV防控疫苗的研制提供了技术支撑，为ARV与FAdV-4的防控奠定了基础。

关键词：基因Ⅰ亚型禽呼肠孤病毒 4型禽腺病毒 σB σC 重组病毒

靶向伪狂犬病病毒UL35基因的SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立

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中国兽医学报 2024年

作者：张心雨吴红霞李永锋孙元付强仇华吉佛山科学技术学院生命科学与工程学院中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

为了确定UL35基因能否作为诊断伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）感染的靶标，本研究根据PRV不同毒株UL35基因保守序列，设计合成特异性荧光定量PCR引物，扩增长度为54 bp的片段。通过优化反应条件和反应体系，结果显示，建立的P... 详细信息

为了确定UL35基因能否作为诊断伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）感染的靶标，本研究根据PRV不同毒株UL35基因保守序列，设计合成特异性荧光定量PCR引物，扩增长度为54 bp的片段。通过优化反应条件和反应体系，结果显示，建立的PRV SYBR Green I荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性和特异性，其标准曲线与模板浓度呈现良好的线性关系；对猪繁殖和呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）核酸扩增均呈阴性；将所建立的方法与同类方法进行比较，敏感性无差异；组间和组内重复性试验的变异系数小于2%。用本研究所建立的方法对PRV感染小鼠的组织样品进行检测，均检测到一定的病毒载量。结果表明，UL35基因可以作为诊断PRV感染的靶标。

关键词：伪狂犬病病毒 UL35基因 SYBR Green I 定量PCR