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一组绵羊OLA Ⅰ蛋白与绵羊痘病毒多肽的复性组装

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生物工程学报 2022年第1期38卷 139-147页

作者：王战红赵志荀吴国华邓阳朱国强赵芳燕卢曾军张强中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

本研究旨在体外组装小尾寒羊OLA Ⅰ蛋白与绵羊痘病毒多肽复合物,筛选绵羊痘病毒CTL表位肽。首先克隆小尾寒羊OLA Ⅰ重链基因胞外区OLA Ⅰα-BSP和轻链基因OLA Ⅰ-β2m,将获得的轻、重链基因分别插入原核表达载体pET-28a(+)并转化至BL21(... 详细信息

本研究旨在体外组装小尾寒羊OLA Ⅰ蛋白与绵羊痘病毒多肽复合物,筛选绵羊痘病毒CTL表位肽。首先克隆小尾寒羊OLA Ⅰ重链基因胞外区OLA Ⅰα-BSP和轻链基因OLA Ⅰ-β2m,将获得的轻、重链基因分别插入原核表达载体pET-28a(+)并转化至BL21(DE3)细胞进行诱导表达,收集菌体超声破碎,过镍柱纯化获得一定纯度的OLA Ⅰ重链和轻链β2m包涵体蛋白,稀释复性法将获得的轻、重链包涵体蛋白与绵羊痘病毒多肽PV4按摩尔比为1︰1︰1的比例进行共复性,分子筛层析验证复性情况,ELISPOT试验评价OLA Ⅰ分子限制性多肽引起的T细胞免疫应答。结果表明,克隆获得的重、轻链基因正确表达,大小分别为36.3 kDa和16.7 kDa,分子筛和SDS-PAGE结果表明,绵羊痘病毒多肽PV4与OLA Ⅰ分子稳定结合,ELISPOT试验确定该多肽可刺激引起T细胞免疫应答。本研究建立了小尾寒羊OLA Ⅰ分子轻、重链的原核表达体系,实现该轻、重链与绵羊痘病毒多肽PV4的复性,确定了1个绵羊痘病毒CTL表位肽,为下一步解析该复合物的结构及对羊痘CTL表位筛选提供思路。

关键词： OLAⅠ 绵羊痘病毒分子筛 CTL表位

七种蛋白酶抑制剂对多房棘球蚴DNA损伤诱导样1蛋白活性的影响

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畜牧兽医学报 2024年

作者：张生英刘仲藜郭爱疆王帅中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室

目前多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis， AE)尚无有效药物治疗手段，迫切需要开发新型治疗药物。前期研究表明，HIV蛋白酶抑制剂(HIV protease inhibitors，HIV PIs)具有潜在抗寄生虫功能。本文旨在研究HIV PIs对Echinococcus mult... 详细信息

目前多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis， AE)尚无有效药物治疗手段，迫切需要开发新型治疗药物。前期研究表明，HIV蛋白酶抑制剂(HIV protease inhibitors，HIV PIs)具有潜在抗寄生虫功能。本文旨在研究HIV PIs对Echinococcus multilocularis (Emu)DNA损伤诱导样1蛋白(DNA damage inducible 1 protein，Ddi1)活性的影响。本研究通过构建真核表达重组载体pFastBac1-Emu Ddi1，在昆虫细胞系Sf9细胞中表达筛选出P1代和P2代，纯化出可溶性Ddi1重组蛋白，然后与目的蛋白的荧光底物反应，检测纯化蛋白的活性，进一步检测沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、安普那韦(amprenavir，APV)、阿扎那韦(atazanavir，ATV)、洛匹那韦(lopinavir，LPV)、福沙那韦(fosamprenavir，Fos)、达芦那韦(darunavir，DRV)等7种HIV PIs对Emu Ddi1重组蛋白活性的抑制能力。结果显示：细胞系内真核表达产物的酶活Km为1.422 μmol·L-1，具有良好的亲和力和活性，最终筛到沙奎那韦对Ddi1蛋白二聚体活性位点的抑制率达67%，其IC50为34，说明沙奎那韦对Emu Ddi1重组蛋白酶活性具有良好的抑制效果。以上结果提示：沙奎那韦抑制重组蛋白Ddi1的活性，可能成为Ddi1的靶向药物，以期为替代药物或开发联合用药提供基础。

关键词：蛋白酶抑制剂多房棘球蚴 DNA损伤诱导样蛋白酶活性抑制率

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结核分枝杆菌免疫逃逸机制研究进展

科学通报 2024年第4期69卷 531-541页

作者：李娜宋银娟储岳峰兰州大学动物医学与生物安全学院中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州730000

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的一种对全球人类健康和经济社会发展具有重大影响的人兽共患病.结核分枝杆菌感染人类已有数千年的历史,在其与人类宿主共同进化的过程中,Mtb已发展... 详细信息

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的一种对全球人类健康和经济社会发展具有重大影响的人兽共患病.结核分枝杆菌感染人类已有数千年的历史,在其与人类宿主共同进化的过程中,Mtb已发展出多种巧妙的策略以逃避宿主的免疫防御,从而建立持续性感染.然而,我们对其免疫逃逸的分子机制以及细菌的毒力因子在Mtb不同感染阶段下发挥的作用了解有限.研究表明,在Mtb感染的早期阶段,肺泡巨噬细胞无法控制Mtb的感染,在进入肺间质后,Mtb可通过调控细胞内感染、损害抗原提呈、破坏巨噬细胞和T细胞功能等手段达到免疫逃逸的目的.本文详细回顾并综述了近年来结核分枝杆菌调控巨噬细胞自噬、凋亡以及适应性免疫应答等过程的分子机制,这些分子机制对于开发新的宿主导向疗法以及保护性疫苗至关重要.

关键词：结核分枝杆菌巨噬细胞免疫逃逸宿主导向疗法

表达O型口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒构建及其免疫原性分析

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生物工程学报 2022年第5期38卷 1824-1836页

作者：王灿灿张莉萍刘新生周鹏潘丽王永录中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室OIE/国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

为构建表达O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,本研究设计、合成特异性引物并扩增出FMDV-OZK93的P12A、3B3C基因,通过融合PCR方法连接2个片段,获得P12A3B3C基... 详细信息

为构建表达O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,本研究设计、合成特异性引物并扩增出FMDV-OZK93的P12A、3B3C基因,通过融合PCR方法连接2个片段,获得P12A3B3C基因后插入到pDC316-mCMV-EGFP质粒,构建了能够表达FMDV-OZK93株衣壳蛋白前体P12A和3B3C蛋白酶的重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-P12A3B3C。利用AdMax^(TM)腺病毒包装系统进行重组腺病毒rAdv-P12A3B3C-OZK93的包装、鉴定及扩增;并感染人胚胎肾细胞HEK-293进行表达验证。将鉴定正确且高度纯化后的重组腺病毒肌肉免疫小鼠进行免疫原性分析。结果显示,rAdvP12A3B3C-OZK93在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达1×10^(9.1)TCID_(50)/mL。间接免疫荧光和Western blotting结果均表明rAdv-P12A3B3C-OZK93在HEK-293细胞中表达了FMDV特异性蛋白P12A和VP1。PK细胞感染实验证明rAdv-P12A3B3C-OZK93可感染猪源细胞,这为构建的rAdv-P12A3B3C-OZK93用于猪对抗FMDV的免疫与保护奠定了基础。相比于FMDV灭活疫苗免疫的小鼠,重组腺病毒免疫小鼠后可诱导机体产生更高水平的FMDV特异性抗体以及γ-IFN和IL-10应答反应,表明该重组腺病毒可对动物机体产生良好的免疫原性,为后续研制新型口蹄疫活载体疫苗奠定了重要基础。

关键词： O型口蹄疫病毒重组腺病毒 P12A和3B3C 免疫原性

七种蛋白酶抑制剂对多房棘球蚴DNA损伤诱导样1蛋白活性的影响

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畜牧兽医学报 2024年第5期55卷 2273-2280页

作者：张生英刘仲藜郭爱疆王帅中国农业科学院兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046

目前,多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)尚无有效药物治疗手段,迫切需要开发新型治疗药物。前期研究表明,HIV蛋白酶抑制剂(HIV protease inhibitors, HIV PIs)具有潜在抗寄生虫功能。本文旨在研究HIV PIs对Echinococcus multil... 详细信息

目前,多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)尚无有效药物治疗手段,迫切需要开发新型治疗药物。前期研究表明,HIV蛋白酶抑制剂(HIV protease inhibitors, HIV PIs)具有潜在抗寄生虫功能。本文旨在研究HIV PIs对Echinococcus multilocularis(Emu)DNA损伤诱导样1蛋白(DNA damage inducible 1 protein, Ddi1)活性的影响。本研究通过构建真核表达重组载体pFastBac1-Emu Ddi1,在昆虫细胞系Sf9细胞中表达筛选出P1代和P2代,纯化出可溶性Ddi1重组蛋白,然后与目的蛋白的荧光底物检测纯化蛋白的活性,进一步检测沙奎那韦(saquinavir, SQV)、利托那韦(ritonavir, RTV)、安普那韦(amprenavir, APV)、阿扎那韦(atazanavir, ATV)、洛匹那韦(lopinavir, LPV)、福沙那韦(fosamprenavir, Fos)、达芦那韦(darunavir, DRV)等7种HIV PIs对Emu Ddi1重组蛋白活性的抑制能力。结果显示:细胞系内真核表达产物的酶活Km为1.422μmol·L^(-1),具有良好的亲和力和活性,最终筛到沙奎那韦对Ddi1蛋白二聚体活性位点的抑制率达67%,其IC_(50)为34,说明沙奎那韦对Emu Ddi1重组蛋白酶活性具有良好的抑制效果。以上结果提示:沙奎那韦抑制重组蛋白Ddi1的活性,可能成为Ddi1的靶向药物,以期为替代药物或开发联合用药提供基础。

关键词：蛋白酶抑制剂多房棘球蚴 DNA损伤诱导样蛋白酶活性抑制率

新型鹅星状病毒ORF2蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

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中国农业科学 2023年第24期56卷 4956-4966页

作者：王丹吉艳红梁世蕊杨洁朱启运中国农业科学院兰州兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

【目的】由新型鹅星状病毒(novel goose astrovirus, nGAstV)引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体(nanobody, Nb)噬菌体展示文库，获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb，可为建立nGAstV抗体检测方... 详细信息

【目的】由新型鹅星状病毒(novel goose astrovirus, nGAstV)引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体(nanobody, Nb)噬菌体展示文库，获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb，可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原，免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫，第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次，每次免疫剂量均为50μg。第5次免疫14 d后，通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时，分离羊驼外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte, PBL)，然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA，利用巢氏PCR方法扩增重链抗体重链可变区(variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies, VHH)基因，将其构建至pComb噬菌体载体并结合噬菌体展示技术构建nGAstV Nb噬菌体展示文库，计算该文库库容量并分析其多样性。nGAstV作为靶抗原，通过三轮富集淘选初步获得与nGAstV反应的重组噬菌体Nb阳性克隆，将其克隆至pcDNA3.1-Fc真核表达载体并进行测序分析，将测序成功且序列不同的质粒转染至HEK-293F细胞中表达，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达情况。以nGAstV为靶标抗原，利用间接ELISA方法和Western blot试验对表达成功的Nb进行特异性、反应活性验证，并以nGAstV ORF2蛋白为靶标抗原，利用间接ELISA方法对Nb进行亲和力验证，获得生物学活性较好的Nb。【结果】RT-PCR结果显示，nGAstV增殖成功；Reed-Muench法分析nGAstV滴度达4.38 Log10TCID50/mL。羊驼经5次免疫nGAstV后，通过间接ELISA方法测得其血清中针对nGAstV的抗体效价达到1:64 000；利用巢氏PCR方法扩增出VHH并成功构建库容量为3.8×108CFU/mL的nGAstV Nb噬菌体展示文库；遗传进化树分析显示，该噬菌体Nb库多样性良好。三轮富集淘选后，初步获得39株与nGAstV反应的重组噬菌体纳米抗体阳性克隆，其中有25株序列不同；SDS-PAGE鉴定结果显示，共有10株Nb在HEK-293F细胞中表达成功。通过ELISA、Western blot验证进一步获得8株与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，且1株Nb生物学活性最好。【结论】首次筛选到与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，为nGAstV的基础研究和检测方法提供材料。

关键词：新型鹅星状病毒 ORF2蛋白纳米抗体噬菌体展示技术

双组分调控系统介导革兰阴性菌耐药的作用机制

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畜牧兽医学报 2022年第6期53卷 1689-1701页

作者：于永峰权衡董文豪邹荣华吴晓妮宫晓炜陈启伟中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046

菌群耐药已成为临床上亟待解决的关键问题,特别是革兰阴性菌引起的耐药现象尤为突出,给临床治疗带来了巨大的挑战,尽快阐明重要细菌复杂耐药表型的调控机制就显得尤为重要。双组分调控系统(two-component regulatory systems,TCS)存在... 详细信息

菌群耐药已成为临床上亟待解决的关键问题,特别是革兰阴性菌引起的耐药现象尤为突出,给临床治疗带来了巨大的挑战,尽快阐明重要细菌复杂耐药表型的调控机制就显得尤为重要。双组分调控系统(two-component regulatory systems,TCS)存在于多种革兰阴性菌中,在细菌诸多生命活动中发挥关键作用,是细菌感知环境变化并产生相应调控的主要机制之一。TCS通常由两种蛋白组成,包括感受器蛋白(通常是组氨酸激酶)和反应调节蛋白(通常是转录因子),二者可通过磷酸化介导的协同作用,整合细菌周围的环境信号、调节细菌相关的基因表达及改变细菌的某些生理行为。近年来,探索细菌TCS介导的耐药性应答机制已成为一个新的研究热点。基于此,本文从TCS介导临床重要革兰阴性菌耐药的结构基础和作用机理等方面进行综述,以期增进对细菌TCS的全面认识,为今后临床上药物的科学研发提供新的思路和对策。

关键词：双组分调控系统(TCS) 刺激信号细菌耐药转录调控

Enolase在鸭疫里默氏杆菌侵袭鸭脑微血管内皮细胞中的作用

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畜牧兽医学报 2022年第12期53卷 4389-4397页

作者：邹荣华吴晓妮陈启伟宫晓炜王燕萍郑福英储岳峰中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046

旨在明确鸭疫里默氏杆菌烯醇化酶(Enolase)在其侵袭鸭脑微血管内皮细胞(DBMEC)以及血脑屏障(BBB)中的作用。本研究以鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株为亲本株,利用同源重组和结合转移的方法构建enolase基因缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase,... 详细信息

旨在明确鸭疫里默氏杆菌烯醇化酶(Enolase)在其侵袭鸭脑微血管内皮细胞(DBMEC)以及血脑屏障(BBB)中的作用。本研究以鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株为亲本株,利用同源重组和结合转移的方法构建enolase基因缺失株ΔEnolase和回复株cΔEnolase,并测定RA-LZ01、ΔEnolase和cΔEnolase对DBMEC黏附和侵袭能力的差异;用上述菌株感染雏鸭,测定雏鸭血液和脑组织中的载菌量。结果表明,与亲本株RA-LZ01相比,缺失株ΔEnolase对DBMEC的黏附率和入侵率均极显著降低;回复株cΔEnolase恢复了对DBMEC的黏附和入侵能力。感染RA-LZ01、ΔEnolase和cΔEnolase菌株的雏鸭的血液载菌量无显著差异;与感染RA-LZ01和cΔEnolase菌株的雏鸭相比,感染ΔEnolase菌株的雏鸭脑组织中的载菌量极显著降低。以上结果说明,Enolase与鸭疫里默氏杆菌黏附和入侵DBMEC以及入侵雏鸭脑组织显著相关,可能为介导鸭疫里默氏杆菌突破鸭血脑屏障的毒力因子。

关键词：鸭疫里默氏杆菌 Enolase 鸭脑微血管内皮细胞血脑屏障

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犬冠状病毒诊断技术研究进展

中国兽医科学 2023年第1期53卷 101-106页

作者：张成琪石正旺万颖罗俊聪田宏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业农村部兽医公共卫生重点实验室甘肃兰州1730046 中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室吉林长春130112

犬冠状病毒(canine coronavirus,CCoV)属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)、α冠状病毒属成员。近几年,冠状病毒感染犬的比例正在不断上升,加上有研究表明犬也会感染新型冠状病毒,而市... 详细信息

犬冠状病毒(canine coronavirus,CCoV)属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)、α冠状病毒属成员。近几年,冠状病毒感染犬的比例正在不断上升,加上有研究表明犬也会感染新型冠状病毒,而市场上缺少治疗冠状病毒的特效药物。因此,快速、精确的诊断宠物疫病对该病的防控起到不可或缺的作用。目前,犬冠状病毒常用的检测技术分为临床诊断、病原学检查和血清学检查,但由于冠状病毒病的流行病学特点、临床症状以及病理剖检缺乏特征性变化,据此只能作出初步诊断,病原学检查主要分为病毒分离培养、电镜诊断、PCR、RPA、夹心ELISA和RT-RAA;血清学检查主要分为中和试验、间接ELISA、胶体金免疫层析试纸条。2019年新型冠状病毒感染导致的疫情在全球爆发以来,备受社会各界关注,一些新的变异毒株也在不断出现。因此,亟需一种快速、简便、成本低、灵敏性高、特异性强的诊断方法来监测、预警疫情,为进一步研发特异性疫苗提供参考与帮助。

关键词：检测冠状病毒犬