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猫源核糖体蛋白RPS3生物信息学及功能分析

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中国动物传染病学报 2024年

作者：王笑汤傲星张淼张达朱世强孟春春李传峰朱杰刘光清中国农业科学院上海兽医研究所

核糖体蛋白是细胞中参与蛋白质合成及调控基因表达的一种重要蛋白，不同物种间核糖体存在异质性。因此，为了进一步展开核糖体蛋白基因的结构和功能研究，本研究克隆了猫源40S核糖体蛋白S3基因(RPS3)并构建了真核表达质粒，并借助于生... 详细信息

核糖体蛋白是细胞中参与蛋白质合成及调控基因表达的一种重要蛋白，不同物种间核糖体存在异质性。因此，为了进一步展开核糖体蛋白基因的结构和功能研究，本研究克隆了猫源40S核糖体蛋白S3基因(RPS3)并构建了真核表达质粒，并借助于生物信息学方法初步分析了该蛋白的结构特征。结果显示，该基因cDNA全长为732 bp，编码244个氨基酸；编码蛋白分子量为26 kDa，是一种亲水性的、没有跨膜结构域和信号肽、含有多个糖基化和磷酸化位点的核糖体蛋白；系统发育树构建的结果表明，该基因与小鼠的RPS3基因具有较近的亲缘关系。此外，利用OPP方法确定了瞬时过表达RPS3会抑制细胞内新生蛋白的生成，且抑制猫杯状病毒（FCV）增殖。因此，本研究结果可为猫及其它物种的核糖体蛋白基因的结构和功能研究提供分子基础参考。

关键词：核糖体蛋白猫杯状病毒 RPS3

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鸭甲型肝炎病毒反向遗传操作系统的构建

中国动物传染病学报 2024年

作者：硕盾李鲁兆滕巧泱苑纯秀闫大为张志飞潘学许榜丰刘芹防李泽君中国农业科学院上海兽医研究所

鸭病毒性肝炎（DVH）的高发病率和对雏鸭的高致死率已成为制约我国养鸭业发展的一大难题，目前危害最为严重的DVH主要由鸭甲型肝炎病毒（DHAV）引起，DHAV主要有两种基因型，分别为 DHAV-1和DHAV-3，主要攻击4周龄以内雏鸭，引起急性肝... 详细信息

鸭病毒性肝炎（DVH）的高发病率和对雏鸭的高致死率已成为制约我国养鸭业发展的一大难题，目前危害最为严重的DVH主要由鸭甲型肝炎病毒（DHAV）引起，DHAV主要有两种基因型，分别为 DHAV-1和DHAV-3，主要攻击4周龄以内雏鸭，引起急性肝炎和雏鸭死亡。目前主要通过鸡胚连续传代致弱来研制弱毒疫苗，耗时较长。因此，急需一种快速改造DHAV的技术来提高疫苗研究速度。本研究利用RT-PCR方法扩增DHAV-1强毒株（SH8）和DHAV-3强毒株（SH52）的全基因组，将全基因插入pUC19载体构建了重组质粒，以重组质粒为模板、利用融合PCR方法扩增DHAV全基因组，转录为RNA后转染至鸭胚肾（DEK）细胞，最终成功获得两株拯救毒株。将两株拯救毒株在9日龄麻鸭胚连续盲传5代收获病毒，分别命名为r-SH8和r-SH52。将SH8、r-SH8、SH52和r-SH52分别接种9日龄麻鸭胚，发现拯救毒株与野毒株相比，在9日龄麻鸭胚中引起的胚体病变情况相同，病毒滴度相近。本研究成功构建 DHAV-1和DHAV-3反向遗传操作系统，为快速定向突变致弱DHAV奠定了基础。

关键词：鸭甲型肝炎病毒反向遗传病毒拯救

禽呼肠孤病毒特异性单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

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中国家禽 2024年

作者：赵璐黄聪黄远玲韩靖宜李鸿昌陈鸿军陈宗艳中国农业科学院上海兽医研究所

为建立检测禽呼肠孤病毒（ARV）血清抗体阻断ELISA方法，试验采用浓缩的ARV-AH20株病毒粒子免疫5周龄BALB/c小鼠，利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞，并通过间接ELISA和免疫荧光试验（IFA）进行阳性杂交瘤细胞亚克隆筛选，获得两株稳定... 详细信息

为建立检测禽呼肠孤病毒（ARV）血清抗体阻断ELISA方法，试验采用浓缩的ARV-AH20株病毒粒子免疫5周龄BALB/c小鼠，利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞，并通过间接ELISA和免疫荧光试验（IFA）进行阳性杂交瘤细胞亚克隆筛选，获得两株稳定分泌针对σC蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株H9B2D77、B4E4B10。选择H9B2D77株作为检测抗体、重组σC蛋白作为包被抗原，经条件优化，建立了一种检测ARV抗体的阻断ELISA方法。结果显示：该方法与常见鸡源病原的抗体阳性血清均不存在交叉反应，批间和批内变异系数均小于6%；对48份鸡血清样品的检测，该方法与IFA具有100%的总体符合率。综上所述，基于禽呼肠孤病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法特异性高，重复性好，可用于ARV抗体检测。

关键词：禽呼肠孤病毒 σC蛋白单克隆抗体阻断ELISA

宠物抗真菌药伊曲康唑溶液与分散片药代动力学研究

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中国动物传染病学报 2024年

作者：薛华磊陶贻炯黄琳杰李晓陈凯张可煜王米中国农业科学院上海兽医研究所

本研究旨在建立伊曲康唑(itraconazole，ITZ)药代动力学研究方法，研究市售伊曲康唑制剂的药代动力学参数，为兽医临床用药及药物研发提供参考。选用2.6-4.2 kg的8只健康英国短毛猫公母各半，随机分为2组，分别给单剂量伊曲康唑内服溶... 详细信息

本研究旨在建立伊曲康唑(itraconazole，ITZ)药代动力学研究方法，研究市售伊曲康唑制剂的药代动力学参数，为兽医临床用药及药物研发提供参考。选用2.6-4.2 kg的8只健康英国短毛猫公母各半，随机分为2组，分别给单剂量伊曲康唑内服溶液和分散片5 mg/kg，10 mg/kg。运用DAS2.0非房室动力学模型分析算相关药动学参数，结果显示内服溶液主要药动学参数如下：t1/2(32.45±43.19)h，Tmax(2.75±1.58)h，Cmax(0.752±0.146)μg/mL，AUC0-t(15.01±5.26)μg·mL-1·h-1，AUC0-∞(21.94±19.00)μg·mL-1·h-1，MRT(49.59±56.91)h，Vz/F(329.13±157.74)L/kg，CLz/F(0.75±0.15)L/h/kg，Frel (218.39%)分散片主要药动学参数如下：t1/2(52.68±44.52)h，Tmax(3.13±1.13)h，Cmax(0.16±0.08)μg/mL，AUC0-t(3.07±1.32)μg·mL-1·h-1，AUC0-∞(5.02±3.69)μg·mL-1·h-1，MRT(67.13±66.00)，Vz/F(173.91±78.11)L/kg，CLz/F(3.22±2.69)L/h/kg，Frel(45.79%)，本研究得出结论，口服分散片的给药剂量10 mg/kg血药浓度远低于文献中提及的治疗真菌感染的剂有效浓度，建议在使用分散片治疗真菌感染时增加给药剂量。

关键词：伊曲康唑分散片内服溶液药代动力学

一株鸭源血清4型禽腺病毒主要结构蛋白的遗传演化分析及致病性研究

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中国家禽 2024年

作者：黄聪李嘉黄远玲韩靖宜魏常青刘静宜陈鸿军陈宗艳中国农业科学院上海兽医研究所

为确定2020年浙江地区某养殖场以肝脏白色点状坏死为特征的麻鸭发病原因，试验采集病鸭组织进行病原检测和分离鉴定，并对分离病原进行麻鸭致病性试验。结果显示：病原确定为血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4），命... 详细信息

为确定2020年浙江地区某养殖场以肝脏白色点状坏死为特征的麻鸭发病原因，试验采集病鸭组织进行病原检测和分离鉴定，并对分离病原进行麻鸭致病性试验。结果显示：病原确定为血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4），命名为QZ20株；QZ20分离株与我国近年流行的FAdV-4毒株处于同一分支，核苷酸序列相似性高达98%～100%;QZ20分离株感染鸡肝癌细胞（Chicken liver hepatocellular carcinoma cell line,LMH）能够产生细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE），能在LMH细胞中复制，病毒TCID50为105.5/0.1 mL;QZ20分离株接种鸡胚胚体潮红、全身弥漫性出血，并能致死鸡胚；QZ20分离株感染1日龄麻鸭可导致十二指肠、肝脏和肾脏均发生病理变化。研究表明，从患病麻鸭成功分离一株FAdV-4，其与我国鸡群中流行的FAdV-4差异较小，结果为FAdV-4的流行病学调查和防控提供依据。

关键词：麻鸭血清4型禽腺病毒致病性

HA蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感疫苗免疫原性影响

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中国动物传染病学报 2024年

作者：潘晟辉牛世奇王晨阳吕雪华张志飞许榜丰滕巧泱闫大为苑纯秀李泽君刘芹防中国农业科学院上海兽医研究所

为了评价HA蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白免疫原性的影响，本研究将HA蛋白裂解位点从PSRSSR↓GLF突变为TSNSS↓GLF，引入了两个N-糖基化位点，将其命名为HA-2N。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建出两株表达H9/HA的重组火... 详细信息

为了评价HA蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白免疫原性的影响，本研究将HA蛋白裂解位点从PSRSSR↓GLF突变为TSNSS↓GLF，引入了两个N-糖基化位点，将其命名为HA-2N。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建出两株表达H9/HA的重组火鸡疱疹病毒（rHVT-HA和rHVT-HA-2N），通过间接免疫荧光实验鉴定重组病毒中的外源蛋白H9/HA均可以正确表达，Western Blot结果显示经过裂解位点改造后的HA蛋白不发生裂解，说明缺失裂解位点后，HA蛋白不能正常裂解为HA1与HA2蛋白，保持了融合前状态。将重组病毒分别免疫SPF鸡，采集血清进行H9抗体效价的监测，结果显示，针对HA蛋白裂解位点改造过的重组病毒可以在宿主体内诱导免疫应答，但是抗体效价低于带有裂解位点的重组病毒，此结果说明了HA蛋白裂解位点突变明显降低了基于HVT载体的H9N2亚型禽流感疫苗免疫原性。本研究对H9N2亚型禽流感疫苗设计与免疫效力评估具有参考意义。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒 HA蛋白裂解位点火鸡疱疹病毒

基于CRISPR/Cas9技术的全基因组基因编辑MDCK细胞文库的构建

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中国动物传染病学报 2024年第4期32卷 17-24页

作者：朱媛媛许榜丰闫鸣昊刘芹防滕巧泱苑纯秀李雪松李泽君中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先靶向犬全基因组设计合成转录sgRNA的DNA文库,并将DNA文库全部克隆于lentiCRISPR v2慢病毒转移载体上,高通量测序结果显示文库覆盖度高、均一性良好。将质粒文库和慢病毒包装系统质粒共转染293T细... 详细信息

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先靶向犬全基因组设计合成转录sgRNA的DNA文库,并将DNA文库全部克隆于lentiCRISPR v2慢病毒转移载体上,高通量测序结果显示文库覆盖度高、均一性良好。将质粒文库和慢病毒包装系统质粒共转染293T细胞,收取含慢病毒样病毒的上清液感染MDCK细胞,在最适浓度嘌呤霉素筛选下,收集嘌呤霉素抗性细胞,冻存于-80℃,提取一部分细胞的基因组,通过PCR扩增转录sgRNA的DNA,将PCR产物插入到T载体后,挑取单克隆菌落,测序表明细胞文库中转录的sgRNA具有较好的覆盖度。本实验成功构建了犬全基因组范围转录sgRNA的质粒文库,并成功构建了MDCK细胞全基因组范围的基因编辑细胞库,该文库可作为后续筛选病毒复制关键宿主因子的细胞平台。

关键词： CRISPR/Cas9 MDCK细胞系全基因组基因编辑

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一种诱导表达绿色荧光蛋白穿梭质粒的构建及其在荧光示踪中的应用

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中国动物传染病学报 2024年第4期32卷 25-31页

作者：左东李子晨尹伊胡海王少辉祁晶晶田明星于圣青中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究... 详细信息

细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究构建了一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒pBT-iEGFP,该质粒可通过添加无水四环素诱导表达绿色荧光蛋白。诱导表达和传代稳定性试验表明,pBT-iEGFP质粒可在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中成功诱导表达绿色荧光蛋白,在五代盲传中该质粒能在细菌中稳定遗传。胞内布鲁菌诱导表达试验证实,pBT-iEGFP质粒可成功示踪细胞感染过程中活的布鲁菌。总之,本研究构建的pBT-iEGFP质粒可作为细菌的荧光示踪研究工具,应用于多种实验研究。

关键词：诱导表达质粒绿色荧光蛋白大肠杆菌沙门菌布鲁菌

非洲猪瘟病毒B318L蛋白的多抗制备及功能初探

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中国动物传染病学报 2024年

作者：周州曾凡亮胡松洋李智晟谢振华刘英楠陈鸿军中国农业科学院上海兽医研究所中国农业科学院生物安全研究中心

本研究以ASFV基因组为模板，经高保真酶PCR扩增后进行酶切连接，完成原核表达质粒pET-30a-B318L-C的构建。经测序验证后，将其转化至感受态BL21（DE3）细胞中，经IPTG诱导后成功表达出主要以包涵体形式存在且大小为18 kDa ASFV B318L截... 详细信息

本研究以ASFV基因组为模板，经高保真酶PCR扩增后进行酶切连接，完成原核表达质粒pET-30a-B318L-C的构建。经测序验证后，将其转化至感受态BL21（DE3）细胞中，经IPTG诱导后成功表达出主要以包涵体形式存在且大小为18 kDa ASFV B318L截短体蛋白。通过磁珠法纯化得到高纯度的目的蛋白，纯化后蛋白经过复性，随后对小鼠进行免疫并采集得到多克隆抗体血清。IFA和WB结果显示，小鼠血清中的多克隆抗体能正确识别ASFV感染的蛋白样品中B318L蛋白的表达，提示其反应原性和特异性良好。通过真核质粒转染，点击化学显示ASFV pB318L能够提高宿主蛋白RhoA的异戊二烯化修饰水平。本研究可为解析非洲猪瘟病毒蛋白的功能提供生物材料和理论依据。

关键词：非洲猪瘟病毒 B318L 原核表达多克隆抗体