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展示口蹄疫病毒优势中和表位的铁蛋白纳米颗粒制备及其在小鼠模型上的免疫原性评价

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农业生物技术学报 2024年第5期32卷 1216-1226页

作者：卢炳州茹毅郝荣增李亚军杨洋杨锐毛玉涵蒋成辉陶世宇郑海学余四九崔燕甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室

蛋白纳米颗粒能够在表面展现多拷贝抗原，模拟病毒的结构形态，更有利于免疫细胞摄取和促进抗原递呈，从而增强疫苗保护效力。本研究旨在利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统制备展示口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV... 详细信息

蛋白纳米颗粒能够在表面展现多拷贝抗原，模拟病毒的结构形态，更有利于免疫细胞摄取和促进抗原递呈，从而增强疫苗保护效力。本研究旨在利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统制备展示口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)优势中和表位的铁蛋白纳米颗粒，并评估其免疫原性。首先以幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)铁蛋白序列为基础，将FMDV优势中和表位序列插入铁蛋白第33和34位氨基酸之间，同时将耶尔森氏菌属(Yersinia) T细胞表位序列插入铁蛋白氨基酸序列的氨基末端，构建具有铁蛋白序列、B细胞表位(优势中和表位)和T细胞表位的重组表达质粒pET28a-FBT，以仅插入铁蛋白序列的重组质粒pET28a-Fer作为对照。将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，经诱导表达和分子筛层析纯化获得目的蛋白，利用SDS-PAGE、Western blot、粒径分析和透射电镜进行鉴定，进一步免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)评价免疫原性。结果显示，利用大肠杆菌表达系统成功制备的铁蛋白纳米颗粒FBT可与FMDV阳性血清发生特异性反应；FBT免疫14 d即产生血清抗体，并持续升高，在免疫35 d中和抗体效价最高可达1∶128；同时，FBT免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖水平和白介素2 (interleukin 2, IL-2)、IL-4、IL-10、干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)分泌水平显著高于对照组(P研究制备了展示FMDV中和表位且具有良好免疫原性的铁蛋白纳米颗粒，为新型口蹄疫基因工程疫苗的研制提供技术支持。

关键词：铁蛋白纳米颗粒口蹄疫病毒(FMDV) 中和表位 T细胞表位免疫原性

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结核分枝杆菌免疫逃逸机制研究进展

科学通报 2024年第4期69卷 531-541页

作者：李娜宋银娟储岳峰兰州大学动物医学与生物安全学院中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州730000

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的一种对全球人类健康和经济社会发展具有重大影响的人兽共患病.结核分枝杆菌感染人类已有数千年的历史,在其与人类宿主共同进化的过程中,Mtb已发展... 详细信息

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的一种对全球人类健康和经济社会发展具有重大影响的人兽共患病.结核分枝杆菌感染人类已有数千年的历史,在其与人类宿主共同进化的过程中,Mtb已发展出多种巧妙的策略以逃避宿主的免疫防御,从而建立持续性感染.然而,我们对其免疫逃逸的分子机制以及细菌的毒力因子在Mtb不同感染阶段下发挥的作用了解有限.研究表明,在Mtb感染的早期阶段,肺泡巨噬细胞无法控制Mtb的感染,在进入肺间质后,Mtb可通过调控细胞内感染、损害抗原提呈、破坏巨噬细胞和T细胞功能等手段达到免疫逃逸的目的.本文详细回顾并综述了近年来结核分枝杆菌调控巨噬细胞自噬、凋亡以及适应性免疫应答等过程的分子机制,这些分子机制对于开发新的宿主导向疗法以及保护性疫苗至关重要.

关键词：结核分枝杆菌巨噬细胞免疫逃逸宿主导向疗法

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猪圆环病毒2型LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2024年第6期54卷 728-734页

作者：毛首会杜国玉刘晓波吴锦艳兰喜何继军尚佑军王桂琴刘永杰中国农业科学院、兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州1730046 宁夏大学农学院宁夏银川750021

本研究旨在建立一种快速、准确且易于操作的猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)检测方法。首先以PCV2的ORF2基因作为靶基因,设计4条LAMP与5条CRISPR特异性引物,再分别优化获得LAMP反应体系和CRISPR检测体系中各成分最佳配比浓度... 详细信息

本研究旨在建立一种快速、准确且易于操作的猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)检测方法。首先以PCV2的ORF2基因作为靶基因,设计4条LAMP与5条CRISPR特异性引物,再分别优化获得LAMP反应体系和CRISPR检测体系中各成分最佳配比浓度,经过特异性、灵敏度、重复性以及符合性验证,最终建立了快速检测PCV2的LAMP-CRISPR/Cas12a方法。结果显示,该方法最小检测量接近1 copy质粒DNA,灵敏度远高于本实验室常用的PCR方法,且在相同条件下只有PCV2呈阳性结果,其他均呈现阴性,表明特异性良好。同时该方法具有良好的重复性,批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,该方法与qPCR之间的符合率较高,可通过肉眼观察在蓝光下的反应产物判断结果。结果表明,建立的LAMP-CRISPR/Cas12a体系适用于PCV2的快速检测。

关键词：猪圆环病毒2型 CRISPR/Cas12a检测环介导等温扩增

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奶牛结合珠蛋白生物信息学分析及其多克隆抗体的制备

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中国兽医学报 2024年第3期44卷 558-564,594页

作者：刘佩雯董伟韬陈艳赵晓萱贺海健卢挺张全伟张勇刘光远甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 甘肃省动物生殖生理与繁殖调控重点实验室甘肃兰州730070 中国农业科学院、兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学生命科学技术学院甘肃兰州730070

结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)是奶牛罹患乳房炎期间一种重要的标志性蛋白,其在血液和乳汁中含量变化与患牛乳房炎病情密切相关。为制备奶牛Hp多克隆抗体及了解其理化性质、结构和功能,本研究通过PCR成功扩增获得奶牛Hp完整CDS区序列,对... 详细信息

结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)是奶牛罹患乳房炎期间一种重要的标志性蛋白,其在血液和乳汁中含量变化与患牛乳房炎病情密切相关。为制备奶牛Hp多克隆抗体及了解其理化性质、结构和功能,本研究通过PCR成功扩增获得奶牛Hp完整CDS区序列,对其进行生物信息学分析和pQE-80L-Hp原核表达载体的构建。将测序成功的重组质粒转化至M15感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导重组蛋白的表达。重组蛋白表达后用亲和层析法进行纯化。利用纯化后的蛋白免疫动物制备多克隆抗体,利用ELISA方法和Western blot对多克隆抗体进行效价检测和反应性分析。结果显示,Hp是一种不稳定亲水性蛋白,分子式为C_(1936)H_(3049)N_(545O567)S_(19),编码388个氨基酸残基,由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲4种结构组成,有15个抗原决定族,36个磷酸化位点。在1~42氨基酸位置存在信号肽,无跨膜结构域与CD163、MMP9、CP等蛋白具有较好的互作关系。pQE-80L-Hp在大肠杆菌中经诱导表达的重组蛋白的相对分子质量为42 kDa,主要以包涵体的形式存在,用其免疫兔子制备得到的多克隆抗体效价可达到1∶25600。本研究结果不仅有助于了解Hp的结构,而且为后续进行其功能的研究以及利用其作为标志物进行奶牛乳房炎早期高效快速诊断技术的研发奠定了基础。

关键词：结合珠蛋白生物信息学原核表达多克隆抗体奶牛

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多房棘球绦虫感染的检测方法研究进展

中国兽医科学 2024年第7期54卷 946-954页

作者：游杰李立孙继文詹舒懿逯文颖周蜓蜓殷宏贾万忠闫鸿斌中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室国家动物包虫病专业实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心甘肃省动物寄生虫病重点实验室江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

棘球蚴病是由棘球绦虫的幼虫（中绦期）——棘球蚴引起的一类人兽共患寄生虫病。感染棘球绦虫的终末宿主（犬、狐狸等）是传染源，及时准确检测终末宿主感染状况是防控棘球蚴病的关键环节。本文综述了多房棘球绦虫感染的病原学、分子生... 详细信息

棘球蚴病是由棘球绦虫的幼虫（中绦期）——棘球蚴引起的一类人兽共患寄生虫病。感染棘球绦虫的终末宿主（犬、狐狸等）是传染源，及时准确检测终末宿主感染状况是防控棘球蚴病的关键环节。本文综述了多房棘球绦虫感染的病原学、分子生物学和免疫学检测方法的研究进展，以期为终末宿主多房棘球绦虫感染的检测方法研究和试剂盒研发提供指导。

关键词：多房棘球绦虫犬科动物粪DNA 粪抗原分子生物学检测免疫学诊断

南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白单抗的制备与特性研究

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病毒学报 2024年第4期 794-801页

作者：朱昱茜石正旺罗俊聪陈婕林永玉席韬张帆石鑫泰郑海学包世俊田宏甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院家畜疫病病原生物学国家重点实验室

为制备南非2型口蹄疫病毒型特异性单克隆抗体，本研究通过原核系统表达南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白，亲和层析的方法纯化目的蛋白。将纯化的VP1蛋白使用弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/c小鼠，待加强免疫后取血清效价最稳定的小鼠脾细胞与小鼠... 详细信息

为制备南非2型口蹄疫病毒型特异性单克隆抗体，本研究通过原核系统表达南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白，亲和层析的方法纯化目的蛋白。将纯化的VP1蛋白使用弗氏佐剂乳化后，免疫BALB/c小鼠，待加强免疫后取血清效价最稳定的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，应用间接ELISA筛选针对南非2型VP1蛋白的单克隆抗体。采用特异性试验、叠加试验和抗体亚型鉴定等方法对筛选的单克隆抗体特性进行分析。结果发现，本研究成功表达南非2型VP1蛋白，筛选出2株能稳定分泌特异性针对南非2型VP1蛋白的杂交瘤细胞株（3B2和6F2），其亚型分别为IgG2a和IgG1，叠加试验结果表明2株单抗的叠加系数>40%，说明两株单抗针对不同的抗原位点；单抗的效价可达1∶256 000，特异性试验证明2株单抗均不与O型、A型口蹄疫病毒及其他常见猪病病毒产生交叉反应。由此可见，本研究制备的单克隆抗体具有良好的特异性和反应性，为南非2型口蹄疫病毒定型诊断和未来疫苗的研制奠定了基础。

关键词：南非2型口蹄疫病毒 VP1蛋白特异性单克隆抗体

基于猪细小病毒6型VP1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

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农业生物技术学报 2024年第6期32卷 1462-1470页

作者：欧云文潘琴汪洋代军飞任绍科张洋张杰开江县动物疫病预防控制中心中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室

猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6, PPV6)是一种新发现的猪细小病毒，可导致猪(Sus scrofa)出现繁殖障碍，严重威胁养猪业健康发展。为建立一种检测PPV6抗体的间接ELISA方法，本研究以PPV6流行毒株高度保守的病毒颗粒蛋白(virio... 详细信息

猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6, PPV6)是一种新发现的猪细小病毒，可导致猪(Sus scrofa)出现繁殖障碍，严重威胁养猪业健康发展。为建立一种检测PPV6抗体的间接ELISA方法，本研究以PPV6流行毒株高度保守的病毒颗粒蛋白(virion protein, VP1)(348～675 aa)的编码基因为目标片段，构建原核表达载体pET30a-PPV6-VP1，转入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)感受态细胞，IPTG诱导表达，进行Ni-NTA树脂亲和层析纯化，获得具有良好的反应原性的重组VP1蛋白，大小约为40 k D。基于纯化的重组VP1蛋白建立间接ELISA抗体检测方法，优化出最佳抗原包被浓度为1 ng/μL，待检血清最佳稀释比例为1∶100,HRP-兔抗猪IgG稀释比例为1∶60 000，阳性临界值OD450>0.62。该间接ELISA检测方法与猪蓝耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、古典猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)、PPV1阳性猪血清均不发生交叉反应，敏感度达1∶3 200，批内变异系数和批间变异系数均中国西部地区部分省份收集的452份猪血清进行检测，结果显示样品阳性率为5.31%，表明该病在我国西部地区存在不同程度的感染。本研究成功截短表达了PPV6 VP1 (348～675 aa)蛋白，建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PPV6间接ELISA方法，为PPV6的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

关键词：猪细小病毒6型(PPV6) VP1蛋白截短表达 ELISA

细粒棘球蚴感染绵羊血清miRNA差异表达及诊断价值评价

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第3期 295-302页

作者：吴易璇郭小腊陈轶霞西北民族大学生命科学与工程学院中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室

目的筛选细粒棘球蚴感染后绵羊血清中差异表达的miRNA，评价其在棘球蚴病诊断中的潜在价值。方法 10只绵羊分为感染组（5只）和对照组（5只），感染组每只绵羊灌胃2 000个细粒棘球绦虫虫卵，对照组绵羊给予生理盐水。感染后60 d，收集... 详细信息

目的筛选细粒棘球蚴感染后绵羊血清中差异表达的miRNA，评价其在棘球蚴病诊断中的潜在价值。方法 10只绵羊分为感染组（5只）和对照组（5只），感染组每只绵羊灌胃2 000个细粒棘球绦虫虫卵，对照组绵羊给予生理盐水。感染后60 d，收集两组绵羊外周血，提取血清总RNA，利用小RNA高通量测序鉴定并筛选差异表达的miRNA。选取5个差异表达miRNA进行实时荧光定量逆转录PCR (qRT-PCR)验证，并采用Medcale软件绘制受试者工作特征（ROC）曲线，计算曲线下面积（AUC），筛选具有潜在诊断价值（AUC≥0.7）的miRNA。采用qRT-PCR检测15份细粒棘球蚴感染绵羊血清样品中具有潜在诊断价值的miRNA的转录水平，并计算曲线下面积（AUC）以及敏感性和特异性。采用miRanda和RNAhybrid软件对差异表达miRNA的靶基因进行预测，并进行基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）路径富集分析。结果测序结果显示，共鉴定出26个差异性表达的miRNAs，其中21个上调表达，5个下调表达。qRT-PCR结果显示，感染组oar-miR-191、oar-let-7a、oar-miR-150、oar-miR-26a、oar-miR-21等5个相对丰度较高的差异miRNA的相对表达水平分别为2.22±0.31、2.12±0.24、2.42±0.35、2.09±0.15、3.23±0.83，均高于对照组（1.00±0.11），其中oar-miR-191、oarlet-7a、oar-miR-150、oar-miR-26a的相对表达水平与对照组差异有统计学意义（t=3.960、4.766、4.096、9.126，均P 研究筛选出oar-miR-191和oar-miR-150在细粒棘球蚴感染诊断中具有较好的灵敏度和特异性，有望成为细粒棘球病诊断的潜在生物标志物。

关键词：细粒棘球蚴微小RNA 血清高通量测序 ROC曲线

基于大肠杆菌表达系统高效生产外源蛋白的自诱导培养基的研发

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中国兽医科学 2024年

作者：侯茁邵军军刘伟高闪电彭德财宁小雨马云云温升辉常惠芸中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控国家重点实验室OIE/国家口蹄疫参考实验室甘肃省病原生物学基础学科研究中心

为提高大肠杆菌生产抗原的产量，实现企业降本增效，加快口蹄疫多表位疫苗的产业化进程，本研究拟研发适合大肠杆菌表达系统高效表达重组蛋白的自诱导培养基，并以实验室构建的口蹄疫多表位重组表达质粒为试验对象，通过正交试验、优化... 详细信息

为提高大肠杆菌生产抗原的产量，实现企业降本增效，加快口蹄疫多表位疫苗的产业化进程，本研究拟研发适合大肠杆菌表达系统高效表达重组蛋白的自诱导培养基，并以实验室构建的口蹄疫多表位重组表达质粒为试验对象，通过正交试验、优化诱导温度、筛选和确定最佳自诱导培养基配伍。结果显示，在16℃诱导培养，自诱导培养基表达可溶性蛋白的产量为普通LB培养基的6倍，而成本却降低了78%。这说明我们成功研发出了适合原核表达系统的自诱导培养基，其良好的成本效益性价比将有助于生物制品生产企业降低成本，提高产品的竞争力，具有广阔应用前景的产品。

关键词：大肠杆菌表达自诱导培养基乳糖