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副结核分枝杆菌免疫原蛋白的筛选及免疫保护效果评价

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中国农业科学 2024年第6期57卷 1204-1214页

作者：陈凡若张嘉俊鹿萍崔宁崔莹莹崔子寅党光辉刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

【背景】副结核病(paratuberculosis,PTB)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis,MAP)主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营... 详细信息

【背景】副结核病(paratuberculosis,PTB)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis,MAP)主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营养不良、贫血、嗜睡甚至死亡。PTB给畜牧业造成巨大的经济损失，并且严重威胁公共卫生安全。由于目前临床上对于PTB的检测和控制手段不够完善，现有的PTB疫苗保护效果不佳，并且干扰牛结核病的诊断，因此亟需研发免疫原性强、保护效果佳的疫苗以用于PTB的防控。【目的】通过筛选MAP免疫原蛋白，并对其免疫保护效果进行评价，为PTB的防控提供数据支持。【方法】根据MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527这6个基因，分别构建5种重组质粒，在获得5种重组蛋白基础上，联合MONTANIDE ISA 61 VG佐剂皮下多点注射免疫小鼠，通过IFN-γ ELISPOT试验筛选出最佳免疫原；随后将最佳免疫原和已报道的66NC融合蛋白混合，经皮下多点注射免疫小鼠，在二免3周后用1×108CFU的MAP K-10菌株腹腔感染小鼠。通过IFN-γ ELISPOT试验，抗体监测和细胞因子检测，分析感染后小鼠的体重、肝脏病理学和组织病理学变化及其荷菌数差异，综合评价候选亚单位疫苗的免疫原性和免疫保护效果。【结果】以MAP p22、map1272c、map3531c、map3783以及map3701c为基础成功构建和表达了5种融合蛋白58F、62F、69F、46F和52F，其中免疫58F后产生的IFN-γ水平最高，是更具潜力的候选免疫原，且以融合蛋白组合66NC+58F诱导持久高滴度的IgG、IgM、IgG1和IgG2a水平，诱导特异性的IFN-γ、TNF-α和IL-17A的释放；在保护效果评价中，融合蛋白组合66NC+58F抵抗MAP感染造成的体重下降，显著减轻肝脏的病理损伤，降低MAP在肝脏中的定植。【结论】融合蛋白组合66NC+58F诱导小鼠产生Th1和Th17型免疫反应，对MAP感染有着一定免疫保护作用，是PTB重要的候选亚单位疫苗。

关键词：副结核分枝杆菌亚单位疫苗 58F蛋白免疫评价

细粒棘球蚴感染绵羊血清miRNA差异表达及诊断价值评价

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第3期42卷 295-302页

作者：吴易璇郭小腊陈轶霞西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046

目的筛选细粒棘球蚴感染后绵羊血清中差异表达的miRNA,评价其在棘球蚴病诊断中的潜在价值。方法 10只绵羊分为感染组(5只)和对照组(5只),感染组每只绵羊灌胃2 000个细粒棘球绦虫虫卵,对照组绵羊给予生理盐水。感染后60 d,收集两组绵羊... 详细信息

目的筛选细粒棘球蚴感染后绵羊血清中差异表达的miRNA,评价其在棘球蚴病诊断中的潜在价值。方法 10只绵羊分为感染组(5只)和对照组(5只),感染组每只绵羊灌胃2 000个细粒棘球绦虫虫卵,对照组绵羊给予生理盐水。感染后60 d,收集两组绵羊外周血,提取血清总RNA,利用小RNA高通量测序鉴定并筛选差异表达的miRNA。选取5个差异表达miRNA进行实时荧光定量逆转录PCR (qRT-PCR)验证,并采用Medcale软件绘制受试者工作特征(ROC)曲线,计算曲线下面积(AUC),筛选具有潜在诊断价值(AUC≥0.7)的miRNA。采用qRT-PCR检测15份细粒棘球蚴感染绵羊血清样品中具有潜在诊断价值的miRNA的转录水平,并计算曲线下面积(AUC)以及敏感性和特异性。采用miRanda和RNAhybrid软件对差异表达miRNA的靶基因进行预测,并进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)路径富集分析。结果测序结果显示,共鉴定出26个差异性表达的miRNAs,其中21个上调表达,5个下调表达。qRT-PCR结果显示,感染组oar-miR-191、oar-let-7a、oar-miR-150、oar-miR-26a、oar-miR-21等5个相对丰度较高的差异miRNA的相对表达水平分别为2.22±0.31、2.12±0.24、2.42±0.35、2.09±0.15、3.23±0.83,均高于对照组(1.00±0.11),其中oar-miR-191、oarlet-7a、oar-miR-150、oar-miR-26a的相对表达水平与对照组差异有统计学意义(t=3.960、4.766、4.096、9.126,均P 研究筛选出oar-miR-191和oar-miR-150在细粒棘球蚴感染诊断中具有较好的灵敏度和特异性,有望成为细粒棘球病诊断的潜在生物标志物。

关键词：细粒棘球蚴微小RNA 血清高通量测序 ROC曲线

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2019-2022年中国H6N1亚型禽流感病毒的生物学特性分析

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中国农业科学 2024年第9期57卷 1820-1832页

作者：陈源崔鹏飞施建忠张元成于晴晴颜成张亚萍王丛丛张洁王燕邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室/国家禽类实验动物资源库

【背景】H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）广泛流行于我国南方地区，是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配，并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段，产生新型重组病毒，进而威胁... 详细信息

【背景】H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）广泛流行于我国南方地区，是我国家禽中最常见AIV之一。H6N1亚型AIV频繁地与其他野鸟源毒株重配，并且可以作为供体为高致病性AIV提供内部基因片段，产生新型重组病毒，进而威胁人类健康。【目的】通过对我国H6N1亚型AIV的演化动态及其相关生物学特性分析研究，为我国禽流感的综合防控提供数据支持。【方法】采集2019—2022年我国25个省（直辖市、自治区）的活禽交易市场及养殖场家禽喉和泄殖腔拭子，通过接种鸡胚分离到7株H6N1亚型AIVs并对其进行全基因组测序，分析其遗传演化特征、受体结合特性及其对SPF鸡和BALB/c小鼠的感染性。【结果】遗传演化分析表明，7株病毒的基因与分离于北美及东南亚地区的野鸟源病毒基因同源性较高，基因来源复杂，具有明显的遗传多样性。贝叶斯演化分析表明，H6亚型AIV HA基因曾发生过多次的跨洲际传播，欧亚谱系病毒在北美地区也有着较长时间流行。1株病毒HA基因与北美地区毒株基因高度同源，根据贝叶斯演化分析结果，推测该病毒在野鸟体内经历了复杂的基因重配后形成，后经野鸟传入我国。特殊氨基酸位点分析结果显示，病毒HA蛋白裂解位点序列均为PQIETR↓GLF，符合低致病性AIV特征；此外，另有1株病毒的NP蛋白发生Y52H突变，据报道，该突变对AIV获得抵抗人干扰素刺激基因BTN3A3的能力起到关键作用。受体结合特性分析表明，部分毒株具有双受体结合特性，但结合人源受体能力弱于结合禽源受体能力。病毒对SPF鸡的感染性试验表明，鸡感染A/chicken/Jiangxi/S40445/2019(H6N1)后能通过呼吸道及消化道排毒，并且病毒可在鸡群内通过接触传播。鸡感染A/duck/Jiangxi/S10941/2019(H6N1)后仅有少数鸡通过呼吸道排毒，病毒无法在鸡群间通过接触传播。BALB/c小鼠的感染性试验表明，H6N1亚型AIV无需提前适应便可在小鼠呼吸道内有效复制，但对小鼠仍呈低致病力。【结论】2019—2022年分离于我国的H6N1亚型AIV基因大部分来源于野鸟源病毒，候鸟可经东亚-澳大利亚迁徙路线将病毒传入我国；部分病毒能够结合人源唾液酸受体并在小鼠呼吸道内有效复制，表明该亚型病毒对公共卫生安全构成潜在威胁。

关键词： H6N1 禽流感病毒跨洲际传播重配感染性

长角血蜱Ykt6蛋白抗东方泰勒虫感染的生物学效应

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中国兽医科学 2024年第3期54卷 386-392页

作者：罗金赵帅阳车丽妍严若锋宋小凯任巧云关贵全殷宏刘光远李祥瑞南京农业大学动物医学院、教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏南京210095 中国农业科学院、兰州兽医研究所、动物疫病防控全国重点实验室、甘肃省动物寄生虫病重点实验室、农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046

为了解Ykt6基因在蜱体中影响东方泰勒虫感染的生物学效果,通过长角血蜱实验室培养株和野外株,评估Ykt6蛋白对东方泰勒虫侵染长角血蜱过程中蜱的存活率、繁殖率以及对东方泰勒虫感染率等指标的生物学效果。结果显示,Ykt6基因参与了东方... 详细信息

为了解Ykt6基因在蜱体中影响东方泰勒虫感染的生物学效果,通过长角血蜱实验室培养株和野外株,评估Ykt6蛋白对东方泰勒虫侵染长角血蜱过程中蜱的存活率、繁殖率以及对东方泰勒虫感染率等指标的生物学效果。结果显示,Ykt6基因参与了东方泰勒虫与长角血蜱之间的宿主-寄生虫相互作用。Ykt6基因的表达水平与东方泰勒虫在长角血蜱体内的存活和繁殖能力密切相关,当该基因表达水平降低时,东方泰勒虫的存活率和繁殖能力显著下降。进一步的研究发现,Ykt6基因的变异可能影响东方泰勒虫与长角血蜱之间的相互作用。一些野外长角血蜱个体具有Ykt6基因的突变,导致东方泰勒虫在长角血蜱体内的存活和繁殖能力显著下降。这一发现提示,Ykt6基因的变异可能是东方泰勒虫入侵长角血蜱的一个关键因素。总之,Ykt6基因对东方泰勒虫入侵长角血蜱具有重要影响。通过研究Ykt6基因的功能和变异,可以深入了解东方泰勒虫与长角血蜱之间的相互作用,为控制东方泰勒虫入侵提供新的思路和方法。这将有助于保护人畜健康和生态环境的平衡。

关键词：长角血蜱东方泰勒虫 Ykt6蛋白感染生物学效果

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口蹄疫病毒O型全自动磁微粒CLIA抗体定量检测方法的建立

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中国农业科学 2024年第4期57卷 810-819页

作者：包艳芳蒋韬何莉吕律李涛善李昕孙燕燕杨光魏婷潘晓乐林密兰州兽研生物科技有限公司中国农业科学院兰州兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室/国家口蹄疫参考实验室

【背景】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、烈性传染病，疫苗接种是预防临床口蹄疫的有效措施。免疫抗体水平监测则是评估疫苗免疫效果、制定免疫程序的重要依据，是免疫工作和疫情防控必不可少... 详细信息

【背景】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、烈性传染病，疫苗接种是预防临床口蹄疫的有效措施。免疫抗体水平监测则是评估疫苗免疫效果、制定免疫程序的重要依据，是免疫工作和疫情防控必不可少的关键环节，因此建立高效、快速、全自动的抗体检测方法具有重要意义。【目的】基于磁微粒(micromagnetic particles,MPs)化学发光免疫分析技术(CLIA)，建立一种新型、全自动、可定量的口蹄疫病毒O型抗体检测方法，为口蹄疫免疫监测和疫情防控提供技术支撑。【方法】使用纳米材料磁微粒为固相载体和分离载体包被捕获抗体，用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)标记检测抗体，经过条件优化建立了一种新型磁微粒CLIA检测方法(magnetic particle chemiluminescence immunoassay,MP-CLIA)。本方法首先加入磁微粒-兔抗偶联物(magnetic particle-polyclonal antibodies,MPs-p Abs)、待测样本、口蹄疫病毒O型抗原，37℃孵育；再加入适量酶标抗体(ALP-p Abs),37℃孵育；最后加入化学发光底物AMPPD，检测相对发光强度(relative light unit,RLU)。研究通过检测标准品拟合标准曲线，并应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)确定检测方法的判定标准；利用质控样本进行方法学评价，同时检测田间样本，并和液相阻断ELISA(LPB-ELISA)比对，验证临床检测效果。【结果】优化后最佳反应条件为磁微粒浓度0.25 mg·m L-1、口蹄疫病毒O型抗原1﹕1 000稀释、酶标抗体1﹕2 000稀释、加样量20μL。整个检测过程均在全自动化学发光免疫分析仪中完成，反应时间20 min，在抗体含量0—1 280 U(效价0—1﹕2 048)范围内标准曲线R2>0.99，可进行定量检测。该方法敏感性为94.66%；特异性为97.10%，检测口蹄疫A型、Asia I型血清型特异性为97.14%，与塞内卡病毒(SVV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、牛流行热病毒(BEFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、羊痘病毒(QRFV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体阳性血清无交叉反应；重复检测变异系数CV值疫病毒O型抗体定量检测方法，本方法对应的试剂盒已经完成中试生产和临床检测试验，在全国不同区域试用效果较好，具有较高的临床应用价值。

关键词：磁微粒化学发光免疫分析法口蹄疫磁微粒全自动化

基于COⅠ、ITS2和16S rDNA基因序列对盾糙璃眼蜱的分子分类与厘定

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中国兽医科学 2024年

作者：王彦龙罗金车丽妍昝晓庆朱婷婷赵爱云任巧云张振杰刘光远齐萌河北师范大学生命科学学院塔里木大学动物科学与技术学院中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室宁夏大学农学院

盾糙璃眼蜱的分类尚不明确，为厘清盾糙璃眼蜱的分类，解析其系统发育关系。本研究自新疆维吾尔自治区莎车县采集动物体表寄生的蜱，对其进行形态学观察，初步鉴定蜱种类；提取蜱的DNA样本后，基于蜱的COⅠ、ITS2和16S rDNA基因，对DNA... 详细信息

盾糙璃眼蜱的分类尚不明确，为厘清盾糙璃眼蜱的分类，解析其系统发育关系。本研究自新疆维吾尔自治区莎车县采集动物体表寄生的蜱，对其进行形态学观察，初步鉴定蜱种类；提取蜱的DNA样本后，基于蜱的COⅠ、ITS2和16S rDNA基因，对DNA样本进行PCR扩增、序列分析和种类鉴定，利用MEGA 7.0软件构建系统发育树。结果显示，经形态学观察，初步鉴定本研究所获蜱的种类为盾糙璃眼蜱；将测序获得的COⅠ、ITS2和16S rDNA基因序列进行比对和同源性分析，发现与国内外已鉴定的盾糙璃眼蜱序列同源性分别为99.84%、99.52%和98.42%，鉴定本研究所获蜱的种类为盾糙璃眼蜱。种系发育树显示，本研究所获蜱的COⅠ、ITS2和16S rDNA序列均与已知盾糙璃眼蜱的序列聚成一支，与璃眼蜱属蜱的序列聚类形成一个大支，而与其他蜱种类形成不同分支。本研究结果为新疆部分地区蜱种分布和鉴定提供了基础参考数据。

关键词：盾糙璃眼蜱分类形态学分子鉴定系统发育

豆状囊尾蚴小胞外囊泡可抑制家兔外周血淋巴细胞NLRP3活化

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中国兽医科学 2024年

作者：蒲桂婷王立群刘婷丽王得先曹珊菱郭小腊殷宏骆学农中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

本研究旨在探究家兔感染豆状囊尾蚴过程中炎症小体的表达。取豆状带绦虫的孕卵节片感染家兔，分离不同感染时期的外周血淋巴细胞，检测NLRP3、IL-1β等炎症小体相关基因的表达水平。同时，收集豆状囊尾蚴的分泌排泄产物，并通过超速离... 详细信息

本研究旨在探究家兔感染豆状囊尾蚴过程中炎症小体的表达。取豆状带绦虫的孕卵节片感染家兔，分离不同感染时期的外周血淋巴细胞，检测NLRP3、IL-1β等炎症小体相关基因的表达水平。同时，收集豆状囊尾蚴的分泌排泄产物，并通过超速离心分离小胞外囊泡，用分泌排泄产物和小胞外囊泡分别处理外周血淋巴细胞，24小时后，qPCR和Western-blot分析炎症小体相关基因的表达变化。结果显示，家兔感染后第30天和60天，炎症小体相关基因NLRP3、IL-1β、Caspase-1及GSDMD的表达水平明显升高，而在感染第90天时明显下降；用分泌排泄产物处理PBLC后，NLRP3、IL-1β、Caspase-1及GSDMD的表达水平也明显升高；而用小胞外囊泡处理细胞后，虽然IL-1β的表达水平升高，但NLRP3、Caspase-1及GSDMD的表达水平明显受到了抑制。说明豆状囊尾蚴可通过其分泌排泄产物或小胞外囊泡调控家兔外周血淋巴细胞炎症小体的活化，从而达到其长期生存和持续感染的目的。

关键词：豆状囊尾蚴 NLRP3炎症小体分泌排泄产物小胞外囊泡

环形泰勒虫Tams1单个B细胞抗体的制备及鉴定

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中国兽医科学 2024年

作者：张楚晗赵帅阳朱浩瀚苏书晓关贵全罗建勋殷宏刘军龙中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学

本研究旨在利用单个B细胞抗体技术制备环形泰勒虫Tams1蛋白特异性单克隆抗体对其反应性进行鉴定。构建重组质粒pET-30a-Tams1，并进行蛋白原核表达与纯化。纯化的Tams1蛋白免疫健康黄牛，第4次免疫后结合流式分选技术，从外周血单个核... 详细信息

本研究旨在利用单个B细胞抗体技术制备环形泰勒虫Tams1蛋白特异性单克隆抗体对其反应性进行鉴定。构建重组质粒pET-30a-Tams1，并进行蛋白原核表达与纯化。纯化的Tams1蛋白免疫健康黄牛，第4次免疫后结合流式分选技术，从外周血单个核细胞获得分泌Tams1特异性单克隆抗体的B淋巴细胞(IgM-/CD21+/抗原+B淋巴细胞)。经单细胞裂解及反转录后，通过巢式PCR扩增获得IgG天然配对的轻/重链可变区域序列，并克隆至包含IgG 轻/重链恒定区域的真核表达载体。配对质粒共转染HEK-293T细胞后，收集细胞培养上清，Western-blot 结果显示所得8株抗体均能与Tams1蛋白结合。同时IFAT结果证明8株抗体可与裂殖子表面抗原Tams1特异性结合。上述结果表明，本研究成功获得8株Tams1特异性单克隆抗体，为后续该蛋白的功能研究及单个B细胞抗体制备技术平台的建立奠定基础。

关键词：环形泰勒虫 Tams1 单个B细胞抗体

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一起牛呼吸道综合征病原分析和鉴定

中国兽医科学 2024年

作者：刘永杰颜新敏刘萍张伟曹小安兰喜尚佑军何继军中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室

牛呼吸疾病综合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)是由多种病原和环境共同作用引起的多症状疾病，给牛养殖业带来了巨大经济损失。2023年3月陕西某肉牛场暴发BRDC，为了解造成此次病情的病原，采集4份发病牛的鼻腔深部棉拭... 详细信息

牛呼吸疾病综合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)是由多种病原和环境共同作用引起的多症状疾病，给牛养殖业带来了巨大经济损失。2023年3月陕西某肉牛场暴发BRDC，为了解造成此次病情的病原，采集4份发病牛的鼻腔深部棉拭子和4份病死牛组织样品，采用qPCR和qRT-PCR方法，分别对样品进行牛支原体(Mycoplasma bovis，M. bovis)、牛副流感病毒3型 (bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3)、牛鼻气管炎病毒(bovine herpes virus 1，BHV-1)、牛冠状病毒(bovine coronavirus，BCoV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，P. multocida)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica，M. haemolytica)、化脓隐秘杆菌(Pseudomonas pyogenes)、昏睡嗜血杆菌(Mycobacterium tuberculosis)共9种BRDC相关病原开展核酸检测。结果显示，M. bovis、P. multocida和Mycobacterium tuberculosis阳性率均为75%、***阳性率为50%、Pseudomonas pyogenes阳性率为62%、BCoV阳性率为25%，证实该场BRDC病情由以上6种病原混合感染引起；对病原进行分离鉴定获得1株溶血曼氏杆菌和1株巴氏杆菌，并开展了药敏实验分析。研究结果为该牛场犊牛呼吸道疾病防控和针对性治疗提供了参考依据。

关键词：牛呼吸道疾病综合征病原检测混合感染病原分离鉴定药敏试验