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真正柑橘果树类植物基于AFLP分子标记的分类与进化研究

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植物分类学报 2008年第5期46卷 682-691页

作者：谢让金周志钦邓烈中国农业科学院-西南大学柑橘研究所

用AFLP分子标记技术对芸香科Rutaceae柑橘亚科Aurantioideae真正柑橘果树类(the True Citrus Fruit Trees Group)6属植物的59个生物类型以及九里香Murraya exotica L.、蚝壳刺Severinia buxifolia Tenore和酒饼簕Atalantia buxifolia Oliv.进行了分析。从64对引物组合中筛选出15对分辨率好的引物对全部材料进行了扩增,共获得312条带,其中多态型带305条,多态位点达97.8%。利用PAUP软件构建了全部材料基于AFLP数据的UPGMA距离树。结果表明,AFLP证据支持基于形态特征建立的真正柑橘果树群以及群内各属的划分,只是金柑属Fortunella Swingle作为一个独立的分支嵌于柑橘属CitrusL.内。对于柑橘属,我们的分子证据支持Swingle关于亚属的划分以及Scora等关于***、***和***是真正柑橘亚属***三个基本种的观点。AFLP分子证据显示宜昌橙*** Swingle位于真正柑橘亚属中,与香橙*** ***的亲缘关系最近,而与大翼橙亚属***中马蜂柑*** DC.相隔甚远。另外,莽山野橘*** *** & ***在系统树上居于宽皮柑橘类的基部。最后,对真正柑橘果树群6属植物间以及柑橘属各主要类型(种)的进化关系进行了详细的讨论。

关键词： AFLP 进化谱系关系真正柑橘果树类

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科技期刊编辑从事出版学研究对职业发展影响探究——基于扎根理论视角

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科技与出版 2025年

作者：王新娟西南大学出版研究院

期刊编辑的职业发展是期刊高质量发展的核心和关键。从事出版学研究，是提升编辑学术地位和促进职业发展的重要途径。运用深度访谈和扎根理论的研究方法，对22位从事期刊编辑5年以上且具有编辑学研究经历的科技期刊编辑进行访谈，通过... 详细信息

期刊编辑的职业发展是期刊高质量发展的核心和关键。从事出版学研究，是提升编辑学术地位和促进职业发展的重要途径。运用深度访谈和扎根理论的研究方法，对22位从事期刊编辑5年以上且具有编辑学研究经历的科技期刊编辑进行访谈，通过三级编码步骤，对科技期刊编辑从事出版学研究对职业发展的影响进行探究。研究发现，从事出版学研究能够实现职务晋升、组织认同，同时提升自我效能感和职业责任感，从而拓宽职业发展道路。基于研究结果建议科技期刊编辑要充分认识出版学研究工作的重要性，实现科学素养与人文素养的融合，增强出版学研究工作的行动力，注重将研究成果应用于办刊实践。

关键词：科技期刊编辑出版学研究职业发展扎根理论

利用GBS技术研究240份宽皮柑橘的系统演化

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中国农业科学 2017年第9期50卷 1666-1673页

作者：王小柯江东孙珍珠西南大学柑橘研究所中国农业科学院柑橘研究所

【目的】GBS(genotyping-by-sequencing)是一种高效而经济的SNP(单核苷酸多态性)发掘和基因分型技术。采用GBS技术对240份宽皮柑橘进行基因分型,以阐明一些野生宽皮柑橘和地方品种的遗传背景,为其起源和演化研究提供更可靠的证据。【方... 详细信息

【目的】GBS(genotyping-by-sequencing)是一种高效而经济的SNP(单核苷酸多态性)发掘和基因分型技术。采用GBS技术对240份宽皮柑橘进行基因分型,以阐明一些野生宽皮柑橘和地方品种的遗传背景,为其起源和演化研究提供更可靠的证据。【方法】选用国家柑橘种质重庆资源圃保存的具有广泛遗传多样性和地理起源的240份宽皮柑橘作为材料,利用Eco R I限制性内切酶消化基因组DNA后构建GBS文库;然后进行Illumina HiSeqPE150二代测序获得短读序列,通过BWA软件将序列映射到克里曼丁参考基因组上,再利用SAMTOOLS软件鉴定SNP位点。依据SNP的基因分型结果,采用邻近法构建系统演化树,并进行主成分分析。【结果】利用GBS简化基因组测序技术对240份宽皮柑橘进行测序,共获得96.3 Gb的测序数据,平均每个样本测序数据为401.26 Mb,经过测序深度为4X、Miss0.2、次要等位基因频率(MAF)>0.01的筛选条件过滤,最后共获得了114 200个高质量的SNP位点。主成分分析结果显示240份宽皮柑橘被分为4大类,其中温州蜜柑亚群、野生宽皮柑橘亚群可明显区分于其他宽皮柑橘。利用系统演化树可将240份宽皮柑橘划分到11个类群中。系统演化树和主成分分析都揭示了不同地理来源和特定形态的宽皮柑橘在遗传水平上存在明显的差异,比如来源于日本的温州蜜柑、欧美的克里曼丁橘及其杂种后代,以及中国南方的野生宽皮柑橘由于地理分布不同而形成了较为独特的类型,彼此间能够相互区分开。进化树结果表明中国南、北不同地域的宽皮柑橘可能存在不同的演化路径,南岭山脉及南方地区的野生宽皮柑橘、酸橘和目前南方地区栽培的砂糖橘存在较近的起源演化联系,而北方宽皮柑橘的演化却与宽皮柑橘中的古老地方品种存在紧密联系。人工杂交育种、长期的人工选择和驯化形成了不同类型的宽皮柑橘,同时也导致宽皮柑橘遗传多样性的增加。另外,一些宽皮柑橘资源中的可疑亲本也通过GBS技术得以准确鉴定。本研究表明沃柑与金诺橘有较近的亲缘关系。【结论】GBS技术用于柑橘种质资源的基因分型高效可靠,建立的系统演化树可以对240份宽皮柑橘进行准确划分,与用植物形态学划分的结果高度吻合。另外,GBS技术用于资源材料的准确鉴定和亲缘关系的研究,可为柑橘植物新品种权的保护提供可靠的技术支撑。

关键词： GBS 宽皮柑橘系统演化品种鉴定

柑橘鳞皮病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

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园艺学报 2019年第7期46卷 1409-1416页

作者：李敏周天宇吴佳星周彦曹孟籍李中安西南大学中国农业科学院柑桔研究所

根据NCBI数据库柑橘鳞皮病毒(Citrus psorosis virus,CPsV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计了4组特异性引物,通过一系列优化,筛选并获得1组特异性引物。以感染CPsV的柑橘叶片总RNA为模板,采用一步法RT-LAMP(One-step reverse t... 详细信息

根据NCBI数据库柑橘鳞皮病毒(Citrus psorosis virus,CPsV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列设计了4组特异性引物,通过一系列优化,筛选并获得1组特异性引物。以感染CPsV的柑橘叶片总RNA为模板,采用一步法RT-LAMP(One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification),在60℃下反应60 min,对扩增产物进行琼脂糖电泳分析,同时测定其特异性和灵敏度。结果表明,建立的RT-LAMP检测方法能特异性扩增CPsV,灵敏度为RT-PCR的10倍。用RT-LAMP方法对87个田间样品进行检测,发现有5个样品感染了CPsV,其检测结果与RT-PCR法一致。RT-LAMP法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点,适合对CPsV样品的快速检测与鉴定。

关键词：柑橘柑橘鳞皮病毒 RT-LAMP 检测

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柑橘Rboh家族鉴定及其对激素和柑橘溃疡病的响应

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中国农业科学 2020年第20期53卷 4189-4203页

作者：秦秀娟祁静静窦万福陈善春何永睿李强西南大学/中国农业科学院柑桔研究所

【目的】活性氧(reactive oxygen species,ROS)是植物抗病反应中重要的信号分子,而Rboh是参与活性氧产生的关键酶之一。本研究通过鉴定和分析柑橘全基因组中Rboh基因家族生物信息学特性、生物胁迫相关植物激素和溃疡病菌(Xanthomonas ci... 详细信息

【目的】活性氧(reactive oxygen species,ROS)是植物抗病反应中重要的信号分子,而Rboh是参与活性氧产生的关键酶之一。本研究通过鉴定和分析柑橘全基因组中Rboh基因家族生物信息学特性、生物胁迫相关植物激素和溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染诱导下表达模式,为研究Rboh基因家族与柑橘抗溃疡病过程的相关性,进一步研究和利用柑橘Rboh基因打下基础。【方法】利用过氧化物酶数据库RedOxiBase和柑橘(甜橙)CAP数据库获得柑橘Rboh家族序列信息;利用生物信息学软件对CsRboh进行理化性质、系统进化关系、染色体定位、基因结构、蛋白功能结构域、保守基序和启动子元件系统分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析植物激素水杨酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)和溃疡病菌处理下CsRboh表达模式。【结果】鉴定得到7个柑橘Rboh家族成员(CsRboh01—CsRboh07),其编码蛋白包含784—946个不等的氨基酸残基,等电点(PI)分布在8.67—9.40,主要定位于细胞膜结构和细胞质。根据系统进化树可将柑橘Rboh家族划分为I—IV 4个亚家族。CsRboh家族基因不均匀分布在甜橙的5条染色体,均含有典型的呼吸爆发NADPH氧化酶结构域(NADPHx)、铁还原酶跨膜组件(Ferriceduct)、FAD结合结构域(FADinding)和铁还原酶NAD结合结构域(NADinding)4个功能结构域。CsRboh家族各基因的启动子区域含不同激素响应元件,数目和类型各有差异。qRT-PCR结果显示CsRboh基因家族各成员可响应激素和溃疡病菌诱导,在不同激素和溃疡病菌处理下感病品种晚锦橙和抗病品种四季橘中表达模式具有差异。结合系统进化树聚类分析、同源基因功能研究及其启动子区域顺式作用元件分析发现,CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06在抗、感两个品种中受柑橘溃疡病菌诱导表现出明显不同的表达趋势和表达量。【结论】CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06可能与柑橘品种抗、感性密切相关,是3个有潜力的抗溃疡病分子育种候选基因,初步确定CsRboh家族基因在柑橘响应溃疡病过程中发挥关键作用。

关键词：柑橘溃疡病 Rboh家族柑橘溃疡病菌水杨酸茉莉酸

柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

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中国农业科学 2020年第18期53卷 3707-3715页

作者：许建建王艳娇段玉马志敏宾羽周常勇宋震西南大学/中国农业科学院柑桔研究所

【目的】构建柑橘脉突病毒（citrus vein enation virus,CVEV）侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer;RACE（rapid amplification of cDNA ends）试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及C... 详细信息

【目的】构建柑橘脉突病毒（citrus vein enation virus,CVEV）侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】利用SMARTer;RACE（rapid amplification of cDNA ends）试剂盒对CVEV的5′序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物。以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA。利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA。通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙（Citrus aurantium）、邓肯葡萄柚（C. paradisi）、尤力克柠檬（***）、枳柚（C. paradisi×Poncirus trifoliata）、Rusk枳橙（P. trifoliata×C. sinensis）、枣阳小叶枳（P. trifoliata）,进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性。【结果】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆10个。随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901—CVEV1906的序列一致性为99.35%。其中,CVEV1901基因组全长5 983 nt,由5个开放阅读框、5′端207 nt和3′端198 nt的两个非翻译区、以及ORF2和ORF3之间122 nt的基因间隔区组成。序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98%和99.11%;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89%—98.61%;与同属中豌豆耳突花叶病毒（pea enation mosaic virus）和紫花苜蓿耳突病毒（alfalfa enamovirus）的序列一致性约90%。通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株（阳性率）分别为16/17（94.12%）、12/14（85.71%）、16/21（76.19%）、15/19（78.95%）、13/14（92.86%）和0/18（0）。其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象。【结论】建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状。

关键词：柑橘脉突病毒侵染性克隆基因组全长RT-PCR

柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达

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中国农业科学 2019年第4期52卷 639-650页

作者：胡安华祁静静张庆雯陈善春邹修平许兰珍彭爱红雷天刚姚利晓龙琴何永睿李强西南大学/中国农业科学院柑桔研究所

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件B... 详细信息

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域(LRR和LRR);构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP(GSVIVT01033370001)遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个(OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14)为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系(8个株系)进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降(为野生型的23.12%—75.49%),其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。

关键词：柑橘溃疡病多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 CsPGIP 超表达溃疡病抗性

GST pull-down联合LC-MS/MS筛选柑橘抗溃疡病转录因子CsBZIP40的互作蛋白

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中国农业科学 2019年第13期52卷 2243-2255页

作者：窦万福祁静静胡安华陈善春彭爱红许兰珍雷天刚姚利晓何永睿李强西南大学/中国农业科学院柑桔研究所

【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论... 详细信息

【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白(Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973)可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。

关键词：柑橘柑橘溃疡病柑橘溃疡病菌 BZIP GST pull-down 互作蛋白

柑橘叶斑驳病毒的逆转录重组酶聚合酶扩增检测

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中国农业科学 2021年第9期54卷 1904-1912页

作者：段玉许建建马志敏宾羽周常勇宋震西南大学/中国农业科学院柑桔研究所

【目的】建立柑橘叶斑驳病毒(citrus leaf blotch virus,CLBV)逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA)的快速检测体系,为该病毒提供快速、简便的检测方法。【方法】以CLBV ORF1保守序列为靶标,通过设计、筛选特异性检测引物、优化反应温度和反应时长等条件建立CLBV的RT-RPA检测体系。分别以感染CLBV、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)、柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)、柑橘裂皮类病毒(citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘碎叶病毒(citrus tatter leaf virus,CTLV)、柑橘鳞皮病毒(citrus psorosis virus,CPsV)、温州蜜柑萎缩病毒(satsuma dwarf virus,SDV)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)和柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)的柑橘核酸为模板,应用该体系进行RT-RPA扩增,评价检测特异性;利用CLBV阳性样品核酸的10倍浓度梯度稀释模板,比较RT-RPA、RT-PCR和RT-qPCR的检测灵敏度;通过比较上述3种方法对72份柑橘样品的CLBV检出率,检验所建立RT-RPA法的适用性。【结果】以感染了CLBV的柑橘核酸样品为模板,通过对设计的3对引物筛选试验、6个温度和5个反应时长的梯度试验,建立了CLBV的RT-RPA检测体系,明确引物RCLBV-F/RCLBV-R2能够特异扩增CLBV ORF1序列,且扩增效果良好,目的片段大小为144 bp,反应最适温度为40℃,反应最佳时长为30 min。在感染CLBV、CTV、CYVCV、CEVd、CTLV、CPsV、SDV、Xcc和CLas的柑橘样品、健康对照和空白对照中,该体系仅在CLBV侵染样品中扩增出预期大小的特异性目的条带,说明建立的RT-RPA检测体系特异性强;灵敏度检测结果表明,RT-RPA和RT-PCR的检测灵敏度相当,但低于RT-qPCR;所建立的RT-RPA方法在72份柑橘样品中检测出11份样品为CLBV阳性,检出率为15.28%,该结果与普通RT-PCR和RT-qPCR检测方法的检测结果一致。【结论】建立了CLBV的RT-RPA检测体系,该体系具有耗时短、操作简便、特异性强等优点,适用于田间一定规模柑橘样品的检测。

关键词：柑橘叶斑驳病毒逆转录重组酶聚合酶扩增快速检测