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山羊肺泡巨噬细胞永生化建立与表型鉴定

微生物学通报 2024年

作者：张文鑫丁一格孙嘉媛王欣慧刘真丁家波中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室(北方) 山东农业大学动物科技学院西北农林科技大学动物科技学院动物生物育种国际农业联合研究中心中国农业大学动物医学院

【背景】尽管已有多种人和鼠细胞系可以作为布鲁氏菌的体外侵染模型，但目前仍缺乏能够准确模拟其在体内感染过程的大动物体外细胞模型。【目的】为获得具有单一克隆特性的、能稳定传代的山羊肺泡巨噬细胞系，优化布鲁氏菌体外侵染山羊... 详细信息

【背景】尽管已有多种人和鼠细胞系可以作为布鲁氏菌的体外侵染模型，但目前仍缺乏能够准确模拟其在体内感染过程的大动物体外细胞模型。【目的】为获得具有单一克隆特性的、能稳定传代的山羊肺泡巨噬细胞系，优化布鲁氏菌体外侵染山羊细胞系模型。【方法】在无菌环境下用PBS灌洗山羊肺脏，分离得到原代山羊肺泡巨噬细胞；采用稳定转染SV40LT，抗性筛选的方法建立了永生化山羊肺泡巨噬细胞系；使用细胞免疫荧光和流式细胞术检测单核巨噬细胞表面特征性标志物CD14，利用鸡红细胞吞噬实验检测其吞噬能力；随后将布鲁氏菌（Brucella） M5疫苗株侵染该细胞系，在不同时期统计胞内活菌数。【结果】成功分离并构建了山羊肺泡巨噬细胞系，且具有典型的巨噬细胞形态学特征，呈现不规则形状，有伪足伸出，胞体较大，吞噬能力强；体外培养10 d，有95.4%原代细胞特异性表达CD14，永生化后仍有92.4%的细胞特异性表达CD14；与另外3种细胞相比，永生化后的肺泡巨噬细胞对布鲁氏菌敏感性与RAW264.7细胞近似，高于STICs细胞。【结论】成功建立永生化山羊肺泡巨噬细胞系，该细胞系为研究布鲁氏菌的致病机制及免疫逃逸机制提供了体外实验对象。

关键词： SV40LT 慢病毒布鲁氏菌攻毒模型流式细胞术

2020-2022年华中地区部分猪场猪圆环病毒3型的分子流行特征与遗传变异分析

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中国农业科学 2024年第3期57卷 613-626页

作者：李博天李春琪刘国平谢军曾攀赵润泽李桐裴洁郭利伟伍锐谭磊长江大学动物科学技术学院湖北省动物疫病预防控制中心四川农业大学动物医学院

【目的】通过系统性试验方案摸清我国华中部分地区猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3)流行病学及遗传变异特点，为PCV3疫苗研究提供数据基础。【方法】对华中地区(湖北、湖南和河南)15个规模化养猪场的3 500份临床采集样品进行real-ti... 详细信息

【目的】通过系统性试验方案摸清我国华中部分地区猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3)流行病学及遗传变异特点，为PCV3疫苗研究提供数据基础。【方法】对华中地区(湖北、湖南和河南)15个规模化养猪场的3 500份临床采集样品进行real-time PCR检测，分析不同猪群、不同组织器官、不同排毒量和对应流行病学症状特点关系。对部分阳性样本PCV3全基因组进行扩增、测序和分析。【结果】50.86%(1 780/3 500)被检样本为PCV3核酸阳性，不同发育阶段猪群PCV3均易感，保育猪、哺乳仔猪、生长育肥猪PCV3阳性率较高，分别为70.44%(498/707)、67.19%(596/887)、41.75%(177/424)。在不同组织器官和样品中，淋巴结、肺脏、产后胎盘样本PCV3阳性率为67.05%(59/88)、63.79%(74/116)、49.11%(55/112)，血液、初乳样本PCV3阳性率分别为56.09%(502/895)、44.20%(278/629)，且鼻拭子和唾液中均检出PCV3。出现猪繁殖障碍症状、厌食症状和呼吸障碍症状的猪群PCV3阳性率高，分别为44.43%(399/898)、36.43%(431/1183)、28.04%(233/831)。24条PCV3全基因组序列长度均为2000 nt，其全基因核苷酸序列同源性为98.4%—100%，与参考株PCV3全基因组的同源性为97.4%—99.5%。遗传进化分析结果显示，23株PCV3属于PCV3b亚型，1株属于PCV3a亚型。Rep氨基酸序列比对结果发现，PCV3-L2、L23和L14株分别在(N124I)、(A183E)和(V244I)出现独特变异位点；Cap蛋白氨基酸序列比对结果发现，PCV3-L15、L21、L3和L19株分别在(T45P)、(R2K)、(R14K)和(F7L)出现独特变异位点。【结论】PCV3可感染不同发育阶段猪群，且分布于不同组织器官中；PCV3可通过垂直传播(如初乳和精液)和水平传播(如口鼻分泌物和唾液)感染猪群；PCV3感染可能与生猪繁殖障碍、呼吸障碍和多器官炎症和关节炎症密切相关。此外，被调查地区规模化猪场同时流行PCV3a和PCV3b两种亚型，其中PCV3b亚型为优势毒株。研究通过全基因组氨基酸序列分析发现部分独特变异位点位于Cap蛋白，这可能导致Cap蛋白赋予的免疫原性发生变化。对PCV3全基因序列的遗传进化做出详细阐述，为未来的PCV3疫苗研究奠定基础。

关键词：猪圆环病毒3型病毒载量全基因组扩增遗传进化分析

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抗寄生虫中药活性成分体外抗细粒棘球蚴作用

中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第2期42卷 191-198页

作者：李昆雷夏俊邱美龄胡美荷吉古孝安候梦丹翟少华新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心) 乌鲁木齐830013

目的评价抗寄生虫中药水提物和有机溶剂粗提物体外对细粒棘球蚴的作用效果。方法从感染绵羊肝脏细粒棘球蚴包囊中分离原头节,体外培养24 h后,取活性大于95%的原头节(100μl,约100个)加入96孔板,分别加入终浓度为0.8 mg/ml(低浓度组)、1.... 详细信息

目的评价抗寄生虫中药水提物和有机溶剂粗提物体外对细粒棘球蚴的作用效果。方法从感染绵羊肝脏细粒棘球蚴包囊中分离原头节,体外培养24 h后,取活性大于95%的原头节(100μl,约100个)加入96孔板,分别加入终浓度为0.8 mg/ml(低浓度组)、1.6 mg/ml(中浓度组)、3.2 mg/ml(高浓度组)的鸦胆子、苦楝皮、辣蓼、石榴皮、使君子、槟榔、贯众、鱼藤、马蔺子、五倍子和仙鹤草等11种抗寄生虫中药的水提物,体外作用72 h后,伊红染色法检测原头节活性,倒置显微镜观察下观察原头节的形态,计算死亡率;同时设相同浓度的阿苯达唑组和空白对照组。从具有体外抗原头节作用的中药中提取黄酮、多糖、皂苷和生物碱等粗提物,分别以终浓度1.00 mg/ml体外作用于原头节72 h后,观察原头节形态,计算死亡率;同时设空白对照组。对体外抗原头节效果明显的粗提物进行液相色谱与串联质谱联用分析。组间比较采用单因素ANOVA分析,两两比较采用LSD-t检验。结果中药水提物作用72 h后,鸦胆子、苦楝皮、辣蓼水提物高浓度组原头节边缘模糊,结构松散,基质溶解;其余8种中药水提物高浓度组原头节形态正常,各部分结构清晰;阿苯达唑组原头节生发层有轻微损伤;空白对照组原头节形态正常。体外培养72 h后,鸦胆子、苦楝皮和辣蓼水提物高浓度组原头节的死亡率分别为(99.63±0.57)%、(90.89±1.10)%和(51.93±0.60)%,中浓度组分别为(85.97±1.50)%、(81.14±1.19)%、(42.46±0.56)%,低浓度组分别为(78.34±1.35)%、(77.27±0.92)%、(36.66±0.60)%,与空白对照组[(0.62±0.51)%]相比差异均有统计学意义(F=180678.22、41488.99、44346.38,19543.86、27887.32、34590.79,20059.467、41953.68、17993.77,均P0.05)。鸦胆子黄酮、苦楝皮黄酮、鸦胆子皂苷、辣蓼皂苷和辣蓼生物碱组原头节皱缩、结构松散、基质溶解,原头节死亡率分别为(98.33±2.89)%、(96.67±5.77)%、100%、(99.33±1.15)%和(56.67±2.11)%,与空白对照组[(10.33±2.51)%]比较差异均有统计学意义(F=1584.00、563.71、3808.47、3099.52、14.65,均P0.05)。液相色谱与串联质谱联用分析结果显示,正、负离子模式下分别鉴定出741、398种代谢产物,其中正离子模式下从鸦胆子黄酮粗提物中鉴定出差异显著的黄酮类化合物4种,分别为漆黄素、5-甲基-7-甲氧基异黄酮、儿茶素和甜橙黄酮;负离子模式下鉴定出8种,分别为原花青素B2、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、枸桔苷、橙皮素、槲皮素、木犀草素、芹菜素和黄豆黄素。结论鸦胆子、苦楝皮和辣蓼水提物,鸦胆子黄酮、苦楝皮黄酮、鸦胆子皂苷和辣蓼皂苷有明显体外抗细粒棘球蚴的作用,且效果优于阿苯达唑。

关键词：细粒棘球蚴抗寄生虫中药水提物粗提物液相色谱与串联质谱联用分析

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宠物淋证的中兽医临床诊断

中国兽医杂志 2024年第4期60卷 120-123页

作者：袁艳阳杨俪楠骆宗江朱子欣郝智慧中国农业大学动物医学院北京海淀100193 中国农业大学中兽医药创新中心北京海淀100193 农业农村部中兽医生物学重点实验室北京海淀100193

目前,淋证在中兽医学临床上缺乏科学、合理的诊治规范,诊断方法较为单一,阻碍了淋证诊治水平的提高。宠物淋证是宠物临床常见疾病,近年来这类病例有增多的趋势。但该证诊断体系尚未发展成熟,不能形成一个完善的辨证论治体系。本文依据... 详细信息

目前,淋证在中兽医学临床上缺乏科学、合理的诊治规范,诊断方法较为单一,阻碍了淋证诊治水平的提高。宠物淋证是宠物临床常见疾病,近年来这类病例有增多的趋势。但该证诊断体系尚未发展成熟,不能形成一个完善的辨证论治体系。本文依据中医和中兽医淋证相关内容,结合兽医临床实际诊断和用药观察,对宠物淋证进行辨证诊断,为宠物淋证的中兽医诊断提供参考,以期提高临床治疗效果。

关键词：宠物淋证辨证诊断中兽医

鸭瘟病毒gG基因缺失株的构建及其免疫保护效果研究

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中国预防兽医学报 2024年

作者：相生瑞陈柳霍苏馨朱寅初华炯钢张存云涛倪征丁方舟宋厚辉叶伟成浙江农林大学动物科技学院.动物医学院浙江省农业科学院畜牧兽医研究所南京农业大学动物医学院

鸭瘟病毒（DEV）是引起鸭群高致死率的重要病原。为探究gG基因对DEV疫苗株免疫保护效果的影响，本研究在本实验室已构建的DEV疫苗株细菌人工染色体感染性克隆pDEV-EF1基础上，通过“Red E/T两步重组”技术，构建了DEV g G基因缺失的感... 详细信息

鸭瘟病毒（DEV）是引起鸭群高致死率的重要病原。为探究gG基因对DEV疫苗株免疫保护效果的影响，本研究在本实验室已构建的DEV疫苗株细菌人工染色体感染性克隆pDEV-EF1基础上，通过“Red E/T两步重组”技术，构建了DEV g G基因缺失的感染性克隆pDEV-ΔgG，对其进行酶切、PCR和传至20代后的遗传稳定性试验。结果显示，成功构建了gG基因缺失株，且能在CEF上稳定传代，命名为rDEV-ΔgG。将rDEV-ΔgG和亲本病毒rDEV-EF1接种CEF，测定其体外生长曲线和蚀斑形成能力。结果显示，rDEV-ΔgG和rDEV-EF1的病毒滴度在24 h～72 h呈上升趋势，均在72 h时达到高峰，病毒滴度无显著差异；rDEV-ΔgG感染CEF后形成的蚀斑较亲本病毒r DEV-EF1产生的蚀斑减小了27.37%。以不同剂量免疫30日龄麻鸭2周后，进行DEV攻毒试验，观察其临床症状，统计麻鸭存活率，攻毒后1 d到9 d采集各组肛拭子，并在攻毒后2 d、4 d、6 d和8 d各组分别随机剖杀3只麻鸭，取其各组织脏器，经荧光定量PCR检测各组麻鸭排毒情况和各脏器病毒载量。攻毒试验结果显示，1.0×10～5TCID50和1.0×10～4TCID50rDEV-ΔgG免疫的麻鸭在强毒攻击下的保护率较相同剂量rDEV-EF1免疫的麻鸭均下降17%。各脏器病毒载量结果显示，在攻毒后2 d胸腺的病毒载量最高，其次是脾脏，在攻毒后4 d，食道、泄殖腔、胸腺病毒载量较高。泄殖腔排毒结果显示，攻毒后1 d～4 d泄殖腔排毒量持续升高，并在第4 d各组排毒量到达峰值。本研究比较了gG基因缺失病毒rDEV-ΔgG和亲本病毒rDEV-EF1的生物学特性和免疫保护效果差异，为明确g G在DEV基因组中的功能提供数据基础。

关键词：鸭瘟病毒 gG 非必需基因免疫保护

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稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立

中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 43-48页

作者：杨雪任善会王相伟龚真莉殷相平孙跃峰陈豪泰万学瑞甘肃农业大学动物医学院兰州730046 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞... 详细信息

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。

关键词：绵羊睾丸原代细胞人端粒酶逆转录酶基因 hTERT 永生化细胞系

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长链非编码RNA(lncRNA)-MSTRG.22610.1对BHV-1体外复制影响的研究

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中国预防兽医学报 2024年第3期46卷 278-284,299页

作者：姜坤生王禹淳马金柱于立权宋佰芬黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院黑龙江大庆163319 中国农业大学动物医学院北京100193

本研究室前期将牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)感染牛肾细胞(MDBK),通过转录组测序筛选到了转录显著差异的长链非编码RNA-MSTRG.22610.1(lncRNA-MSTRG.22610.1),为了探究其在MDBK中对BHV-1复制的影响,本研究采用CCK-8法筛选对细胞无毒性的聚凝... 详细信息

本研究室前期将牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)感染牛肾细胞(MDBK),通过转录组测序筛选到了转录显著差异的长链非编码RNA-MSTRG.22610.1(lncRNA-MSTRG.22610.1),为了探究其在MDBK中对BHV-1复制的影响,本研究采用CCK-8法筛选对细胞无毒性的聚凝胺、嘌呤霉素的最佳浓度;将重组慢病毒r ZHLV-U6-Zs Green1-puro-MSTRG.22610.1和r ZHLV-U6-Zs Green1-puro(对照慢病毒)按照不同的MOI分别感染MDBK细胞,48 h后观察荧光,采用Image J软件检测并计算各慢病毒感染细胞后出现绿色荧光细胞的比率,出现绿色荧光细胞的比率达80%的细胞对应的MOI即为最佳MOI。筛选结果显示聚凝胺与嘌呤霉素的最佳工作浓度分别为5μg/mL及3μg/m L,慢病毒感染的最适MOI为80。将r ZHLV-U6-Zs Green1-puro-MSTRG.22610.1和对照慢病毒分别以最佳条件感染MDBK细胞并培养及传代,传至8~10代,每代均观察细胞形态及细胞中的绿色荧光,并通过RT-q PCR检测第6、8、10代细胞中lncRNA-MSTRG.22610.1的转录水平,以构建并鉴定稳定表达lncRNA-MSTRG.22610.1的MDBK细胞系1T及对照细胞系1NC。结果显示,每代1T细胞、1NC细胞的状态均良好并均与阴性对照MDBK细胞的形态无差别,且每代1T及1NC细胞均出现绿色荧光。RT-q PCR结果显示,与1NC及阴性对照细胞相比,1T细胞系中lncRNA-MSTRG.22610.1的转录水平极显著升高(P系,且该细胞系的遗传稳定性较强。将BHV-110倍倍比稀释后分别感染传至10代的1T与1NC细胞,24 h后采用Reed-Muench法计算各组细胞中的病毒滴度。结果显示,1T、1NC及MB细胞(感染BHV-1的MDBK细胞)的病毒滴度分别为105.15 TCID50/0.1 m L、104.41TCID50/0.1 m L及104.58 TCID50/0.1 m L。与MB和1NC细胞相比,1T细胞中的病毒滴度显著升高(P<0.05),表明lnc RNA-MSTRG.22610.1表达后促进BHV-1在MDBK细胞中的复制。本研究为进一步探究lncRNA-MSTRG.22610.1促进病毒复制的分子机制及深入了解BHV-1感染的分子机制提供参考依据。

关键词：长链非编码RNA 牛肾细胞牛疱疹病毒I型慢病毒过表达病毒增殖

新型冠状病毒疫苗Ad5-nCoV不同给药途径异源加强接种的系统免疫原性比对分析

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中国药科大学学报 2024年第1期55卷 137-146页

作者：马文煊韩雨红林昂赵维俊中国药科大学基础医学与临床药学学院疫苗中心南京211198 中国药科大学新药安全评价研究中心南京211198 南京农业大学动物医学院南京210095

新冠疫苗异源加强接种可以解决疫苗单一使用时保护效力降低的问题。灭活新冠疫苗联合重组腺病毒载体新冠疫苗(Ad5-nCoV)的序贯接种模式和Ad5-nCoV肌肉注射给药或雾化吸入式给药两种途径已被批准用于临床。本研究在小鼠模型中,系统对比... 详细信息

新冠疫苗异源加强接种可以解决疫苗单一使用时保护效力降低的问题。灭活新冠疫苗联合重组腺病毒载体新冠疫苗(Ad5-nCoV)的序贯接种模式和Ad5-nCoV肌肉注射给药或雾化吸入式给药两种途径已被批准用于临床。本研究在小鼠模型中,系统对比分析了不同接种策略下小鼠体内抗原特异性T细胞、记忆B细胞(MBC)、抗体水平、抗体功能、黏膜免疫应答等关键指标以揭示作用机制。将接种组分为“磷酸盐缓冲液(PBS)对照组”(3×PBS组)、“2针灭活新冠疫苗+1针灭活新冠疫苗”同源加强接种组(3×INA组)、“2针灭活新冠疫苗+1针Ad5-nCoV肌肉注射组”[2×INA+Ad5(im)组]和“2针灭活新冠疫苗+1针Ad5-nCoV滴鼻给药组”[2×INA+Ad5(in)组]。结果显示:2×INA+Ad5(im)组与2×INA+Ad5(in)组异源接种诱导的抗体、Spike特异性T细胞、Spike+MBCs水平均显著高于3×INA组同源接种,Ad5-nCoV在肌肉注射途径下诱导的Spike特异性T细胞、Spike+MBCs水平显著高于滴鼻给药途径。Ad5-nCoV滴鼻加强接种不仅明显诱导血清和支气管灌洗液免疫球蛋白A产生,同时诱导更多中性粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞向肺组织中募集。本研究系统对比分析了Ad5-nCoV经不同给药途径异源加强接种后诱导的疫苗特异性免疫应答差异,为包括新冠疫苗在内的多种抗感染疫苗提供了预防接种策略指导。

关键词：新型冠状病毒疫苗异源加强接种同源加强接种给药途径免疫原性黏膜免疫

新型鹅细小病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

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中国家禽 2024年

作者：梁国洋毛明田郭华李芳张帅唐熠刁有祥山东农业大学动物科技学院动物医学院青岛易邦生物工程有限公司

为快速高效地检测新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus,NGPV），试验根据NGPV VP3基因序列设计特异性引物及探针，以NGPV KC3S3株提取的DNA为模板，在构建质粒标准品的基础上，建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。结果显示：该方... 详细信息

为快速高效地检测新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus,NGPV），试验根据NGPV VP3基因序列设计特异性引物及探针，以NGPV KC3S3株提取的DNA为模板，在构建质粒标准品的基础上，建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。结果显示：该方法的标准曲线为y=-3.081 6x+35.389，相关系数（R2）为0.998 1，质粒标准品浓度为1.0×102～1.0×108 copies/μL时具有良好的线性关系；该方法对禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）、星状病毒（Astrovirus,AstV）、小鹅瘟病毒（Goose parvovirus,GPV）、番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）、新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）、禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAV）等鸭常见病毒性病原均无特异性扩增；所设计引物及探针的基因序列与GPV及MDPV的相同区域有4～11个碱基发生突变，可以避免GPV及MDPV对检测结果的影响；该方法批内和批间检测变异系数（CV）均小于1.5%，对66份疑似感染NGPV鸭的肝脏样品检测阳性率为59.1%，高于常规PCR检测结果（31.8%）。结果表明，研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，可以有效区分GPV与MDPV，在NGPV感染的临床诊断和早期防控方面具有良好的应用前景。

关键词：新型鹅细小病毒 TaqMan探针荧光定量PCR 鸭