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我国畜禽细菌类主要兽医病原微生物及其疫苗研制与应用概况

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微生物学通报 2024年

作者：胡云皓刘燕朱良全中国兽医药品监察所

我国畜禽养殖体系庞大，细菌类病原微生物在畜禽间流行传播引发的畜禽疫病频发不仅会造成严重的经济损失，部分病原菌还会引发人兽共患病，威胁公共卫生安全。本文对我国近年来流行的家畜和家禽细菌类兽医病原微生物进行了概述，并梳理... 详细信息

我国畜禽养殖体系庞大，细菌类病原微生物在畜禽间流行传播引发的畜禽疫病频发不仅会造成严重的经济损失，部分病原菌还会引发人兽共患病，威胁公共卫生安全。本文对我国近年来流行的家畜和家禽细菌类兽医病原微生物进行了概述，并梳理了目前我国家畜和家禽疫苗研制和应用情况，以期为我国动物细菌类畜禽疫病的防控提供理论基础。

关键词：细菌病原微生物兽医疫苗

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

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动物医学进展 2024年第4期45卷 51-56页

作者：刘丹黄小洁吴华伟孙淼陈延飞秦义娴侯力丹薛麒中国兽医药品监察所北京100081

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重... 详细信息

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

关键词：牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白间接ELISA 抗体检测

鸡产蛋下降综合征病毒间接免疫荧光检测方法的建立及应用

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动物医学进展 2024年第1期45卷 44-51页

作者：孔冬妮王嘉邓永翟天舒刘丹黄小洁薛琪候力丹吴华伟薛青红李俊平毛娅卿中国兽医药品监察所北京100081

为建立检测鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)的间接免疫荧光方法,并对该检测方法的各个步骤进行优化,以鸡产蛋下降综合征病毒多抗血清和FITC标记的兔抗鸡IgG为组合,对一抗和二抗的最适工作浓度和孵育时间进行了优化,对IFA方法进行了敏感性、... 详细信息

为建立检测鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)的间接免疫荧光方法,并对该检测方法的各个步骤进行优化,以鸡产蛋下降综合征病毒多抗血清和FITC标记的兔抗鸡IgG为组合,对一抗和二抗的最适工作浓度和孵育时间进行了优化,对IFA方法进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果表明,检测接种EDSV的96孔细胞培养板时,多抗血清的最适工作浓度为1∶320,孵育时间为45 min;FITC标记的兔抗鸡IgG的最适工作浓度为1∶200,孵育时间为30 min;病毒敏感性试验表明,该方法可以检测到10-2 TCID 50/mL的病毒;多抗血清敏感度试验表明,当多抗血清稀释到1∶1280时仍可见较明显的特异性荧光;特异性试验表明,该方法只针对EDSV,而不与禽副流感病毒4型、鸡新城疫病毒等其他病原反应;批内重复性试验和批间重复性试验结果表明,该方法具有较好的重复性和可靠性。结果表明,建立的间接免疫荧光方法具有较高的灵敏度和较好的稳定性,可为我国禽源性生物材料EDSV的检测提供技术支持,有巨大的市场需求。

关键词：鸡产蛋下降综合征病毒多抗血清间接免疫荧光优化

牛结节性皮肤病病毒(NMG株)基因组DNA标准物质的研制

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中国预防兽医学报 2024年第3期46卷 320-325页

作者：苏佳白洪旭赵炜王德丽刘伟洁王芳薛青红陈晓春中国兽医药品监察所北京100081

为提高牛结节性皮肤病病毒(LSDV)核酸检测结果的准确性,本研究通过病毒核酸提取及质量检测、分装,制备LSDV NMG株基因组DNA标准物质。通过荧光定量PCR(qPCR)检测外源病毒评价其纯净性;采用液滴式数字PCR(ddPCR)方法检测LSDV ORF101基因... 详细信息

为提高牛结节性皮肤病病毒(LSDV)核酸检测结果的准确性,本研究通过病毒核酸提取及质量检测、分装,制备LSDV NMG株基因组DNA标准物质。通过荧光定量PCR(qPCR)检测外源病毒评价其纯净性;采用液滴式数字PCR(ddPCR)方法检测LSDV ORF101基因的拷贝数以评估该标准物质的均匀性、稳定性并与9家实验室协作标定;进一步采用qPCR方法对该标准物质试用。结果显示,本研究制备的标准物质不存在外源病毒污染;组内和组间无显著性差异,均匀性好;标准物质于-20℃稳定保存6个月,4℃稳定保存7d,25℃稳定保存24 h;标准物质ORF101基因最终定值为(8.6±1.3)×10~3拷贝/μL;可以用于qPCR检测。综上,该标准物质定值准确,均匀性好,不仅可以用于LSDV核酸检测相关实验的质量控制、仪器校准、检测方法评价,还可为研制体外诊断试剂提供物质基础。

关键词：牛结节性皮肤病病毒液滴式数字PCR 标准物质定值

非洲马瘟病毒(AV1311株)核糖核酸标准物质的研制

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中国兽医科学 2024年第3期54卷 308-315页

作者：苏佳张敏白洪旭张兵赵炜薛青红杨承槐陈晓春中国兽医药品监察所北京100081

标准物质是分子生物学诊断技术的金标准。针对国内无非洲马瘟病毒标准物质的现状,以其AV1311株为原料,通过病毒培养、灭活、分装、特性检验等,成功制备非洲马瘟病毒(AV1311株)核糖核酸标准物质。同时,建立数字PCR方法,对标准物质进行均... 详细信息

标准物质是分子生物学诊断技术的金标准。针对国内无非洲马瘟病毒标准物质的现状,以其AV1311株为原料,通过病毒培养、灭活、分装、特性检验等,成功制备非洲马瘟病毒(AV1311株)核糖核酸标准物质。同时,建立数字PCR方法,对标准物质进行均匀性评估、稳定性考察及9家实验室联合定值,并进行临床试用。结果显示,组内和组间无统计学差异,样品均匀;-20℃保存可稳定6个月,4℃保存可稳定7 d,25℃保存可稳定24 h,可冻融5次,需干冰运输;标准物质认定值为(6.9±1.1)×10^(3)copis/μL;临床试用显示,所制备的标准物质与临床样品互通性良好;最终通过全国标准物质管理委员会评审,获得国家二级标准物质证书[GBW(E)091272]。综上,本标准物质定值准确,均匀性好,量值稳定,为做好国内非洲马瘟防范工作提供了物质基础。

关键词：非洲马瘟病毒核糖核酸标准物质检测定值数字PCR

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猪瘟病毒C株表位突变毒株的构建及拯救

畜牧兽医学报 2024年第2期55卷 698-705页

作者：刘元杰徐璐朱元源徐嫄张乾义李翠李明夏应菊王琴刘业兵赵启祖邹兴启中国兽医药品监察所国家猪瘟参考实验室北京100081

本研究旨在突变猪瘟病毒C株WH303位点,构建感染性克隆,为猪瘟病毒C株标记疫苗的研究提供候选毒株。本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经重叠PCR方法突变WH303位点,再分别连接至C株和C-flag株全长感染性克隆。体外转录RNA,转染PK15细胞,细... 详细信息

本研究旨在突变猪瘟病毒C株WH303位点,构建感染性克隆,为猪瘟病毒C株标记疫苗的研究提供候选毒株。本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经重叠PCR方法突变WH303位点,再分别连接至C株和C-flag株全长感染性克隆。体外转录RNA,转染PK15细胞,细胞连续传代完成病毒的拯救和增殖。结果显示,经特异性限制内切酶酶切反应验证,感染性克隆构建成功。经RT-PCR、过氧化物酶单层细胞试验检测,表明病毒成功拯救。病毒细胞传代至17代,检测到病毒,表明病毒可以稳定传代。综上,本研究成功构建了C株WH303突变感染性克隆MC和MC-flag,并成功拯救MC株,得到可以稳定传代的病毒株。

关键词：猪瘟病毒 C株 WH303位点突变感染性克隆

少孢节丛孢菌响应几丁质诱导的m RNA表达谱特征分析

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西北农业学报 2024年

作者：李柠杏孙殿明张慧梅孙焱森李若冰孟庆玲乔军才学鹏石河子大学动物科技学院中国兽医药品监察所

少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora,AO)是一种重要的捕食线虫性真菌,具有防控动物线虫病的潜在应用前景。为了探究AO侵染线虫的分子机制,拟对几丁质诱导的AO和未诱导的AO菌丝进行m RNA转录组学测序和验证,利用GO和KEGG富集方法分析... 详细信息

少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora,AO)是一种重要的捕食线虫性真菌,具有防控动物线虫病的潜在应用前景。为了探究AO侵染线虫的分子机制,拟对几丁质诱导的AO和未诱导的AO菌丝进行m RNA转录组学测序和验证,利用GO和KEGG富集方法分析探究AO差异表达基因(DEGs)及其参与的代谢过程和关键信号通路,分析差异表达基因在AO响应几丁质诱导m RNA表达谱特征。结果显示,AO响应几丁质诱导后,共有2 904个DEGs,其中1 376个上调,1 528个下调;RT-q PCR结果显示,挑选的6个DEGs表达变化趋势与测序结果一致;GO分析发现,细胞代谢过程、碳水化合物代谢过程、氮化合物代谢过程等差异明显;KEGG分析显示,DEGs主要参与真核生物核糖体的生物发生、果糖和甘露糖代谢、几丁质酶基因、C源和N源吸收途径、信号传导、细胞壁合成及捕食器官形成等信号通路。该研究探究AO响应几丁质诱导的m RNA表达谱特征分析,为深入揭示少孢节丛孢侵染线虫的分子机制奠定前期研究基础。

关键词：少孢节丛孢菌转录组学几丁质差异基因

LM-Exos对巨噬细胞和CD8T淋巴细胞的调节作用

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南方农业学报 2024年

作者：焦健李能秀左雨霏马忠梅常意行张石磊孟庆玲才学鹏乔军石河子大学动物科技学院中国兽医药品监察所

【目的】检测感染LM后巨噬细胞Exos对免疫相关细胞的调节作用，将为研究LM感染进程提供新的理论依据。【方法】通过差异超速离心法结合分子排阻法提取了感染LM后巨噬细胞外泌体（LM-Exos），采用透射电子显微镜（TEM）、粒径分析（NTA... 详细信息

【目的】检测感染LM后巨噬细胞Exos对免疫相关细胞的调节作用，将为研究LM感染进程提供新的理论依据。【方法】通过差异超速离心法结合分子排阻法提取了感染LM后巨噬细胞外泌体（LM-Exos），采用透射电子显微镜（TEM）、粒径分析（NTA）、免疫印迹法对其进行鉴定，并利用实时荧光定量PCR、CCK-8、ELISA等分析LM-Exos对巨噬细胞（M?）及CD8+T细胞的调控作用。【结果】LM-Exos直径为60～100nm的类圆形双层膜结构小囊泡；Westernblotting分析显示，LM-Exos表面含有CD9、CD63、TSG101表面标记分子。LM-Exos刺激细胞结果表明，不同剂量的LM-Exos对M?与CD8+T细胞具有不同的调控效应。低剂量（4μL）的LM-Exos刺激下M?细胞因子表达无显著变化；中等剂量（20μL）刺激下M?细胞因子表达量上升；高剂量（40μL）刺激下M?细胞因子表达极显著上升。M?促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α在刺激12～24h表达量较高，而抑炎细胞因子IL-10表达量在12～48h呈上升趋势。此外，LM-Exos刺激可增强M?活性和对LM的抵抗力。LM-Exos刺激CD8+T后可引起其发生细胞分化，并引起CD8+T细胞的凋亡。【结论】LM-Exos对巨噬细胞和CD8+T细胞具有不同的调节作用，为揭示LM的感染及免疫机制提供了新的见解。

关键词：单核细胞增多性李斯特菌外泌体巨噬细胞 CD8 T细胞调节作用

少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492对线虫的降解作用研究

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生物技术通报 2024年第5期40卷 261-268页

作者：张嘉华张慧梅马喜喜孙焱森李若冰李柠杏才学鹏乔军孟庆玲石河子大学动物科技学院石河子832003 中国兽医药品监察所北京100081

【目的】为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492的生物学功能。【方法】对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达。利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白Re... 详细信息

【目的】为探究捕食线虫真菌少孢节丛孢菌几丁质诱导过程中分泌蛋白AO-492的生物学功能。【方法】对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-492主要结构域编码区进行基因克隆及分子特征分析,并在毕赤酵母中进行表达。利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白ReAO-Z492,采用NAG检测法分析了该重组蛋白在不同温度、pH及金属离子条件下的酶学活性,并将其作用于秀丽隐杆线虫及虫卵分析其生物学功能。【结果】几丁质酶AO-492有信号肽,无跨膜结构域,含有两个几丁质结合结构域和一个糖苷水解酶18家族结构域,并含有糖苷水解酶18家族几丁质酶高度保守的底物结合位点-SVGGWT-和水解酶活性位点-FDGGDLDWE-,含有典型的TIM桶形分子结构。系统进化分析显示,该蛋白与坚粘孢单顶孢几丁质酶(EPS35099.1)的亲缘关系相对最近。SDS-PAGE和Western Blot分析表明,ReAO-Z492分子量约为59 kD,可与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生特异性反应。ReAO-Z492最适温度为40℃,最适pH为7.0;Mg^(2+)对其酶活有促进作用,而Ag^(+)、Cu^(2+)、Fe^(3+)和Zn^(2+)有抑制作用。ReAO-Z492对秀丽隐杆线虫体壁及其虫卵卵壳有较强的降解活性。【结论】少孢节丛孢菌几丁质酶 AO-492 对秀丽隐杆线虫及虫卵具有较强的降解作用。

关键词：少孢节丛孢菌几丁质酶 ReAO-Z492 酶学活性捕食线虫真菌

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