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作者：李玉姣中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

研究背景2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种以高血糖为特征的代谢性疾病,其发病率在不断升高。最近的研究报告了2型糖尿病与多种口腔疾病易感性之间的密切联系,口腔微生物作为人类五大细菌库之一,其会受到口腔疾病和2型... 详细信息

研究背景2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一种以高血糖为特征的代谢性疾病,其发病率在不断升高。最近的研究报告了2型糖尿病与多种口腔疾病易感性之间的密切联系,口腔微生物作为人类五大细菌库之一,其会受到口腔疾病和2型糖尿病等全身系统性疾病的影响,反之口腔微生物也会影响宿主的全身健康和疾病状态,故深入探究2型糖尿病与口腔微生物群落之间的关系至关重要。随着科技进步及微生物测序技术的发展,人们对口腔微生物的研究不再局限于传统的分离培养方法,而是有了一系列的高通量测序技术。目前对2型糖尿病患者口腔微生物组的研究多采用16S r DNA测序,但其依赖于基因中特定区域的测序,所选择的特定区域很可能无法充分代表完整基因而导致物种分类学分析的分辨率有限,从而只能检测到全部序列的一部分。宏基因组学测序技术要比16S r DNA测序具有更高的分辨率,其不仅可以发现一些低丰度的细菌类群,而且能够检测微生物的功能基因。目前,关于筛查2型糖尿病患者口腔微生物群落功能基因的研究尚不多见。因此,本研究拟采用宏基因组学测序技术对2型糖尿病患者的口腔微生物群落结构与功能进行探究,进一步深入分析2型糖尿病患者口腔微生态区系的变化,以探索2型糖尿病与其口腔微生物组成及功能变化的关系,提高我们对血糖水平与口腔菌群关系的认识,从而为寻找反映血糖水平的生物标志物或为2型糖尿病患者高发口腔疾病的生物学防治提供理论基础。研究目的1.探究2型糖尿病患者与正常对照人群的口腔微生物组成及多样性差异。2.探究2型糖尿病患者与正常对照人群的口腔微生物功能基因组成及差异。3.比较2型糖尿病患者口腔不同微生态区系微生物差异。研究方法第一部分2型糖尿病患者与正常人群口腔微生物组成及多样性差异分析利用宏基因组学测序技术完成2型糖尿病患者和正常对照组人群唾液和龈上菌斑样本的测序。用MEGAN软件注释处理基因集,然后将同一物种的基因丰度累计,获得物种丰度。与数据库进行比对,得到门、纲、目等各分类等级的物种组成。运用统计学以及生物信息学方法对2型糖尿病患者和正常对照组人群口腔微生物的结构和多样性差异进行分析。第二部分2型糖尿病患者与正常人群口腔微生物功能组成及差异分析利用宏基因组学测序技术完成2型糖尿病患者和正常对照组人群唾液和龈上菌斑样本的测序。将宏基因组测序得到的非冗余基因分别注释到KEGG、CAZy、COG、egg NOG等这些功能数据库,获得丰度和基因个数信息。运用统计学以及生物信息学方法对2型糖尿病患者与正常对照人群口腔微生物的功能基因组成及代谢通路富集差异进行分析。第三部分2型糖尿病患者不同口腔微生态区微生物组成及功能分析利用宏基因组学测序技术完成2型糖尿病患者的唾液和龈上菌斑样本的测序。运用统计学以及生物信息学方法对2型糖尿病患者唾液和龈上菌斑两种不同口腔微生态区微生物及功能基因组成差异进行分析。研究结果第一部分2型糖尿病患者与正常人群口腔微生物组成及多样性差异分析1.本实验采用宏基因组学测序技术对2型糖尿病患者和正常对照人群唾液和龈上菌斑微生物进行分析,共注释到了55个门、78个纲、157个目、339个科、1262个属、5000个种。2.2型糖尿病患者和正常对照人群两组间唾液以及龈上菌斑的α多样性指标均无显著差异(P>0.05)。3.2型糖尿病患者和正常对照人群口腔微生物LEf Se分析结果显示,相比于正常对照人群,2型糖尿病患者口腔微生物中齿垢密螺旋体、牙龈卟啉单胞菌、产黑色素普雷沃菌等牙周致病菌明显升高,而2型糖尿病患者口腔微生物中的龋病致病菌变形链球菌、远缘链球菌等与正常对照组无明显差异。4.2型糖尿病患者口腔唾液和龈上菌斑微生物与空腹血糖、糖化血红蛋白等环境因子的RDA分析和Spearman相关性分析结果显示,齿垢密螺旋体、中间普雷沃菌、变黑普雷沃菌、牙龈卟啉单胞菌、坦纳拟普雷沃菌、莫雷梭菌等与空腹血糖呈正相关;产黑色素普雷沃菌、变黑普雷沃菌、殊异韦荣菌、小韦荣菌、纤细弯曲菌等微生物与糖化血红蛋白呈正相关;丙酸丙酸杆菌与糖化血红蛋白呈负相关。第二部分2型糖尿病患者与正常人群口腔微生物功能组成及差异分析1.本实验采用宏基因组学测序技术分别构建了2型糖尿病患者和正常对照组的唾液和龈上菌斑微生物的高质量基因集。2.本研究通过对KEGG数据库功能注释发现,2型糖尿病患者和正常对照组唾液和龈上菌斑微生物KEGG功能代谢途径主要集中在碳水化合物代谢、辅酶和维生素的代谢和氨基酸代谢等,其中碳水化合物代谢途径在口腔微生物代谢中发挥了重要作用。3.2型糖尿病患者和正常对照组唾液和龈上菌斑微生物的KEGG功能基因代谢通路富集差异结果显示,2型糖尿病患者口腔微生物糖酵解/糖异生代谢、磷酸转移酶系统、精氨酸代谢、赖氨酸代谢、酪氨酸代谢、群体感应代谢通路相比正常对

关键词：宏基因组学 2型糖尿病口腔疾病口腔微生物微生物多样性功能基因

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社区失能老人抑郁、焦虑症状现状调查及心理护理干预方案构建

社区失能老人抑郁、焦虑症状现状调查及心理护理干预方案构建

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作者：曹效亲中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

目的:1.调查社区失能老人抑郁、焦虑症状的现状和影响因素。2.了解社区失能老人心理护理干预需求。3.构建心理护理干预方案,为促进社区失能老人心理健康提供参考和依据。方法:1.于2021年8月至2022年3月,采取便利抽样法,以西安市8家社区... 详细信息

目的:1.调查社区失能老人抑郁、焦虑症状的现状和影响因素。2.了解社区失能老人心理护理干预需求。3.构建心理护理干预方案,为促进社区失能老人心理健康提供参考和依据。方法:1.于2021年8月至2022年3月,采取便利抽样法,以西安市8家社区325位失能老人为研究对象。使用一般资料调查问卷、简版老年抑郁量表、广泛性焦虑量表、Herth希望量表、罗森伯格自尊量表和社会支持评定量表进行横断面问卷调查。采用卡方检验和Fisher精确概率法进行单因素分析,运用二元logistic回归进行多因素分析,了解社区失能老人抑郁、焦虑症状现状和影响因素。2.采取目的抽样法,选择前期调研中存在抑郁、焦虑症状的失能老人为研究对象。通过一对一质性访谈收集资料。运用Colaizzi 7步法进行访谈资料的整理分析。掌握失能老人心理护理干预需求,为方案的构建提供框架。3.以上述研究阶段构建的方案框架为基础,结合国内外相关指南与文献,初步构建社区失能老人心理护理干预方案。通过专家会议对初稿进行修订,确定社区失能老人心理护理干预方案。结果:1.量性研究(1)325位研究对象中119人出现抑郁症状,占比36.6%。多因素logistic回归显示失能程度高(OR=2.613,95%CI:1.402～4.873)、自评健康差(OR=1.583,95%CI:1.003～2.498)是社区失能老人抑郁症状的危险因素,希望水平高(OR=0.176,95%CI:0.085～0.365)、自尊水平高(OR=0.262,95%CI:0.152～0.450)、社会支持水平高(OR=0.395,95%CI:0.174～0.900)是社区失能老人抑郁症状的保护性因素。(2)出现焦虑症状的有35人,占比10.8%。多因素logistic回归结果表明女性(OR=2.498,95%CI:1.093～5.711)、非在婚(OR=2.298,95%CI:1.017～5.192)、睡眠状况差(OR=1.682,95%CI:1.042～2.717)是社区失能老人焦虑症状的危险因素,而希望水平高(OR=0.180,95%CI:0.084～0.385)是社区失能老人焦虑症状的保护性因素。2.质性研究通过对20名失能老人进行质性访谈,总结归纳的心理护理干预需求包括健康照护(生活照护、医疗照护)、社会参与(户外活动、社会交往)、自我发展与完善、支持(家庭支持、社会支持)。3.方案构建最终纳入6篇指南,16篇文献。结合量性研究及质性研究结果,形成的初稿包括4个模块,9个主题和37项干预措施。11名专家参与专家会议对初稿进行修订。专家的权威系数为0.895,积极系数为100%。最终形成的社区失能老人心理护理干预方案包括4个干预框架,9个干预主题,32个干预措施。结论:1.社区失能老人中存在抑郁、焦虑症状的占比较高。应重点关注失能程度高、自评健康差、女性、非在婚、睡眠状况差的老人。同时采用积极的心理护理干预措施来提高失能老人希望水平、自尊水平及社会支持水平,从而提高其心理健康水平。2.通过量性研究、质性研究、文献回顾和专家会议法构建的社区失能老人心理护理干预方案涵盖健康照护、社会参与、社会支持、精神慰藉四大方面,具有较高的科学性和可行性,为促进社区失能老人心理健康提供了参考和依据。

关键词：失能老人抑郁焦虑专家会议心理干预

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CD226参与Treg细胞功能调控的效应及其分子机制研究

CD226参与Treg细胞功能调控的效应及其分子机制研究

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作者：马菁昌中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

研究背景调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)对于维持免疫耐受和组织内环境稳定至关重要,在移植免疫、肿瘤免疫、感染免疫、自身免疫病等领域具有良好的研究价值和应用潜力。近年来研究表明,Treg细胞并不是终末分化状态的稳定细胞亚群... 详细信息

研究背景调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)对于维持免疫耐受和组织内环境稳定至关重要,在移植免疫、肿瘤免疫、感染免疫、自身免疫病等领域具有良好的研究价值和应用潜力。近年来研究表明,Treg细胞并不是终末分化状态的稳定细胞亚群,表现出一定程度的可塑性和异质性。在某些炎症条件下,部分Treg细胞可以获得效应T细胞样表型(Teff-like phenotype),免疫抑制能力受损或丧失,并表达某些促炎细胞因子,导致机体免疫紊乱。然而,目前关于Treg维持表型稳定的调节机制尚不完全清楚。共刺激分子CD226为I型糖蛋白,广泛表达于T、NK等细胞表面,参与调控造血发育和免疫细胞活化等过程。既往研究表明,CD226信号促进CD8T、NK细胞的杀伤功能,以增强抗肿瘤免疫作用;CD226信号促使初始CD4T细胞向Th1型分化;CD226信号促进脂肪组织巨噬细胞的M1型极化,参与肥胖的发生发展。然而,Treg细胞作为CD4T细胞的一个亚群,也表达较高水平的CD226分子,但该分子对Treg功能调控的效应和机制尚存在争议。研究目的阐明CD226分子对Treg细胞功能和表型稳定性的调节作用及机制,探索干预Treg细胞调节机体免疫稳态的新靶点。研究方法为了研究CD226分子对于Treg细胞发育和表型的影响,我们分离野生型(WT)和基因敲除型(CD226KO)小鼠的胸腺细胞进行单细胞测序,分析Treg亚群的基因表达差异;制备Treg细胞特异性CD226敲除小鼠(CD226Foxp3),分选Treg细胞与Tconv进行共培养,分析Treg细胞的体外抑制功能;流式细胞术检测Treg细胞抑制性细胞因子IL-10、TGF-β的分泌水平,以及Foxp3、CD25、CTLA-4、TIGIT等功能相关分子的表达情况。为了检测CD226调控Treg细胞的体内效应,我们分别构建了应对自身抗原和同种异体抗原的两种炎症反应模型:***诱导的溃疡性结肠炎模型,记录小鼠生存情况、体重变化以及肠炎症状,在第7天对结肠组织进行HE染色和病理评分,利用免疫组化和荧光染色分析免疫细胞浸润情况,利用q PCR检测炎症相关细胞因子的表达。2.急性移植物抗宿主病(Graft-versus-host-disease,Gv HD)模型,将C57BL/6小鼠的骨髓和脾脏细胞经尾静脉注射至Co辐照清髓处理的BALB/c受体鼠中,记录其存活情况、体重变化和症状表现,在第14天对皮肤、小肠、大肠、肝脏和脾脏等器官取材进行HE染色,分析Gv HD疾病程度及造血重建情况。为了研究CD226调控Treg细胞的分子机制,我们利用流式细胞术分选CD4Foxp3Treg细胞,进行全转录组测序,分析CD226对Treg细胞基因表达谱的影响;利用流式细胞术,检测Treg细胞分泌促炎细胞因子IFNγ、TNF-α、IL-4、IL-17的水平以及表达Th细胞亚群转录因子T-bet、Gata3、Ro Rγt的情况;利用Seahorse等手段检测Treg细胞氧化磷酸化及糖酵解水平;利用q PCR和Western blot检测Treg细胞中代谢相关分子Myc的表达水平;应用Myc小分子抑制剂JQ1处理Treg细胞,检测Treg细胞代谢和表型的改变。研究结果单细胞测序结果显示,CD226KO小鼠胸腺Treg数目增加,与野生型Treg相比,CD226敲除的Treg细胞Foxp3、Il2ra等主要标志基因没有变化,但Treg稳定性相关分子CD69、Satb1、Xiap表达下调,且Th1型细胞相关分子Cxcr3、Irf1、Stat1表达上调;WT与CD226KO两组小鼠Treg细胞的差异基因富集到Treg功能相关、Th1型分化相关以及代谢相关通路,提示CD226参与了维持Treg细胞表型稳定性。在Treg细胞特异性CD226敲除小鼠中,胸腺、脾脏及淋巴结的Treg细胞数目增加,Treg细胞的Foxp3、CTLA-4、CD25、ICOS、TIGIT和KLRG1表达水平没有变化,但IL-10、TGF-β表达水平下降,对Tconv细胞增殖的抑制能力下降。在DSS诱导溃疡性结肠炎的动物实验中,与对照组CD226Foxp3小鼠相比,Treg细胞特异性CD226敲除的CD226Foxp3小鼠的存活率较低,便血、体重下降等疾病症状更为严重,结肠组织病理评分更高,T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞浸润明显增加。在急性Gv HD模型中,CD226Foxp3供体骨髓细胞使得受体造血重建更完全,同时伴有更高的Gv HD疾病评分,表现为严重的弓背、翘毛、便血和体重减轻,存活率显著降低;皮肤、肠道、肝脏的病理损伤更为严重,提示CD226敲除损害Treg细胞的免疫抑制功能。分选出Treg细胞进行全转录组测序显示,与野生型Treg相比,

关键词： CD226 Treg 溃疡性结肠炎急性移植物抗宿主病

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PD-L1对瘢痕疙瘩血管内皮细胞生物学行为的影响

PD-L1对瘢痕疙瘩血管内皮细胞生物学行为的影响

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作者：董瑞娜中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

【研究背景】瘢痕疙瘩是一种创伤愈合异常导致的皮肤纤维化疾病,组织病理主要表现为细胞外基质的过度沉积与血管系统的异常。瘢痕疙瘩常超越伤口边界,侵袭周围正常皮肤,引起局部皮肤瘙痒、疼痛与挛缩,给患者带来沉重的身心负担。目前瘢... 详细信息

【研究背景】瘢痕疙瘩是一种创伤愈合异常导致的皮肤纤维化疾病,组织病理主要表现为细胞外基质的过度沉积与血管系统的异常。瘢痕疙瘩常超越伤口边界,侵袭周围正常皮肤,引起局部皮肤瘙痒、疼痛与挛缩,给患者带来沉重的身心负担。目前瘢痕疙瘩的具体发病机制仍未阐明,导致多种治疗方案难以彻底控制病情进展。因此,明确瘢痕疙瘩的致病机理是急需攻克的临床难题。血管修复与重建是创伤愈合过程中必不可少的环节。目前认为,血管内皮细胞生物学行为的异常参与了瘢痕疙瘩的发生与进展。瘢痕疙瘩组织病理显示,病理性成纤维细胞聚集于血管内皮细胞周围,提示血管内皮细胞可能参与皮肤纤维化调节。这表明,调控组织修复过程中血管内皮细胞的生物学行为可能是预防瘢痕疙瘩的重要策略。程序性死亡-配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)是细胞表面配体B7家族的一员,参与T细胞免疫功能的调节,可通过与T细胞表面的程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)结合发挥免疫抑制的作用。同时,研究发现,PD-L1与血管内皮细胞的生物学行为密切相关。目前,PD-L1在瘢痕疙瘩形成中发挥的作用尚无研究报道,但前期预实验结果证实:PD-L1在瘢痕疙瘩组织中表达异常,且瘢痕疙瘩中存在大量炎症细胞以及血管内皮细胞,提示PD-L1可能影响了瘢痕疙瘩的疾病进程。基于此,本课题通过临床样本明确了PD-L1在瘢痕疙瘩组织与正常皮肤组织血管内皮细胞中的差异性表达,采用体内外实验,探究了PD-L1对血管内皮细胞生物学行为的影响。为解释瘢痕疙瘩中的血管异常现象提供一定的理论基础,有助于瘢痕疙瘩发病机制的阐明。【研究目的】1.明确PD-L1在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织血管内皮细胞中的表达差异。2.通过体内外功能实验明确PD-L1对血管生物学行为的调控作用。【研究方法】一、瘢痕疙瘩组织中PD-L1的表达情况1.瘢痕疙瘩血管结构特点分析:通过H&E染色,观察瘢痕疙瘩与正常皮肤组织中血管形态、结构以及数目差异。***-L1在瘢痕疙瘩与正常皮肤组织中的表达情况:提取瘢痕疙瘩与正常皮肤组织蛋白以及RNA,通过Western blot、PCR比较两者PD-L1表达差异。***-L1在瘢痕疙瘩与正常皮肤组织血管中的表达情况:通过免疫组化和免疫荧光染色,比较两者血管PD-L1表达差异。二、体外验证PD-L1对血管内皮细胞生物学行为的影响1.调控血管内皮细胞PD-L1对其功能的影响:通过管腔形成实验、Ki-67免疫荧光检测、Transwell迁移实验、划痕愈合实验,探索PD-L1对血管内皮细胞生物学行为的影响。2.观察炎症细胞与血管分布情况:通过免疫荧光染色,明确各种炎症细胞在瘢痕疙瘩组织中的分布情况以及与血管内皮细胞的位置关系。3.与T细胞共培养条件下,PD-L1对血管内皮细胞功能的影响:过表达血管内皮细胞PD-L1,将血管内皮细胞与T细胞共培养,通过管腔形成实验、Ki-67免疫荧光检测、Transwell迁移实验,明确T细胞存在时,PD-L1对血管内皮细胞生物学行为的影响。三、在体验证PD-L1对皮肤创面愈合及血管结构与功能的影响1.小鼠皮肤缺损模型的建立和抗体干预:取6-8周龄的雌性C57BL/6J小鼠,建立背部全层皮肤缺损模型,研究PD-L1对皮肤创伤愈合过程中血管内皮细胞功能的影响。设置分组:Ig G对照组、抗体处理组。于第3、7、10天进行腹腔抗体注射,在第12天对皮损组织取材进行组织学分析。2.疗效评价:(1)在第0、3、7、10、12天记录创面愈合情况,计算伤口愈合率;(2)通过H&E与免疫荧光染色,观察皮肤损伤部位的愈合情况,并检测血管密度、结构以及功能差异。【研究结果】一、瘢痕疙瘩组织中PD-L1的表达情况1.瘢痕疙瘩血管结构特点分析:(1)正常皮肤组织中,血管结构清晰,血管腔明显,可见周细胞环绕。(2)瘢痕疙瘩中血管管腔大量闭塞,血管内皮细胞均有不同程度受损。(3)血管分布有明确的分区:在真皮乳头下血管丛和瘢痕疙瘩与正常真皮交界区域,存在大量的毛细血管,血管增生明显,该部位血管发育较好,血管周围存在淋巴细胞等炎症细胞的浸润。瘢痕疙瘩深部,血管密度明显降低。在纤维疏松区可见血管,管壁增厚,管腔闭塞加重,腔内红细胞少见。血管内皮细胞核固缩并凸向管腔,周细胞退化。部分区域可见模糊不清的血管影。***-L1在瘢痕疙瘩与正常皮肤组织中的表达情况:Western blot和PCR结果显示,PD-L1在瘢痕疙瘩中的表达水平显著低于正常皮肤组织。***-L1在瘢痕疙瘩与正常皮肤组织血管中的表达情况:在瘢痕疙瘩组织中,血管内皮细胞阳性着色明显降低,但组织内部存在强弱的区别。在真皮乳头下血管丛区域,毛细血管可见弱阳性着色;但在瘢痕疙瘩组织深部,血管阳性着色少见。二、体外验证PD-

关键词：瘢痕疙瘩 PD-L1 血管内皮细胞 T细胞

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LL-37生物功能化TiO2纳米管对牙龈成纤维细胞行为的影响及抗菌性能研究

LL-37生物功能化TiO2纳米管对牙龈成纤维细胞行为的影响及抗菌性...

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作者：李毅中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

随着医学技术的不断发展,种植修复逐渐成为缺牙患者首选的修复方式。钛种植体植入后,其与口腔软硬组织之间能否形成稳定结合是保证种植修复成功的关键。其中,牙龈与种植体颈部基台形成的复合体结构暴露于复杂的口腔有菌环境中,是钛种植... 详细信息

随着医学技术的不断发展,种植修复逐渐成为缺牙患者首选的修复方式。钛种植体植入后,其与口腔软硬组织之间能否形成稳定结合是保证种植修复成功的关键。其中,牙龈与种植体颈部基台形成的复合体结构暴露于复杂的口腔有菌环境中,是钛种植体生物表界面的首道屏障结构,对植体骨结合的长期稳定性至关重要。因此,增强“牙龈-基台复合体”表界面生物活性,同时赋予其较强的抗菌性能对促进种植体颈部软组织封闭效果,提升种植成功率具有重要意义。抗菌肽(AMPs)是生物体内特定基因编码的一类具有广谱抗菌活性的小分子蛋白。与抗生素、银离子等传统抗菌剂相比,抗菌肽具有低耐药、低致敏、低毒性等优点,应用前景广泛。其中,LL-37作为唯一人源性Cathelicidin类抗菌肽,除具有抗菌活性外,其在细胞募集、免疫调节、组织愈合等方面也具有重要调节作用,有望成为种植体基台表面功能修饰的理想选择。课题组前期研究中,通过阳极氧化法在钛表面构建出结构规整、高度有序的纳米管阵列,其顶端开口底端封闭的蜂窝形貌,可充当药物的储库,为LL-37加载提供良好的平台。因此,本研究拟借助多巴胺作为中间涂层构建LL-37生物功能化TiO纳米管材料,并探究该材料对人牙龈成纤维细胞(HGFs)黏附、迁移和增殖等生物学行为的影响,同时验证其对牙龈卟啉单胞菌(Pg)和变形链球菌(Sm)的抑制作用,以期为种植体颈部材料的优化设计提供新的思路。【目的】借助多巴胺作为中间涂层,将抗菌肽LL-37加载至具有纳米管阵列的光滑钛表面,构建LL-37生物功能化TiO纳米管钛材;探究LL-37生物功能化TiO纳米管钛材对HGFs黏附、迁移、增殖等生物学行为的影响;验证LL-37生物功能化TiO纳米管钛材对牙龈卟啉单胞菌及变形链球菌的抗菌作用。【方法】第一部分LL-37生物功能化TiO纳米管材料的制备和表征采用阳极氧化法在光滑钛(Polished Ti,P)表面构建TiO纳米管阵列(Nanotube,NT),之后借助多巴胺作为中间涂层(dopamine@NT,PD@NT)在TiO纳米管表面负载不同浓度(25μg/m L和100μg/m L)的抗菌肽LL-37,分别标记为LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)。利用场发射扫描电镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、X射线光电子能谱仪(XPS)及接触角测量仪等设备对各组钛试样进行表征,观察其表面形貌、粗糙度、元素组成及亲水性能。通过FITC荧光标记实验及酶标仪检测明确抗菌肽LL-37的加载水平及释放特点。第二部分LL-37生物功能化TiO纳米管材料对HGFs生物学行为的影响将HGFs接种于各组钛试样表面,利用细胞免疫荧光染色、激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)及SEM观察HGFs的黏附数量及生长形态;通过划痕实验和Transwell迁移实验观察HGFs的迁移变化;借助MTT检测观察HGFs细胞增殖水平,以充分评价LL-37-PD@NT材料的生物活性。第三部分LL-37生物功能化TiO纳米管材料的抗菌性能检测将牙龈卟啉单胞菌(Pg)和变形链球菌(Sm)分别接种于各组钛试样表面,利用平板涂布检测细菌黏附数量,通过SEM观察细菌形态及菌体间连接水平,借助细菌活死染色检测细菌活力并计算活/死菌比例,以充分评价LL-37-PD@NT材料的抗菌性能。【结果】第一部分LL-37生物功能化TiO纳米管材料的制备和表征1、SEM观察可见P组材料表面光滑无划痕,NT组材料表面有均匀排列的管径约为80-100 nm的管状结构,PD@NT组材料表面也有同NT组表面的管状结构,但管壁变厚,管径显著变小,LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)组材料表面形貌与PD@NT组无显著差异。2、各组试样接触角测量结果:P组>LL-37-PD@NT组>PD@NT组>NT组;各组试样AFM测量结果:NT组、PD@NT组、LL-37PD@NT组的表面粗糙度均大于P组。3、XPS结果中PD@NT组Ti峰消失,N峰、C-N峰出现均提示多巴胺涂层的成功构建;LL-37PD@NT组N峰增强,N元素含量升高,C-N、C=O峰增强均提示LL-37成功加载4、荧光标记抗菌肽后加载试验结果表示LL-37-PD@NT(100)组试样表面荧光强度较LL-37-PD@NT(25)组升高,提示随着浸泡浓度的增加,试样表面抗菌肽负载量增加。5、体外释放实验结果显示,抗菌肽表现为早期的突释(1-24 h)和长期(2-8 d)的缓释过程,LL-37-PD@NT(25)和LL-37-PD@NT(100)组试样表面抗菌肽累积释放量在24 h时可分别达到达到3.6μg和8.8μg,并且在8 d后仍可检测到抗菌肽的释放。第二部分LL-37生物功能化TiO纳米管材料对HGFs生物学行为的影响1、利用细胞免疫荧

关键词：牙龈-基台复合体抗菌肽 LL-37 TiO2纳米管牙龈成纤维细胞抗菌性

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抗生素骨水泥通过调控Notch信号通路对糖尿病足溃疡血管新生的作用及初步机制探讨

抗生素骨水泥通过调控Notch信号通路对糖尿病足溃疡血管新生的作...

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作者：曹涛中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

研究背景包含糖尿病足在内的糖尿病创面是糖尿病患者的常见并发症,其愈合困难、致残率高,治疗效果欠佳,已成为世界性难题。糖尿病创面的发生发展机制及如何促进其愈合是创面修复领域备受关注的热点科学问题。由于长期高血糖引发末梢神... 详细信息

研究背景包含糖尿病足在内的糖尿病创面是糖尿病患者的常见并发症,其愈合困难、致残率高,治疗效果欠佳,已成为世界性难题。糖尿病创面的发生发展机制及如何促进其愈合是创面修复领域备受关注的热点科学问题。由于长期高血糖引发末梢神经变性、外周小血管闭塞,血管内皮细胞增生受限,创面血管新生受阻,缺血缺氧损伤加重,加之神经营养因子缺失,均成为制约糖尿病创面愈合的关键难题。由此研究人员通过在糖尿病创面添加各类生长因子,移植各类细胞、细胞外囊泡或构造各类新型创面外用敷料等生物学方法,希望改善糖尿病创面血管新生微环境以促进血管新生,但效果尚不够理想。目前研究表明,抗生素骨水泥在大段骨缺损及骨髓炎患者治疗过程中,可以通过产生具有高度血管化的膜性组织即Masquelet诱导膜,影响骨折愈合的多个阶段,从而促进局部血管再生,加速愈合。针对如何有效持久地促进糖尿病创面血管新生并加速创面愈合这一难题,课题组尝试采取清创+抗生素骨水泥覆盖+植皮封闭这一序贯治疗策略,并对清创前及骨水泥去除后的创面血运进行激光多普勒血流检测,发现创面血运明显改善。在糖尿病足溃疡(Diabetic foot ulcer,DFU)创面中应用抗生素骨水泥覆盖是否也产生了相似的“血管化组织”,从而改善创面血运加速愈合,目前尚不清楚。本课题拟通过组织形态学、细胞功能、分子生物学等手段,从前瞻性临床试验、模型动物、细胞学研究三个层面系统研究抗生素骨水泥对糖尿病创面血管新生的作用并进行初步机制探索,为临床治疗糖尿病创面提供新的治疗策略及理论依据。研究目的本研究拟基于前瞻性临床试验、背部全层皮肤缺损的糖尿病大鼠模型、及高糖培养的HUVEC细胞三个层面探索:1、抗生素骨水泥在DFU创面治疗中改善血运、促进愈合的作用;2、抗生素骨水泥在糖尿病大鼠的背部全层皮肤全层缺损创面模型中促进血管新生的作用及其发挥该作用的具体成分探索;3、抗生素骨水泥在改善高糖对HUVEC细胞的抑制的作用及其促进DFU血管新生的初步机制探索。通过本研究,验证抗生素骨水泥对DFU创面血管新生的促进作用,研究其发挥作用的具体成分并初步对其机制进行探索,为临床治疗糖尿病创面提供新的治疗策略及理论依据。研究方法1.采用前瞻性随机对照研究方法。2020年8月～2023年1月,空军军医大学第一附属医院收治32例符合入选标准的糖尿病足溃疡患者。按区组随机化法,将患者分为2组,每组16例。经血管超声检查,确保每例患者膝下主要动脉至少1支通畅的情况下,彻底清创后行持续负压封闭引流3～5 d,此后抗生素骨水泥组创面采用载庆大霉素骨水泥、对照组创面采用磺胺嘧啶银乳膏换药治疗,换药治疗3周后,均取同侧大腿外侧或头皮适当大小的刃厚皮覆盖创面。清创术前与换药治疗3周后均用激光多普勒血流仪检测创面组织及正常皮肤组织血流强度,计算创面相对血流强度百分比及血流强度改变率。换药治疗3周后均取创缘组织,行免疫组织化学染色观测创缘组织中CD31阳性新生血管数,观察创缘组织中CD31、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)双阳性细胞所围成的血管形态,评估创缘组织增生情况(以Ki67阳性细胞比表示),采用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测血管内皮细胞生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2)蛋白表达,Notch信号通路Notch1、DLL4蛋白表达。观察植皮术后3～5 d皮片成活情况,统计创面完全愈合时间。2.采用实验研究方法。取24只8周龄SPF级雄性SD大鼠,制作糖尿病模型后,在其背部制作全层皮肤缺损创面。按照随机数字表法将大鼠分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、抗生素组(庆大霉素)、单纯骨水泥组和抗生素骨水泥组(载庆大霉素骨水泥),每组3只,分别作相应处理。伤后第0、3、7、10、14 d,观察创面愈合情况并计算其愈合率,使用多普勒血流仪检测创基血流强度,计算并比较伤后第14 d各组创基相对血流强度百分比。伤后10 d,采用免疫荧光法检测创面中Ki67阳性细胞数,采用免疫组织化学法检测创面中CD31阳性染色且成管样结构的新生血管数;伤后14d采用H&E染色检测创面皮肤组织缺损长度,采用免疫荧光法双染色法检测创面中I型胶原及Ⅲ型胶原的含量及分布,WB检测创面中VEGFR2蛋白表达,Notch信号通路中Notch1、DLL4蛋白表达。各组样本数均为3。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及Tukey检验。3.采用实验研究方法。取第3～5代对数生长期HUVEC细胞进行实验。首先将HUVEC细胞接种于自制单纯骨水泥及抗生素骨水泥薄片上,使用扫描电镜观察细胞在骨水泥表面贴壁生长状况;取4批细胞,各批次细胞均分为常规培养正常对照组、高糖培养组(葡萄

关键词：糖尿病足溃疡抗生素骨水泥血管新生创面愈合 Notch VEGFR2

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消化道肿瘤手术患者术中低体温的危险因素分析及其与术后并发症的相关性研究

消化道肿瘤手术患者术中低体温的危险因素分析及其与术后并发症的...

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作者：张震中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

第一部分:不同定义的术中低体温发生率及危险因素分析目的:探讨不同定义的术中低体温的发生率及其危险因素。方法:选择2017年5月至2020年5月择期在全身麻醉下行消化道肿瘤手术的6156例患者,收集患者的一般资料及围术期相关资料。术中每5... 详细信息

第一部分:不同定义的术中低体温发生率及危险因素分析目的:探讨不同定义的术中低体温的发生率及其危险因素。方法:选择2017年5月至2020年5月择期在全身麻醉下行消化道肿瘤手术的6156例患者,收集患者的一般资料及围术期相关资料。术中每5 min记录一次的鼻咽温度或膀胱温度为患者的核心体温,温度0.05)。基于时间加权平均温度(P>0.05)、术中最终温度(P>0.05)和术中最低温度(P>0.05)定义的术中低体温均与消化道肿瘤患者的术后严重并发症无显著相关性。其他影响术后严重并发症的因素包括:ASA分级、术中输血和术中输液量。2.术中低体温与术后凝血功能的关系:经PSM匹配后的研究队列为:a.时间加权平均温度(N=1046):正常体温组vs.低体温组=523:523;b.术中最终温度(N=1200):正常体温组vs.低体温组=600:600;c.术中最低温度(N=1736):正常体温组vs.低体温组=868:868。两组间的混杂因素均无显著的统计学差异(P>0.05)。基于时间加权平均温度定义的术中低体温和术后凝血功能障碍密切相关(OR=1.555,95%CI:1.193-2.026,P=0.001),而基于术中最终温度和术中最低温度定义的术中低体温

关键词：术中低体温时间加权平均温度消化道肿瘤危险因素凝血功能障碍并发症

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基于不同杨氏模量的聚氨酯基防结冰涂层的制备及研究

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高分子学报 2024年第8期55卷 1033-1043页

作者：宋伟李凤英张定军陈磊周惠娣陈建敏兰州理工大学省部共建有色金属先进加工与再利用国家重点实验室兰州730050 中国科学院兰州化学物理研究所固体润滑国家重点实验室兰州730000 中国科学院大学材料与光电研究中心北京100049

以4,4'-二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、聚四氢呋喃醚二醇(PTMEG)为原料,通过改变R值,获得了不同杨氏模量(0.72~5.95 MPa)的单组份湿固化型聚氨酯弹性体(PUE)涂层,用不同分子量聚醚二元醇进行对比,探究涂层杨氏模量对冰黏附强度的影响.结... 详细信息

以4,4'-二苯基甲烷二异氰酸酯(MDI)、聚四氢呋喃醚二醇(PTMEG)为原料,通过改变R值,获得了不同杨氏模量(0.72~5.95 MPa)的单组份湿固化型聚氨酯弹性体(PUE)涂层,用不同分子量聚醚二元醇进行对比,探究涂层杨氏模量对冰黏附强度的影响.结果发现,较高分子量聚醚二元醇系列具有较低冰黏附强度(平均57.71 kPa),随涂层杨氏模量增大,对应冰黏附强度呈先增大后减小趋势.分析表明,低杨氏模量涂层(如PTMEG-1000作软段时,1.05~2.96 MPa)在水结冰膨胀过程中,涂层表面易产生变形,形成凹凸不平结构,提供更多黏附点供冰结构黏附,使得冰黏附强度与表面能密切相关,造成冰黏附强度增大的可能性.而较高杨氏模量涂层(如PTMEG-1000作软段时,2.96~5.95 MPa)存在冰黏附强度的降低区间不符合杨氏模量与冰黏附强度的正相关关系,这是因为受低温回弹力作用,冰与涂层产生弹性失配,诱发产生微裂纹使得冰-涂层界面空化,造成冰黏附强度减小的可能性.因此,合理利用涂层杨氏模量对冰黏附强度的影响机制可以有效降低冰黏附强度.

关键词：聚氨酯弹性体杨氏模量冰黏附强度机械性能

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外泌体miR-99a-5p激活成纤维细胞促进结直肠癌转移的功能和机制研究

外泌体miR-99a-5p激活成纤维细胞促进结直肠癌转移的功能和机制研...

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作者：惠娟中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

【背景】结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化系统的常见恶性肿瘤,给人类的健康造成了巨大威胁。转移是CRC患者发生死亡的主要原因。因此,探究肿瘤转移进程的关键分子事件及机制,为转移性CRC提供新的治疗靶点和策略迫在眉睫。成纤维... 详细信息

【背景】结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化系统的常见恶性肿瘤,给人类的健康造成了巨大威胁。转移是CRC患者发生死亡的主要原因。因此,探究肿瘤转移进程的关键分子事件及机制,为转移性CRC提供新的治疗靶点和策略迫在眉睫。成纤维细胞是肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中构成基质的主要细胞类型,能够被激活为具有促癌特性的癌症相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs),CAFs具有强大的分泌及免疫调节能力,可通过多种机制介导肿瘤的发生发展。外泌体含有多种生物活性分子,是细胞间信息交流的通讯者,参与了肿瘤转移的多个步骤。Micro RNAs(miRNAs)是微小单链非编码RNAs,长度大约为18-25个核苷酸,能够调控多数基因的翻译过程,在肿瘤转移进程中发挥着至关重要的作用。本研究基于一对同源的、具有高低转移潜能的结肠癌细胞系展开研究,通过外泌体RNA-seq筛选,聚焦于外泌体miR-99a-5p,阐明其在调节人原代正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)激活后促进CRC转移中的功能及具体作用机制,为揭示TME中外泌体miR-99a-5p在CRC转移中的关键作用提供了重要的理论依据。【目的】1.筛选并明确高低转移潜能结肠癌细胞来源的外泌体差异表达miRNAs。2.明确CRC微环境中外泌体miR-99a-5p调控NFs的功能和机制。3.明确外泌体miR-99a-5p激活的NFs在CRC转移中的作用和机制。【方法】1.超速离心法提取KM12C和KM12SM来源的外泌体;TEM(transmission electron microscope)、NTA(nanosight tracking analysis)及western blot对外泌体进行鉴定;通过RNA-seq筛选外泌体中差异表达miRNAs;q PCR被用于差异miRNAs表达的验证。***迁移实验被用于检测对照组和实验组的NFs迁移能力改变情况;q PCR和western blot被用于检测对照组和实验组的NFs中成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activating protein,FAP)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,αSMA)的表达情况。***数据库预测miR-99a-5p可能调控的靶基因;GO和KEGG功能富集分析候选靶基因在CRC中可能涉及的生物学功能;q PCR、western blot和荧光素酶基因报告实验进一步筛选和验证miR-99a-5p对靶基因的调控;TIMER数据库分析CRC微环境中CAFs的浸润丰度和炎性细胞因子表达水平之间的相关性;q PCR检测转染miR-99a-5p mimic的NFs中炎性细胞因子的表达情况。***迁移实验验证miR-99a-5p激活的NFs对CRC细胞迁移能力的影响,GO、GSEA富集分析和免疫浸润相关性分析预测miR-99a-5p激活的NFs影响CRC细胞迁移能力的可能机制,q PCR进一步验证。【结果】***观察到超速离心法提取的外泌体呈圆盘形;NTA结果表明KM12C来源的外泌体大小的中值为141.7 nm,KM12SM来源的外泌体大小的中值为140.4 nm;western blot证实与KM12C和KM12SM细胞内的蛋白表达相比,其分泌的外泌体能够表达TSG101和CD63,不表达Calnexin。RNA-seq结果表明,KM12C和KM12SM细胞分泌的外泌体中共有290个差异表达miRNAs,其中P2的miRNAs有24个。结合课题组前期关于KM12C和KM12SM细胞内的miRNAs测序结果,我们用q PCR验证了三次生物学重复结果一致性较好且差异表达显著的6个miRNAs的表达水平,结果表明miR-99a-5p的差异表达最显著,在高转移潜能细胞KM12SM分泌的外泌体中表达升高。***迁移实验、q PCR和western blot结果分别表明,与对照组相比,KM12SM来源外泌体孵育的NFs表现出迁移能力增强,FAP和αSMA的表达水平均显著增加的特性。此外,transwell迁移实验、q PCR和western blot结果也分别表明转染miR-99a-5p mimic的NFs迁移能力、FAP和αSMA的表达水平显著增加。Transwell迁移实验结果也提示转染miR-99a-5p inhibitor的KM12SM分泌的外泌体孵育的NFs迁移能力受到显著抑制。***数据库预测miR-99a-5p的可能调控靶基因,初步筛选出6个符合预期的可能受mi

关键词： miR-99a-5p NLRP2 结直肠癌成纤维细胞转移炎症外泌体

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近红外荧光染料ICG与MHI-148肝癌显像效果的差异性评估及机制研究

近红外荧光染料ICG与MHI-148肝癌显像效果的差异性评估及机制研究

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作者：段彦亨中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

【研究背景】肝细胞癌(HCC)的治疗是以手术为主的综合治疗,肝切除术需要切除原发性肿瘤病灶并最大程度地保留正常肝组织。然而在实际手术操作中,肉眼和触诊难以精准识别肿瘤组织及其边界,常导致切除不足或过度切除。近红外荧光(NIRF)成... 详细信息

【研究背景】肝细胞癌(HCC)的治疗是以手术为主的综合治疗,肝切除术需要切除原发性肿瘤病灶并最大程度地保留正常肝组织。然而在实际手术操作中,肉眼和触诊难以精准识别肿瘤组织及其边界,常导致切除不足或过度切除。近红外荧光(NIRF)成像是一种实时、低成本、无创、高灵敏的成像技术,广泛应用于引导手术切除肿瘤。吲哚菁绿(ICG)是最早应用于临床的NIRF染料,但经长期临床实践显露出其局限性,无法满足临床需求。因此,有必要开发新型近红外荧光染料,以解决ICG现有不足,提高肝癌可视化效果。七甲川花菁类染料MHI-148是一种近期报道可特异性聚集于肿瘤组织中的新型染料,其优异的肿瘤靶向显像效果有望成为指导肝癌切除的新型显像剂。对于染料聚集于肝癌组织的机制,目前认为与肝癌细胞膜上参与药物转运的蛋白密切相关。转运蛋白可分为物质摄取和外排两类,参与物质摄入的主要是由有机阴离子转运肽(OATP)介导的,而肝癌细胞主要通过三磷酸腺苷结合盒蛋白(ABC)将物质排出细胞。据报道,OATP2B1和ABCG2两种分子在多种药物及染料的代谢中发挥重要作用。然而这两种分子是否调控MHI-148在肝癌细胞中的代谢以及是否影响MHI-148的肝癌显像效果目前尚不明确。【研究目的】比较MHI-148与传统近红外荧光染料ICG的成像效果,探索MHI-148荧光染料成像的具体参数,解析MHI-148在肿瘤组织中聚集的机制,突破现有NIRF染料在实时显像技术应用中的瓶颈,优化肝癌切除术中实时显像技术。【研究方法】1、利用野生型C57小鼠,尾静脉注射相同剂量的MHI-148以及ICG两种染料,监测30天内小鼠的体重变化,同时在第7天和第30天进行小鼠眼球静脉采血检测ALT、AST、CK、CREA等生化指标,以及解剖小鼠获取重要组织器官进行HE染色观察形态变化,评估两种染料的生物相容性。2、测定近红外荧光染料MHI-148与ICG用于人肝癌细胞系SNU-739、SNU-368以及人正常肝细胞THLE-2的代谢特征,比较两种染料用于细胞荧光成像的参数。通过在裸鼠皮下接种肝癌细胞系SNU-739建立小鼠皮下CDX模型,尾静脉注射ICG和MHI-148染料,在不同时间节点测定染料的荧光强度,确定两种染料在体内的代谢过程及荧光强度的变化趋势。观察肿瘤组织对两种荧光染料的聚集情况,并比较肝癌组织与正常组织的荧光强度,明确MHI-148染料在肿瘤组织中的特异性聚集作用及相对ICG染料的优缺点。3、从公共数据库TCGA、GEO等获取多组肝癌转录组数据,结合本院的肝癌组织样本,评估ABCG2和OATP2B1两个分子在肿瘤组织与癌旁组织中的表达水平。在人肝癌细胞系SNU-739细胞中构建ABCG2和OATP2B1的过表达和干涉的稳转细胞系。用MHI-148对构建的稳转细胞系进行细胞成像,比较荧光强度的变化;通过在裸鼠皮下接种ABCG2和OATP2B1的稳定过表达和干涉肝癌细胞系建立小鼠皮下CDX模型,成瘤后使用MHI-148尾静脉注射后进行活体成像,比较ABCG2和OATP2B1这两种分子对于荧光强度的影响。【研究结果】1、ICG与MHI-148两种染料尾静脉注射进入小鼠体内后,1个月内小鼠体重增长与对照组相比无统计学差异;血清的生化指标以及组织切片HE染色无明显异常。2、MHI-148染料在肝癌细胞系SNU-739、SNU-368中的荧光强度以及显像时间显著高于ICG,并且在60分钟时荧光强度达到最高,随后缓慢降低。而ICG染料在正常人肝细胞THLE-2中的荧光强度高于MHI-148,其荧光强度在30分钟时达到最高值,然后180分钟时基本完全被排出细胞。皮下接种肝癌细胞系SNU-739的裸鼠尾静脉注射ICG后,荧光信号首先出现在肝脏区域,然后转移到下腹部,皮下移植瘤区域内没有荧光信号;当裸鼠尾静脉注射MHI-148染料1小时后,皮下移植瘤就可显示出较强荧光,并且荧光信号可持续24小时以上。处死裸鼠后取出心、肺、肝、肾、脾、肠道以及肿瘤组织后进行活体成像,发现ICG被肝脏特异性摄取后通过胆汁排入肠道随后被排出体外,肿瘤组织没有ICG荧光信号。而MHI-148特异性地聚集于肿瘤组织中。3、TCGA和GEO转录组数据提示OATP2B1分子在肿瘤组织中高表达,ABCG2分子在肿瘤组织中低表达。免疫组化结果进一步证实在肝癌组织中OATP2B1分子表达显著升高而ABCG2分子表达显著降低。体内、体外实验揭示过表达OATB2B1及干涉ABCG2促进肝癌细胞对MHI-148染料的摄取,反之,干涉OATP2B1以及过表达ABCG2后抑制肝癌细胞中MHI-148染料的积累。【研究结论】ICG和MHI-148染料的生物相容性都比较好,可以用于体内成像。ICG被正常肝细胞特异性摄取后,通过胆汁将染料排到肠道后排出体外

关键词：肝癌切除术 ICG MHI-148 OATP2B1 ABCG2

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