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新型Na^(+)/H^(+)逆向转运蛋白UPF0118的Na^(+)结合鉴定

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东北农业大学学报 2024年第3期55卷 62-70页

作者：李红洋华贝杰姜巨全东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030

UPF0118蛋白是一种新型Na^(+)(Li^(+))/H^(+)逆向转运蛋白,属于AI-2E超家族,目前已被划分至Na^(+)/H^(+)逆向转运蛋白亚家族,但无直接证据表明该蛋白可与Na+产生相互作用。为鉴定UPF0118蛋白是否具有Na^(+)结合功能,利用PCR技术扩增upf0... 详细信息

UPF0118蛋白是一种新型Na^(+)(Li^(+))/H^(+)逆向转运蛋白,属于AI-2E超家族,目前已被划分至Na^(+)/H^(+)逆向转运蛋白亚家族,但无直接证据表明该蛋白可与Na+产生相互作用。为鉴定UPF0118蛋白是否具有Na^(+)结合功能,利用PCR技术扩增upf0118基因编码序列,通过Eco RⅠ和PstⅠ酶切位点构建至原核表达载体p ETDuet-1,转化至E. coli BL21*(DE3),对诱导后大量表达的蛋白进行Ni^(2+)亲和层析和凝胶过滤层析,利用等温滴定量热技术对纯化蛋白进行滴定。结果表明,在pH 5.5条件下,Na^(+)滴入导致蛋白溶液产生明显放热现象。在pH 5.5条件下该蛋白具有Na^(+)结合功能,证明该蛋白Na+结合功能为其功能单元与分子机制的研究奠定基础。

关键词： UPF0118 Na^(+)/H^(+)逆向转运蛋白等温滴定量热法蛋白纯化

基于转录组分析揭示醛脱氢酶Ald在谷氨酸棒杆菌生产L-高丝氨酸的作用

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食品与发酵工业 2024年

作者：祁玉婷钟兆月张霞徐宁魏亮刘君姜巨全邵丽中国科学院天津工业生物技术研究所东北农业大学生命科学学院

玉米浆是玉米湿磨工业的主要副产品，在工业发酵中被广泛用作经济有效的营养源。然而，玉米浆影响发酵性能的潜在机制仍不清楚。该研究发现添加不同浓度的玉米浆可以促进谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）发酵生产L-高丝氨酸... 详细信息

玉米浆是玉米湿磨工业的主要副产品，在工业发酵中被广泛用作经济有效的营养源。然而，玉米浆影响发酵性能的潜在机制仍不清楚。该研究发现添加不同浓度的玉米浆可以促进谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）发酵生产L-高丝氨酸。为探究添加玉米浆对L-高丝氨酸合成途径相关的基因与代谢通路的影响，利用转录组学分析并挖掘其潜在的关键基因，最终通过定量逆转录聚合酶链反应进行验证。结果表明，编码醛脱氢酶Ald的cg3096在玉米浆高效促进L-高丝氨酸发酵生产中发挥着主要作用，这可能部分归因于细胞内NADPH供应水平的提高。此外，过表达cg3096可以显著提高底物转运（amt、cg0922、urtABC）和利用基因（cg0535-cg0536）的表达水平。综上所述，该研究结果揭示了cg3096在L-高丝氨酸高水平生产中的基本功能和潜在机制，为玉米浆在发酵过程中高效利用提供了新的视角。

关键词：谷氨酸棒杆菌玉米浆 L-高丝氨酸转录组分析 cg3096 发酵生产

靶向敲除棉花Gh AGL16高效sg RNA的筛选

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中国农业科学 2024年第6期57卷 1023-1033页

作者：雷建峰尤扬子张锦恩代培红于莉杜正阳李月刘晓东新疆农业大学农学院/棉花教育部工程研究中心新疆农业大学生命科学学院

【目的】AGL16是棉花MADS-box基因家族中一个重要的转录负调控因子，在抵御干旱和盐胁迫过程中发挥着重要作用。利用病毒介导的基因编辑技术（virus-induced gene editing,VIGE）筛选靶向敲除棉花GhAGL16的sgRNAs，并验证这些sgRNAs的... 详细信息

【目的】AGL16是棉花MADS-box基因家族中一个重要的转录负调控因子，在抵御干旱和盐胁迫过程中发挥着重要作用。利用病毒介导的基因编辑技术（virus-induced gene editing,VIGE）筛选靶向敲除棉花GhAGL16的sgRNAs，并验证这些sgRNAs的特异性，为定向创制棉花agl16突变体奠定重要基础。【方法】根据在棉花YZ-1中A亚组和D亚组上实际克隆GhAGL16的基因组序列，预测了3个能靶向敲除GhAGL16的sgRNAs；基于棉花叶皱缩病毒（cotton leaf crumple virus,CLCrV）介导的VIGE系统，构建3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体；利用qPCR检测Cas9超表达（Cas9over-expression,Cas9-OE）植株中Cas9的表达量，确定Cas9是否稳定遗传表达；将3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体分别转化Cas9-OE棉花子叶，并通过PCR/RE方法检测3个靶点的突变情况；利用生物信息学方法分析3个GhAGL16-sgRNAs的二级结构；对突变植株进行Hi-TOM高通量测序，明确基因编辑效率。同时，对转化GhAGL16-sgRNA2的突变植株进行脱靶率鉴定，检测基因编辑的特异性。【结果】成功构建了3个能同时靶向敲除GhAGL16-A亚组和GhAGL16-D亚组序列的sgRNAs。对不同Cas9-OE植株中Cas9表达量检测结果表明，Cas9在不同Cas9-OE棉株中稳定表达。用3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体转化Cas9-OE棉花子叶，PCR/RE突变检测结果表明，GhAGL16-sgRNA2可有效用于GhAGL16的靶向敲除，在棉花A亚组和D亚组靶位点上出现了不同碱基缺失的突变类型，而GhAGL16-sgRNA1和GhAGL16-sgRNA3是2个无效sgRNA。3个GhAGL16-sgRNAs的二级结构分析结果表明，GhAGL16-sgRNA1和GhAGL16-sgRNA3可能存在引导序列容易与其他序列发生配对并且不易解链的现象，干扰了引导序列对目标位点的识别，导致sgRNA无效。进一步量化GhAGL16-sgRNA2对GhAGL16的编辑效率，对每一株转化CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA2的Cas9-OE植株突变检测结果表明，在转化的9株Cas9-OE植株中有6株发生了突变，突变效率为66.67%。此外，Hi-TOM高通量测序结果表明，GhAGL16-sgRNA2对GhAGL16的编辑效率为13.69%—54.42%。脱靶率鉴定结果表明，预测的4个潜在脱靶位点都没有发现脱靶现象，说明GhAGL16-sgRNA2不仅具有高效的基因编辑效率，而且具有专一的基因编辑特异性。【结论】利用CLCrV介导的VIGE系统转化Cas9-OE棉花筛选获得1个能高效敲除GhAGL16的sgRNA，为定向创制棉花agl16突变体提供了理想的sgRNA。

关键词：棉花 GhAGL16 sgRNA 突变体 VIGE 脱靶

代谢改造谷氨酸棒杆菌高效发酵生产L-高丝氨酸

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食品与发酵工业 2024年

作者：钟兆月马振平祁玉婷张霞徐宁刘君邵丽姜巨全东北农业大学生命科学学院中国科学院天津工业生物技术研究所

L-高丝氨酸是一种非蛋白质手性氨基酸，在食品、饲料、医药和农业等领域中具有广阔的应用潜力。但目前改造食品安全微生物谷氨酸棒杆菌发酵生产L-高丝氨酸的实例仍然较少。该研究以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌，通过敲除thrB、alaT和dd... 详细信息

L-高丝氨酸是一种非蛋白质手性氨基酸，在食品、饲料、医药和农业等领域中具有广阔的应用潜力。但目前改造食品安全微生物谷氨酸棒杆菌发酵生产L-高丝氨酸的实例仍然较少。该研究以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌，通过敲除thrB、alaT和ddh弱化L-高丝氨酸竞争途径，并过表达lysC、hom和ppc强化L-高丝氨酸合成代谢流，实现了L-高丝氨酸的有效积累。随后，通过增强胞内NADPH供应以及促进L-高丝氨酸外排效率，进一步提升L-高丝氨酸生产。最后，通过改造和重塑葡萄糖摄取和利用系统，在谷氨酸棒杆菌中实现了L-高丝氨酸的高效合成。最优基因工程菌在摇瓶条件下可积累9.29 g/L L-高丝氨酸，在5 L发酵罐条件下可积累77.53 g/L L-高丝氨酸，生产强度达到1.29 g/L/h，是已报道谷氨酸棒杆菌生产L-高丝氨酸的最高水平。该研究将为构建L-高丝氨酸高产菌株提供一定参考依据。

关键词： L-高丝氨酸谷氨酸棒杆菌代谢工程细胞工厂发酵

谷氨酸棒杆菌中L-高丝氨酸转运蛋白的挖掘及功能分析

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食品与发酵工业 2024年

作者：张霞祁玉婷钟兆月徐宁刘君姜巨全邵丽东北农业大学生命科学学院中国科学院天津工业生物技术研究所

L-高丝氨酸是一种非必需手性氨基酸，在农业、化工、生物医药等领域具有重要的用途。近年来，利用微生物发酵法生产L-高丝氨酸越来越受到人们的关注。氨基酸转运蛋白不仅可以降低反馈抑制和细胞毒性，还能提高氨基酸产量，已成为代谢工... 详细信息

L-高丝氨酸是一种非必需手性氨基酸，在农业、化工、生物医药等领域具有重要的用途。近年来，利用微生物发酵法生产L-高丝氨酸越来越受到人们的关注。氨基酸转运蛋白不仅可以降低反馈抑制和细胞毒性，还能提高氨基酸产量，已成为代谢工程改造的重要靶点。目前，谷氨酸棒杆菌中L-高丝氨酸转运蛋白仍然未知。该研究通过生物信息学分析，从谷氨酸棒杆菌中筛选出10个L-高丝氨酸转运蛋白候选基因，经过体外和体内L-高丝氨酸耐受性生长实验，结果显示在大肠杆菌三重高丝氨酸转运缺陷突变体中，异源过表达brnFE、azlCD和lysE基因，能显著恢复大肠杆菌突变体的生长缺陷，而在谷氨酸棒杆菌体内，只有lysE敲除菌较对照生物量下降16%，推测在体内LysE蛋白具有更重要的高丝氨酸外排能力。进一步对LysE的外排活性进行分析，发现lysE敲除菌的外排能力降低了18%。最后，在高丝氨酸底盘菌中，评估了敲除或过表达lysE基因对L-高丝氨酸产量的影响，结果发现lysE基因缺失导致L-高丝氨酸的产量降低了65%，而过表达lysE使L-高丝氨酸产量提高了22%。综上所述，谷氨酸棒杆菌LysE蛋白具有转运L-高丝氨酸的能力，相关结果为开发高效的L-高丝氨酸细胞工厂提供了新靶点。

关键词： L-高丝氨酸外排蛋白谷氨酸棒杆菌序列比对 LysE

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植物ABCG转运蛋白功能的研究进展

科学通报 2024年第14期69卷 1866-1880页

作者：孙洁婷敬雪皎赵丹妮潘烨鑫罗启哲向垒莫测辉侯学文华南农业大学生命科学学院光合作用与植物逆境生物学研究中心广州510642 华南农业大学生命科学学院亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室广州510642 暨南大学生命科学技术学院广东省环境污染控制与修复材料工程中心广州510632

高等植物中细胞器及细胞之间是由生物膜分隔开来,但在植物的生理代谢及应对逆境胁迫的过程中,细胞器及细胞之间需要大量的信号与物质的交流.多数情况下,这些跨膜交流由膜上的转运蛋白来执行,其中以ABCG亚家族为代表的ABC转运蛋白家族是... 详细信息

高等植物中细胞器及细胞之间是由生物膜分隔开来,但在植物的生理代谢及应对逆境胁迫的过程中,细胞器及细胞之间需要大量的信号与物质的交流.多数情况下,这些跨膜交流由膜上的转运蛋白来执行,其中以ABCG亚家族为代表的ABC转运蛋白家族是一类介导多种不同类型物质的跨膜转运以完成相应功能的转运蛋白.植物比其他真核生物拥有数量更多的ABCG转运蛋白,表明植物中ABCG转运蛋白具有多样且重要的功能. ABCG转运蛋白不仅参与植物正常生长发育过程中许多物质的转运,执行诸多重要的生理功能,还广泛参与植物对干旱、重金属、温度、渗透和抗生素等非生物胁迫,以及病原菌、害虫和植物化感作用造成的生物胁迫响应过程中的信号与物质转运,说明ABCG既与植物的正常生长发育相关,也在植物抵抗逆境胁迫中发挥重要作用.本文对植物ABCG转运蛋白的结构、分类、生理功能及在抗生物与非生物逆境胁迫的功能进行系统总结,为深入了解植物ABCG转运蛋白多样化功能、研究趋势和利用植物分子育种技术对ABCG基因进行表达调控以获得具有优良特性的植物新种质提供重要借鉴和参考.

关键词： ABCG转运蛋白生理代谢生物胁迫非生物胁迫抗逆作用

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乳酸克鲁维酵母表面展示系统研究

东北农业大学学报 2024年第6期55卷 39-45,57页

作者：姜巨全安吉一商娜刘文婷郑迎迎东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 中国科学院天津工业生物技术研究所天津300308

酵母表面展示技术通过将目标蛋白锚定在细胞表面,广泛应用于疫苗制备、药物筛选、环境治理、菌株筛选等领域。为在乳酸克鲁维酵母中进行医药蛋白的高效生产并开展蛋白质工程研究,利用酿酒酵母来源的Sed1作为锚蛋白,His Tag作为检测靶标... 详细信息

酵母表面展示技术通过将目标蛋白锚定在细胞表面,广泛应用于疫苗制备、药物筛选、环境治理、菌株筛选等领域。为在乳酸克鲁维酵母中进行医药蛋白的高效生产并开展蛋白质工程研究,利用酿酒酵母来源的Sed1作为锚蛋白,His Tag作为检测靶标,在乳酸克鲁维酵母中进行表面展示系统的构建,并利用间接法免疫荧光标记和全细胞流式分析相结合的方法进行高通量表征。激光扫描共聚焦显微镜成像结果进一步证实了人血清白蛋白的成功表达。优化检测条件后,最高展示效率达89.8%。研究首次在乳酸克鲁维酵母中建立并系统优化了酵母表面展示系统,为在乳酸克鲁维酵母中开展高效蛋白质生产和蛋白质工程研究奠定了基础。

关键词：乳酸克鲁维酵母酵母表面展示优化人血清白蛋白

苦荞转录因子基因FtNAC16的克隆、亚细胞定位及表达分析

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农业生物技术学报 2024年第1期32卷 39-49页

作者：柯瑾陈庆富李洪有贵州师范大学生命科学学院/荞麦产业技术研究中心

NAC(petunia NAM and Arabidopsis thaliana ATAF1, ATAF2, and CUC2)转录因子在植物次生壁加厚过程中具有重要调控作用。为探究苦荞(Fagopyrum tataricum)中NAC转录因子在果壳次生壁形成中的功能和分子机制，本研究采用逆转录PCR(rever... 详细信息

NAC(petunia NAM and Arabidopsis thaliana ATAF1, ATAF2, and CUC2)转录因子在植物次生壁加厚过程中具有重要调控作用。为探究苦荞(Fagopyrum tataricum)中NAC转录因子在果壳次生壁形成中的功能和分子机制，本研究采用逆转录PCR(reverse transcription, RT-PCR)技术从苦荞中克隆到1个参与调控苦荞果壳细胞次生壁合成的NAC转录因子基因，命名为FtNAC16。对FtNAC16进行生物信息学、亚细胞定位及基因表达等分析，结果表明，FtNAC16(GenBank No. OR723785)全长CDS序列为1 086 bp，编码361个氨基酸。对FtNAC16进行蛋白多序列比对和系统进化树分析，结果表明，FtNAC16是NAC转录因子家族成员，且与拟南芥(A. thaliana)中调控次生壁加厚的AtNST2(NAC secondary wall thickening)亲缘关系最近。亚细胞定位显示，FtNAC16定位于细胞核。基因表达分析表明，FtNAC16主要在根、茎、花和早期发育的籽粒中高表达。此外，在厚壳苦荞和薄壳苦荞不同发育时期籽粒中的表达分析表明，FtNAC16在厚壳苦荞和薄壳苦荞中具有相似的表达模式，即其表达呈先增后减趋势，且在授粉后7 d籽粒中表达量最高，在籽粒发育早期，FtNAC16在厚壳苦荞中的表达量显著高于薄壳苦荞。进一步表达分析显示，次生壁形成的下游调控基因FtMYB103与纤维素合成酶4(cellulose synthase 4, FtCESA4)和FtCESA8在厚壳苦荞和薄壳苦荞不同发育时期籽粒中的表达与FtNAC16高度正相关。推测FtNAC16可能通过正向调控苦荞次生壁生物合成相关的基因表达，进一步调控苦荞发育过程中不同组织部位尤其是苦荞果壳细胞次生壁的生物合成。本研究为培育高产、优质、适应性强的薄壳苦荞新品种提供优异的基因资源和理论依据。

关键词：苦荞 NAC转录因子 FtNAC16 基因克隆亚细胞定位表达分析

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植物非生物逆境学科发展综述

植物生理学报 2024年第2期60卷 248-270页

作者：赵杨杨永青丁杨林张蘅谢彦杰赵春钊刘林川王鹏程中国科学院分子植物科学卓越创新中心/上海植物逆境生物学研究中心上海200032 中国农业大学生物学院北京100193 上海交通大学生命科学技术学院上海200240 南京农业大学生命科学学院南京210095 华南农业大学林学与风景园林学院广州510642 南方科技大学前沿生物技术研究院广东深圳518055

干旱、盐碱和极端温度等非生物胁迫严重抑制植物的生长和发育,是影响农业生产的主要环境因素。植物应答环境胁迫的分子机制一直是植物生物学的热点研究领域。本文邀请在非生物胁迫应答分子机制领域非常活跃的青年科学家,简要综述相关研... 详细信息

干旱、盐碱和极端温度等非生物胁迫严重抑制植物的生长和发育,是影响农业生产的主要环境因素。植物应答环境胁迫的分子机制一直是植物生物学的热点研究领域。本文邀请在非生物胁迫应答分子机制领域非常活跃的青年科学家,简要综述相关研究领域近年来的主要研究进展,并展望未来这一领域值得深入研究的一些科学问题,希望能引起对这一领域的更多的关注和思考。

关键词：非生物胁迫感受信号转导分子机制