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铜绿假单胞菌对环丙沙星异质性耐药的研究

上海交通大学学报（医学版） 2022年第7期42卷 839-845页

作者：李聪聪姚玉峰张传珍上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系上海200025

目的·探究铜绿假单胞菌对环丙沙星的异质性耐药机制。方法·通过圆盘扩散法对临床分离鉴定的铜绿假单胞菌(n=227)的环丙沙星异质性耐药进行初筛,同时根据抑菌圈直径对这些菌株的耐药性进行划分。通过无抗生素条件下连续传代后测定敏感... 详细信息

目的·探究铜绿假单胞菌对环丙沙星的异质性耐药机制。方法·通过圆盘扩散法对临床分离鉴定的铜绿假单胞菌(n=227)的环丙沙星异质性耐药进行初筛,同时根据抑菌圈直径对这些菌株的耐药性进行划分。通过无抗生素条件下连续传代后测定敏感性来判断异质性耐药菌株的稳定性。利用群体谱型分析法(population analysis profiling,PAP)对初筛结果进行验证。通过全基因测序分析异质性耐药的产生机制,最后测定比较不同突变类型的耐药亚群对不同抗生素敏感性的影响。结果·在圆盘扩散法中,227株临床菌株中有142株(62.6%)对环丙沙星表现为敏感,26株(11.5%)表现为中介,59株(26.0%)表现为耐药。该方法筛选得到18株潜在异质性耐药菌株,其中11株经PAP及稳定性检测后确定为稳定异质性耐药菌。随机挑选的18株初筛鉴定为非异质性耐药的菌株中,有3株经PAP鉴定为异质性耐药菌株。通过全基因组测序发现11株耐药亚群中,有8株发生mexS突变,2株发生gyrA突变;除此之外,基因fleQ、PA2632和PAKAF_02255均分别在1株菌株中发生突变。mexS与gyrA这2类突变型均导致莫西沙星耐药,部分mexS突变株同时对氯霉素与亚胺培南耐药。结论·铜绿假单胞菌对环丙沙星的异质性耐药率为4.8%(11/227)。圆盘扩散法作为铜绿假单胞菌异质性耐药筛选方法灵敏度较低,存在一定假阴性率。mexS突变是耐药亚群中最常见的突变类型,该突变可能通过使外排泵MexEF-OprN过表达来介导对环丙沙星在内的多种抗生素耐药。

关键词：铜绿假单胞菌环丙沙星异质性耐药圆盘扩散法群体谱型分析

耐药肺炎克雷伯菌噬菌体JD902的分离及生物学特性和安全性研究

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上海交通大学学报（医学版） 2019年第12期39卷 1389-1393页

作者：吕霖石鑫郭晓奎秦金红上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系

目的·筛选耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体,并检验其是否符合耐药肺炎克雷伯菌噬菌体库的入库要求。方法·将分离自1例泌尿系统感染患者的1株耐药肺炎克雷伯菌作为宿主菌,从环境污水中进行噬菌体筛选,分离、纯化噬菌体并进行生物学特性的研... 详细信息

目的·筛选耐药肺炎克雷伯菌的噬菌体,并检验其是否符合耐药肺炎克雷伯菌噬菌体库的入库要求。方法·将分离自1例泌尿系统感染患者的1株耐药肺炎克雷伯菌作为宿主菌,从环境污水中进行噬菌体筛选,分离、纯化噬菌体并进行生物学特性的研究及噬菌体基因组测序,并基于全基因组数据分析其使用安全性。结果·分离到1株耐药肺炎克雷伯菌噬菌体,将其命名为JD902,属有尾目,裂解量为88 pfu/cell,在pH值4.0~11.0范围内都能保持较好的活性。基因组分析表明,其不携带抗生素抗性基因和毒力因子基因。结论·JD902为1株烈性噬菌体,体外稳定性及安全性均较高,可以纳入临床治疗使用噬菌体库。

关键词：肺炎克雷伯菌噬菌体抗生素耐药性生物学特性安全性评估

IL-37在类风湿关节炎中作用机制的研究进展

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上海交通大学学报（医学版） 2020年第3期40卷 391-395页

作者：黄润祺王安妮陈广洁上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系上海200025

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性进行性的自身免疫病,其发病机制尚未明确。在RA发生与发展过程中,细胞因子起到了重要作用。近年来针对细胞因子参与自身免疫病的研究发现,作为白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)家族的... 详细信息

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性进行性的自身免疫病,其发病机制尚未明确。在RA发生与发展过程中,细胞因子起到了重要作用。近年来针对细胞因子参与自身免疫病的研究发现,作为白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)家族的新成员,IL-37能够通过胞外与膜受体结合、胞内形成复合物2种方式参与调控信号通路,发挥其抗炎作用。研究表明,IL-37在健康人群体内的表达水平极低,在RA患者体内则过表达;且在RA患者血清中,IL-37水平与肿瘤坏死因子α、IL-6、IL-1α等促炎因子水平,C反应蛋白水平以及疾病活动分数28评分等呈正相关。然而,给予IL-37可以缓解胶原诱导的关节炎小鼠的炎症及病理症状,继而表明IL-37可能以负反馈的方式在RA中起着抑制炎症的作用,具体抗炎机制可能与SMAD家族成员3、核因子κB等信号通路有关。该文就IL-37的结构与表达、受体及其信号通路、功能及其在RA中的作用机制进行综述,为IL-37及RA的后续研究提供思路与参考。

关键词：白细胞介素-37 类风湿关节炎自身免疫病

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细菌体内的蛋白质降解

微生物学报 2015年第5期55卷 521-528页

作者：李淑娴姚玉峰上海交通大学医学院基础医学院免疫学与微生物学系上海200025

为了适应多变的外界环境,细菌利用蛋白降解来清除体内不需要的蛋白质。AAA+蛋白酶降解机制在细菌蛋白质质量控制系统中发挥重要作用,而在放线菌中发现的蛋白酶体揭示了原核生物体内一个崭新的蛋白质降解机制。蛋白酶只识别携带降解决定... 详细信息

为了适应多变的外界环境,细菌利用蛋白降解来清除体内不需要的蛋白质。AAA+蛋白酶降解机制在细菌蛋白质质量控制系统中发挥重要作用,而在放线菌中发现的蛋白酶体揭示了原核生物体内一个崭新的蛋白质降解机制。蛋白酶只识别携带降解决定子的底物,确保了蛋白质降解的特异性,除此之外细菌还通过一些其他方式调控蛋白质的降解与否。随着真核生物体内泛素依赖的蛋白酶体降解途径的发现,蛋白质降解过程参与调控机体生理活动的功能也逐渐为人所知。研究发现,蛋白质降解参与调控细菌的生长、分化,并与细菌的应激反应以及毒力等相关。本文将对细菌中存在的AAA+蛋白质降解机制,包括其结构、对底物的降解过程及其生理功能等进行阐述。

关键词：细菌蛋白酶类泛素蛋白-蛋白酶系统受调控的蛋白质降解

抗体基因点突变、插入和缺失体外检测方法的建立及应用

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上海交通大学学报（医学版） 2022年第4期42卷 518-527页

作者：罗思敏叶菱秀郝茜上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系上海市免疫学研究所上海200025

目的·建立由激活诱导胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)引起的体细胞高频突变过程中,快速检测抗体基因可变(variable,V)、多样(diversity,D)、连接(joining,J)区发生突变(包括点突变、插入和缺失事件)的体外方法... 详细信息

目的·建立由激活诱导胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)引起的体细胞高频突变过程中,快速检测抗体基因可变(variable,V)、多样(diversity,D)、连接(joining,J)区发生突变(包括点突变、插入和缺失事件)的体外方法。应用该方法检测经2种DNA聚合酶β(polymeraseβ,Polβ)抑制剂处理的细胞中抗体基因VDJ片段的突变情况。方法·用慢病毒感染法处理CH12F3细胞(即处理组),感染前的CH12F3细胞为对照组。采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测2组细胞中AID的表达水平。构建高通量测序文库,应用生物信息学的方法分析处理组和对照组细胞中抗体基因VDJ片段的点突变、插入及缺失频率。采用不同浓度的Polβ抑制剂[扎西他滨(2’,3’-dideoxycytidine,DDC)、5-甲氧基黄铜(5-methoxyflavone,5-MF)]处理CH12F3细胞,并采用台盼蓝拒染法测定该2种抑制剂对细胞增殖的影响。分别以筛选得到的DDC浓度、5-MF浓度处理CH12F3细胞(即实验组),以0.9%NaCl处理的细胞及DMSO处理的细胞依次记为上述实验组的对照组,使用上述已建立的方法进行处理,最终行高通量测序,分析该2种抑制剂对抗体基因VDJ片段中点突变、插入及缺失频率的影响。结果·Western blotting结果显示,和CH12F3细胞对照组相比,CH12F3细胞处理组中AID表达较高;且高通量测序结果显示,该组在抗体基因VDJ片段上存在大量的点突变,且插入和缺失的频率均较高(均P=0.000)。台盼蓝拒染法检测显示,处理CH12F3细胞最适宜的DDC浓度为100μmol/L、5-MF浓度为25μmol/L。最终的高通量测序结果显示,和0.9%NaCl对照组相比,经100μmol/L DDC处理的细胞在抗体基因VDJ片段的点突变频率较低(P=0.000),长度为1 bp的缺失频率亦较低(P=0.009);和DMSO对照组相比,经25μmol/L 5-MF处理的细胞在抗体基因VDJ片段的点突变频率较低(P=0.000),长度大于1 bp的插入和缺失频率亦有所下降(均P=0.000)。结论·该研究建立的体外检测方法可用于分析AID引起的抗体基因VDJ片段的突变事件。Polβ抑制剂DDC和5-MF对由AID引起的抗体基因VDJ片段的突变事件具有抑制作用。

关键词：激活诱导胞苷脱氨酶点突变插入缺失

轻链单个氨基酸改变可增强新冠病毒嵌合抗体的中和能力

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上海交通大学学报（医学版） 2023年第6期43卷 718-727页

作者：殷姿廉朝阳高波田莹郝茜叶菱秀上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系上海市免疫学研究所上海200025

目的·筛选对新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)具有中和能力的人鼠嵌合抗体,并分析其轻链上的关键氨基酸位点变化。方法·以SARS-CoV-2刺突蛋白作为免疫原,免疫抗体重链基因人源化的小鼠,通过酶... 详细信息

目的·筛选对新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)具有中和能力的人鼠嵌合抗体,并分析其轻链上的关键氨基酸位点变化。方法·以SARS-CoV-2刺突蛋白作为免疫原,免疫抗体重链基因人源化的小鼠,通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和假病毒中和实验检测小鼠血清抗体水平,应用流式细胞术分选小鼠脾脏和淋巴结中的浆细胞和生发中心(germinal center,GC)B细胞并分析各类B细胞比例。提取细胞的RNA构建鼠源抗体轻链基因文库,与固定的人源抗体重链基因配对表达抗体,并采用ELISA筛选高亲和力嵌合抗体。与鼠源胚系抗体轻链基因比对,分析高亲和力嵌合抗体轻链的氨基酸变化位点。分别构建并表达轻链单个氨基酸位点改变的嵌合抗体,通过ELISA和假病毒中和实验检测其亲和力及中和能力;比较上述位点改变前后嵌合抗体的亲和力及中和能力,并分析具有关键作用的氨基酸位点变化。结果·与未免疫小鼠相比,免疫后小鼠血清中针对SARS-CoV-2的特异性抗体的滴度增加,脾脏和淋巴结中的浆细胞和GC B细胞的比例亦有增加。ELISA的结果显示,从小鼠脾脏的GC B细胞中筛选到具有高亲和力的嵌合抗体。该抗体轻链的第76位苏氨酸替换成了异亮氨酸,且第98位苯丙氨酸发生缺失。随后,ELISA结果显示,该嵌合抗体具有较强的亲和力,轻链氨基酸没有变化的抗体和轻链仅携带第98位氨基酸缺失的抗体的亲和力较弱,而轻链仅携带第76位氨基酸替换的抗体的亲和力介于嵌合抗体和轻链氨基酸没有变化的抗体之间。假病毒中和实验的结果显示,该嵌合抗体的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为0.995 ng/μL;轻链仅携带第76位氨基酸替换的抗体的IC_(50)为1.724 ng/μL,中和能力有所减弱;轻链仅携带第98位氨基酸缺失的抗体的IC_(50)为71.05 ng/μL,轻链氨基酸没有变化的抗体的IC_(50)为42.06 ng/μL,中和能力均较弱。结论·成功筛选得到对SARS-CoV-2具有中和能力的人鼠嵌合抗体,且该抗体轻链上第76位苏氨酸替换为异亮氨酸是决定其中和能力的关键。

关键词：嵌合抗体中和抗体新冠病毒轻链体细胞高频突变

钩端螺旋体56606v对小鼠中性粒细胞凋亡的影响

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上海交通大学学报（医学版） 2022年第11期42卷 1517-1523页

作者：杜琳何平上海交通大学医学院免疫学与微生物学系上海200025

目的·探究钩端螺旋体56606v对小鼠中性粒细胞凋亡的影响及相关作用机制。方法·用钩端螺旋体56606v在感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为100、300、500时感染小鼠中性粒细胞0.5、6、12、24 h;以未被感染的中性粒细胞为对... 详细信息

目的·探究钩端螺旋体56606v对小鼠中性粒细胞凋亡的影响及相关作用机制。方法·用钩端螺旋体56606v在感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为100、300、500时感染小鼠中性粒细胞0.5、6、12、24 h;以未被感染的中性粒细胞为对照。将含有4μmol/L星形孢菌素(Staurosporine,STS)的等量细胞培养基处理的细胞作为凋亡阳性对照。采用流式细胞术检测细胞的凋亡情况;采用Western blotting技术检测钩端螺旋体56606v感染小鼠中性粒细胞后caspase-3的切割情况和核因子κB(NF-κB)通路的激活情况,并验证NF-κB抑制剂BAY 11-7082对NF-κB通路的抑制作用;通过添加NF-κB抑制剂BAY 11-7082,进一步检测NF-κB通路在钩端螺旋体56606v导致的中性粒细胞凋亡抑制中是否发挥作用;将巨噬细胞与钩端螺旋体56606v感染或未感染的中性粒细胞共孵育,通过流式细胞术检测巨噬细胞对中性粒细胞的吞噬情况。结果·流式细胞术检测结果显示,钩端螺旋体感染组与未感染对照组相比,小鼠中性粒细胞凋亡率降低;随MOI的增大,钩端螺旋体对中性粒细胞的凋亡抑制作用增强;不同MOI条件下,2组凋亡率的差异均有统计学意义(均P=0.000)。MOI=100的钩端螺旋体感染中性粒细胞0.5、6和12 h时,其凋亡率均较相应的未感染对照组降低(均P<0.05);而使用促凋亡剂STS处理后,则增强了小鼠中性粒细胞的凋亡程度。Western blotting结果显示caspase-3的切割在钩端螺旋体56606v感染后明显减少,NF-κB磷酸化水平在感染后显著上升,添加NF-κB抑制剂BAY 11-7082能够显著抑制感染后和未感染条件下NF-κB通路的激活。在钩端螺旋体56606v感染或未感染条件下,添加NF-κB抑制剂BAY11-7082均显著提高了小鼠中性粒细胞凋亡率(均P=0.000)。钩端螺旋体56606v感染的中性粒细胞与未感染对照组相比,被巨噬细胞吞噬的比例显著降低(P=0.027)。结论·钩端螺旋体56606v通过激活NF-κB通路,抑制小鼠中性粒细胞的凋亡,进一步降低巨噬细胞对中性粒细胞的胞葬作用。

关键词：钩端螺旋体中性粒细胞细胞凋亡核因子κB

靶向髓源性抑制细胞的叶酸循环增强肿瘤免疫治疗效果研究

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上海交通大学学报（医学版） 2024年第8期44卷 1011-1022页

作者：何蕊颜克鹏王静上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系上海市免疫学研究所上海200025

目的·探究叶酸循环代谢对髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)免疫抑制作用的调控机制。方法·在C57BL/6小鼠骨髓细胞的培养体系中加入细胞因子粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),体外诱导MDSCs。利用流式细胞仪检测诱导MDSCs的程序性死亡受体配体1 (programmed deathligand 1,PD-L1)表达水平和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生水平。采用磁珠分选出小鼠脾脏CD8^(+)T细胞并用Celltrace violet或CFSE标记,再与MDSCs共培养,72 h后用流式细胞术检测CD8^(+)T细胞增殖情况。通过实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测MDSCs中叶酸循环相关代谢酶的表达水平。采用叶酸循环代谢酶亚甲基四氢叶酸脱氢酶2 (methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2,MTHFD2)抑制剂DS18561882(DS18)和叶酸拮抗剂培美曲塞(Pemetrexed)处理MDSCs,并用流式分析检测MDSCs产生ROS和线粒体ROS的水平。将DS18或培美曲塞处理后的MDSCs与磁珠分选出来并用Celltrace violet或CFSE标记的CD8^(+)T细胞共培养,72 h后用流式细胞术检测CD8^(+)T细胞增殖情况。利用RNA测序(RNA-seq)检测DS18和培美曲塞处理后MDSCs在转录组水平的变化。建立小鼠结肠癌(mouse colon cancer cells,MC38)和Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma,LLC)皮下瘤模型。造模后第10天开始,采用Isotype抗体、抗CD8单抗(1 mg/kg,清除CD8^(+)T细胞)、培美曲塞以及抗CD8单抗联合培美曲塞处理MC38荷瘤小鼠;利用Isotype抗体、抗Gr1单抗(1.25 mg/kg,清除MDSCs)、培美曲塞以及抗Gr1单抗联合培美曲塞处理MC38荷瘤小鼠;分别给予MC38和LLC荷瘤小鼠培美曲塞(50 mg/kg)、抗PD-1单克隆抗体(250μg/kg)以及培美曲塞联用抗PD-1单克隆抗体治疗;第14天收集小鼠肿瘤组织,记录肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线。结果·流式结果显示诱导后的骨髓细胞PD-L1的表达升高,ROS的产生也增加,且明显抑制CD8^(+)T细胞的增殖。qPCR结果显示MDSCs中叶酸循环相关代谢酶MTHFD2等表达升高。给予DS18和培美曲塞处理MDSCs会影响MDSCs的累积,抑制MDSCs的ROS产生,并解除对CD8 T细胞的免疫抑制。RNA-seq结果表明2种叶酸循环抑制剂处理后,与MDSCs分化相关基因S100钙结合蛋白a8 (S100 calcium binding protein a8,S100a8)等下调,与MDSCs抑制功能相关基因如与ROS产生有关的基因细胞色素b-245β链(cytochrome b-245beta chain,Cybb)等也有所下调。与对照组相比,培美曲塞处理组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制。与培美曲塞处理组相比,抗CD8单抗联合培美曲塞处理组肿瘤进展加剧;与抗CD8单抗处理组相比,抗CD8单抗联合培美曲塞处理组肿瘤进展受到限制。清除MDSCs能显著抑制肿瘤生长,然而在清除MDSCs的荷瘤小鼠中,培美曲塞的抗肿瘤作用显著低于培美曲塞单独处理的小鼠。与抗PD-1抗体单独治疗相比,培美曲塞联用抗PD-1抗体治疗组的肿瘤生长限制更为显著。结论·培美曲塞依赖CD8^(+)T细胞发挥抗肿瘤作用,并通过重编程MDSCs为抗肿瘤表型,进一步阻碍肿瘤生长。通过调控MDSCs叶酸循环阻断其免疫抑制能力,可增强免疫检查点阻断剂治疗肿瘤效果。

关键词：髓源性抑制细胞叶酸循环亚甲基四氢叶酸脱氢酶2 培美曲塞肿瘤免疫治疗

哺乳动物细胞表面展示IgG抗体Fc组合突变库的构建及评估

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上海交通大学学报（医学版） 2022年第4期42卷 510-517页

作者：张咪柳淑君李福彬张燕上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系上海市免疫学研究所上海200025

目的·在单点突变文库筛选结果和多个简并引物引入组合突变的基础上,建立一种高效获得高通量的哺乳动物细胞膜表面展示IgG抗体Fc(fragment crystallizable domain)组合突变文库的方法。方法·单点突变文库经流式细胞术分选获得与Fcγ受... 详细信息

目的·在单点突变文库筛选结果和多个简并引物引入组合突变的基础上,建立一种高效获得高通量的哺乳动物细胞膜表面展示IgG抗体Fc(fragment crystallizable domain)组合突变文库的方法。方法·单点突变文库经流式细胞术分选获得与Fcγ受体IIB(FcγRIIB)高亲和力的位于EU编号233~240位点的氨基酸突变;根据这些突变设计多个简并引物,将引物等比混合或按引物所包含突变多样性占比混合后进行PCR获得含有组合突变的DNA片段;利用重组酶连接片段与载体后转化大肠埃希菌DH5α,获得质粒文库;质粒文库转染Pheonix细胞,制备反转录病毒,然后感染3T3细胞,获得细胞表面表达有Fc突变的细胞文库;使用流式细胞术检测质粒转染Pheonix细胞的效率,以及病毒感染3T3细胞的效率;高通量测序评估质粒文库和细胞文库的构建情况。结果·根据单点突变文库筛选结果,设计32条简并引物,可以覆盖所有期望的组合突变,并且实际文库多样性为期望文库的3.6倍(41600/11520);高通量测序结果显示,相较于引物等比混合获得的质粒文库,按引物所包含突变多样性占比混合所获得的质粒文库具有更好的均一性与完整性,能够覆盖期望文库中99.58%的组合突变类型(11472/11520);一代测序结果显示,10条序列中有3条为期望文库突变,与简并引物设计时计算的多样性相符;流式细胞术的结果显示,Pheonix细胞的转染效率为51.6%,3T3细胞的感染效率为47.4%;高通量测序结果显示,所获得的细胞文库能够覆盖期望文库中85.92%的组合突变(9898/11520)。结论·在已有单点突变文库筛选的氨基酸突变基础上设计多个简并引物,并通过PCR、质粒转染和反转录病毒感染,能够高效、低成本地获得文库覆盖率超过85%的抗体Fc组合突变质粒文库和哺乳动物细胞表面展示文库。

关键词： Fc工程 Fc组合突变库简并引物哺乳动物细胞表面展示高通量测序