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柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链基因EtTBC的克隆、表达及特性的初步分析

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复旦学报（自然科学版） 2024年第3期63卷 405-414页

作者：谢馨锐赵其平朱顺海郭慧琳王丽慧于钰董辉韩红玉刘伟湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128 中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室上海200234

鸡球虫病是一种由艾美耳属原生动物寄生虫引起的肠道疾病,是影响家禽业的最重要疾病之一。目前,球虫病的控制主要依赖于抗球虫药物的使用,但由于药物的长期广泛使用导致了球虫的严重耐药性。为研究其耐药性机制,本实验室前期对柔嫩艾美... 详细信息

鸡球虫病是一种由艾美耳属原生动物寄生虫引起的肠道疾病,是影响家禽业的最重要疾病之一。目前,球虫病的控制主要依赖于抗球虫药物的使用,但由于药物的长期广泛使用导致了球虫的严重耐药性。为研究其耐药性机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株、盐霉素耐药株进行了转录组测序分析,发现与敏感株相比,柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链(Et TBC)仅在地克珠利耐药株高表达。本研究在此基础上,克隆、表达了EtTBC,并初步分析了其功能及与地克珠利的关系;以柔嫩艾美耳球虫敏感株cDNA为模板成功克隆了EtTBC基因,构建了原核表达重组质粒pET28a-Et TBC,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TBC;利用qPCR对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段以及不同虫株(耐药株、敏感株和田间耐药株)的mRNA转录水平进行了分析,结果显示,该基因的转录水平在敏感株未孢子化卵囊阶段最高,且其mRNA转录水平仅在地克珠利耐药株上调;间接免疫荧光定位结果表明该蛋白主要分布在子孢子除折光体外的细胞质和表面,第二代裂殖子的细胞质和表面。

关键词：柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链耐药性

微小膜壳绦虫感染仓鼠小肠组织病理学观察及MUC2表达的分析

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黑龙江畜牧兽医 2024年第9期 109-113,121,122页

作者：王鸿雁李小毛崔轩胤张科牟荣贵州医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室贵阳561113 贵州医科大学现代病原生物学特色重点实验室贵阳561113 铜仁市人民医院检验科贵州铜仁554300

为了解微小膜壳绦虫感染仓鼠小肠组织的病理学特征及黏蛋白2(MUC2蛋白)的表达情况,试验从贵阳市宠物市场随机选取60只宠物仓鼠,采用饱和盐水浮聚法检测仓鼠粪便中的虫卵并进行鉴定,根据仓鼠感染微小膜壳绦虫的情况将仓鼠分为未感染组、... 详细信息

为了解微小膜壳绦虫感染仓鼠小肠组织的病理学特征及黏蛋白2(MUC2蛋白)的表达情况,试验从贵阳市宠物市场随机选取60只宠物仓鼠,采用饱和盐水浮聚法检测仓鼠粪便中的虫卵并进行鉴定,根据仓鼠感染微小膜壳绦虫的情况将仓鼠分为未感染组、无症状感染组、普通型感染组和重型感染组,解剖所有仓鼠获取肠道内寄生虫及小肠组织,制备小肠组织切片并进行苏木精-伊红(H.E.)染色、阿利新蓝-过碘酸-雪夫(AB-PAS)染色及免疫组织化学染色,通过实时荧光定量PCR(qPCR)扩增分析仓鼠小肠MUC2基因相对表达情况。结果表明:微小膜壳绦虫在宠物仓鼠中的感染率为74.5%,其感染可引起仓鼠小肠绒毛损伤、上皮细胞变性坏死、杯状细胞异常、白细胞浸润等病理改变;与未感染组相比,无症状组杯状细胞数量及MUC2基因相对表达量差异不显著(P>0.05),普通型感染组的杯状细胞数量极显著增加(P<0.01),重型感染组的杯状细胞极显著减少(P<0.01),同时重型感染组的MUC2基因及MUC2蛋白表达水平极显著增高(P<0.01)。说明微小膜壳绦虫感染会导致仓鼠小肠绒毛结构破坏,杯状细胞数量及形态异常,并引起杯状细胞分泌MUC2蛋白增多,且重型感染组杯状细胞数量减少,但其分泌的MUC2蛋白量增加。

关键词：仓鼠微小膜壳绦虫小肠病理学特征黏蛋白2

肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育影响的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第2期42卷 169-176页

作者：谭涅焦世铭丁艳朱成宇徐文岳陆军军医大学基础医学院病原生物学教研室重庆400038 重庆大学医学院重庆400044

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因。Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测... 详细信息

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因。Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测定蛋白浓度,用蛋白质免疫印迹(Western blotting)测定肝细胞内补体和受体表达情况。将表达红色荧光蛋白(RFP)的约氏疟原虫BY265-RFP株、伯氏疟原虫ANKA株的昆明小鼠供斯氏按蚊吸血,17~19 d后解剖分离斯氏按蚊唾液腺,收集子孢子,在24孔板中按50000个子孢子/孔加入HepG2-CD81细胞(105个/孔)孵育6、12、24 h;另设置共孵育3 h后加入C5aR拮抗剂(40 nnmol/L,每孔500μl)的组别。经4%多聚甲醛固定、封闭,非透膜组加入一抗C3a兔抗人IgG抗体(1∶500)或rC5a兔抗人IgG抗体(1∶500)4℃孵育过夜,加入绿色Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min;透膜组加入一抗UIS4山羊多克隆抗体(1∶500)4℃孵育过夜,加入绿色IFKineTM荧光标记的驴抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入CD88兔多克隆抗体(1∶400)4℃孵育过夜,加入红色Dylight 649荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min,激光共聚焦显微镜观察补体在纳虫空泡周围的富集情况。取眼镜蛇毒因子(CVF)腹腔注射至C57BL/6小鼠,为CVF组;并设置C3-/-组(C3全基因敲除C3-/-小鼠)和对照组(C57BL/6小鼠)。取10000个约氏疟原虫子孢子感染各组小鼠,取肝脏提取总RNA后逆转录合成cDNA,荧光定量PCR测定疟原虫18S rRNA含量,肝脏虫荷用18S rRNA的相对含量表示。以尾静脉注射方式,用200个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)10只、C3aR^(-/-)小鼠10只;1000个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)5只、C5aR全基因敲除C5aR^(-/-)小鼠6只和肝脏C5aR条件性敲除Alb-cre+/+C5aRflox/flox杂交小鼠5只;1000个伯氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)6只和C5aR^(-/-)小鼠6只,感染后3 d开始取尾静脉血,制成薄血膜涂片,吉氏染色后观察,至所有小鼠均出现红内期疟原虫为止。采用Graphpad prism 9.0软件进行统计学分析。正态分布的数据采用t检验比较连续变量,两两差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行多重比较;非正态分布数据比较采用Mann-Whitney U检验。结果PCR结果可见,Hepa1-6细胞株内扩增出C3(358 bp)、C5(267 bp)及其受体C3aR(222 bp)、C5aR(388 bp)基因;HepG2-CD81细胞株内扩增出C3(202 bp)、C5(220 bp)、C3aR(299 bp)和C5aR(374 bp)基因。Western blotting检测结果发现,两种细胞均有C3、C5、C3aR和C5aR蛋白表达。激光共聚焦显微镜成像可见,细胞核经DAPI染色呈蓝色荧光,约氏疟原虫红外期呈红色自发荧光,非透膜组HepG2-CD81细胞内高表达的C3a和C5a呈绿色荧光,与纳虫空泡分布区域重叠;透膜组C5aR(粉色)与纳虫空泡膜(绿色)重叠;加入C5aR拮抗剂组别的纳虫空泡膜上仍有C5aR表达。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、CVF组、C3-/-组的肝脏虫荷(18S rRNA相对含量)分别为0.954±0.523、0.958±0.231、0.638±0.437,3组间差异均无统计学意义(P>0.05)。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C3aR^(-/-)小鼠分别在(5.30±0.78)d和(5.30±0.78)d后出现红内期;伯氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C5aR^(-/-)小鼠分别在(3.67±0.47)d和(3.83±0.69)d后出现红内期;2组基因敲除小鼠红内期出现时间与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、Alb-cre^(+/+)C5aR^(flox/flox)小鼠和C5aR^(-/-)小鼠红内期的出现时间分别为(4.00±0.00)、(4.00±0.00)、(4.17±0.37)d,差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育无显著影响。

关键词：疟原虫红外期肝细胞局部补体

肝细胞内补体活化对疟原虫红外期发育影响的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年

作者：谭涅焦世铭丁艳朱成宇徐文岳陆军军医大学基础医学院病原生物学教研室重庆大学医学院

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法首先采用反转录PCR扩增和蛋白质免疫印迹分析观察C57BL/6小鼠来源的Hepa1-6细胞和人肝癌细胞来源的HepG2-CD81细胞内是否存在补体C3、C5,以及是否表达C3aR和C5aR。随后,将约氏... 详细信息

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法首先采用反转录PCR扩增和蛋白质免疫印迹分析观察C57BL/6小鼠来源的Hepa1-6细胞和人肝癌细胞来源的HepG2-CD81细胞内是否存在补体C3、C5,以及是否表达C3aR和C5aR。随后,将约氏疟原虫BY265-RFP子孢子与HepG2-CD81细胞孵育,在6、12或24 h后,利用激光共聚焦显微镜观察肝细胞局部补体C3、C5是否活化,以及纳虫空泡膜上是否表达C5aR。最后,观察活化的肝细胞局部补体及其受体在疟原虫红外期感染中的作用。先将小鼠分为对照组、眼镜蛇毒因子(cobra venom factor,CVF)特异耗竭血清C3组和C3全基因敲除组,用伯氏疟原虫ANKA株(Plasmodium berghei ANKA,***)子孢子攻击48 h后定量PCR查肝脏虫荷,观察系统性补体对疟原虫红外期感染的影响;尔后,用子孢子攻击C3aR全基因敲除小鼠和C5aR全基因敲除小鼠,制备血涂片查红内期出现时间,观察补体受体在疟原虫红外期感染中的作用;最后,再用约氏疟原虫BY265株(Plasmodium yoelii BY265,***265)子孢子攻击野生型小鼠(对照组)、C5aR全基因敲除小鼠和肝脏C5aR条件性敲除小鼠,查红内期出现时间,观察肝细胞局部补体受体在疟原虫红外期感染中的作用。结果 Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞内存在补体C3、C5及其受体C3aR、C5aR;子孢子感染能活化补体C3、C5,且活化的C3a、C5a、C5aR主要集中在纳虫空泡周围。***子孢子攻击后,野生型小鼠、CVF处理小鼠和C3全基因敲除小鼠的肝脏虫荷之间差异无统计学意义(P>0.05);C3aR全基因敲除小鼠和C5aR全基因敲除小鼠红内期出现时间与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);***265子孢子攻击后,对照组小鼠、C5aR全基因敲除小鼠和肝脏C5aR条件性敲除小鼠红内期出现时间差异无统计学意义(P> 0.05)。结论肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育无显著影响。

关键词：疟原虫红外期肝细胞局部补体

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一例海豚源典型异尖线虫形态观察和分子鉴定

畜牧兽医学报 2024年第6期55卷 2599-2606页

作者：朱昊天刘路瑶杨聪山姜纪石涵刘笑笑陈木新徐前明安徽农业大学动物科技学院合肥230036 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室(中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所)上海200025

旨在鉴定由海豚粪便样本中所分离所得线虫种类。首先对所分离虫体进行形态观察,然后提取虫体基因组DNA,并对样本28S rRNA D2-D3基因和ITS基因片段进行PCR扩增,以进行分子生物学鉴定。所得序列经BLAST比对并用邻接法构建系统进化树对所... 详细信息

旨在鉴定由海豚粪便样本中所分离所得线虫种类。首先对所分离虫体进行形态观察,然后提取虫体基因组DNA,并对样本28S rRNA D2-D3基因和ITS基因片段进行PCR扩增,以进行分子生物学鉴定。所得序列经BLAST比对并用邻接法构建系统进化树对所得序列进行分析。结果显示:虫体长120~140 mm,整体呈圆柱形,两端尖细,外观呈乳白色半透明,镜下观察其内部偏黄。可见食道前端细,向后逐渐膨大。PCR结果显示,28S rRNA D2-D3基因与ITS基因扩增长度分别为797和840 bp。BLAST比对结果显示:28S rRNA D2-D3基因(GenBank登录号OR345165)与已报道典型异尖线虫(Anisakis typical, GenBank登录号HF911524.1)的序列一致性为95.36%;ITS基因(GenBank登录号OR345164)与典型异尖线虫(GenBank登录号MF668919.1)一致性为97.11%,其中,ITS-1区域与典型异尖线虫(GenBank登录号MF668919.1)一致性为91.90%,ITS-2区域与典型异尖线虫(GenBank登录号JN968938.1)一致性为94.97%,5.8S rRNA区域与典型异尖线虫(GenBank登录号OQ244221.1)一致性为100.00%。基于ITS基因和28S rRNA D2-D3基因的系统发育分析结果显示,此次研究分离所得寄生虫样本与典型异尖线虫遗传距离最近,且同一分支上。本次分离所得寄生虫样本经过分子鉴定为典型异尖线虫。同源性分析结果显示,其与典型异尖线虫一致性均大于95%;同时,在28S rRNA D2-D3基因序列和ITS基因序列的系统发育分析方面,均与已报道的典型异尖线虫遗传距离最近。

关键词：异尖线虫人畜共患病形态学观察分子鉴定系统进化树

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基于环介导等温扩增微流控芯片技术快速检测蚊媒携带登革病毒方法的建立

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年第2期42卷 234-241页

作者：姜宁白洁李平单文琪周秋明董昊炜袁浩陶峰李翔宇马雅军彭恒上海理工大学健康科学与工程学院上海200093 中国人民解放军海军军医大学基础医学院病原生物学教研室上海200433 海口市疾病预防控制中心海南海口571100 中国人民解放军海军军医大学海医系上海200433

目的建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)微流控芯片技术的快速检测蚊媒携带登革病毒的方法。方法根据登革病毒衣壳蛋白(C)、前膜蛋白(prM)和非结构蛋白2A(NS2A)基因片段构建pUC-GWAmp-CprM和pUC-GW-Amp-NS2A质粒,设计多组环介导等温扩增... 详细信息

目的建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)微流控芯片技术的快速检测蚊媒携带登革病毒的方法。方法根据登革病毒衣壳蛋白(C)、前膜蛋白(prM)和非结构蛋白2A(NS2A)基因片段构建pUC-GWAmp-CprM和pUC-GW-Amp-NS2A质粒,设计多组环介导等温扩增特异性引物组。制备LAMP微流控芯片,以靶基因质粒、登革病毒核酸为模板进行检测,根据起峰时间、相对荧光单位、假阳性、重复实验稳定性、检测灵敏度等指标筛选最优引物组。用最优引物组分别检测埃及伊蚊、白纹伊蚊等主要登革热传播媒介和常见的致倦库蚊、中华按蚊、摇蚊的cDNA,并与寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、恶性疟原虫、黄热病毒等常见蚊媒传播病原体进行交叉检测,评价LAMP法的特异性。评价LAMP法检测CprM和NS2A靶基因质粒的灵敏度,分别与PCR、实时荧光定量PCR(qPCR)检测结果进行比较。用登革病毒RNA与传播媒介埃及伊蚊、白纹伊蚊RNA分别以1∶10、1∶100和1∶1000混合,模拟媒介携带登革病毒的样品进行LAMP微流控芯片检测。对采集自宁德市三都岛、西安市、上海朱家角、长兴岛和五角场等5地的白纹伊蚊的cDNA进行检测。结果引物组筛选结果显示,CprMG2和NS2AG1引物组起峰时间早,相对荧光单位高,灵敏度最高,为最优引物组。CprMG2引物组可检测浓度低至10-6 ng/μl的pUC-GW-Amp-CprM质粒,最低检测限为1.3×10^(3)拷贝;NS2AG1引物组可检测浓度低至10-9 ng/μl的pUC-GW-Amp-NS2A质粒,最低检测限为1拷贝。最优引物组CprMG2、NS2AG1对埃及伊蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、致倦库蚊、摇蚊等蚊虫cDNA无非特异性扩增,与寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒、恶性疟原虫、黄热病毒核酸无交叉反应。LAMP微流控芯片检测CprM靶基因的最低检测限为1.3×10^(3)拷贝,较PCR检测的最低检测限(1.3×10^(4)拷贝)高1个数量级;LAMP微流控芯片检测CprM和NS2A靶基因的最低检测限分别为1.3×10^(3)拷贝、1拷贝,与qPCR检测的最低检测限(1.3×10^(3)拷贝、1拷贝)相当。LAMP微流控芯片检测模拟现场样品的结果显示,CprMG2可检出与埃及伊蚊、白纹伊蚊RNA 1∶10、1∶100和1∶1000混合的登革病毒RNA,NS2AG1最低可检出1∶100混合的登革病毒,特异性均为100%。LAMP微流控芯片检测5地现场采集白纹伊蚊的结果均为阴性。结论建立了基于LAMP微流控芯片检测登革病毒的方法,该法敏感性和特异性高,检测时间短,可用于现场蚊媒携带登革病毒的检测。

关键词：登革病毒蚊虫环介导等温扩增微流控芯片现场检测技术

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MAVS^(-/-) HeLa细胞系构建及其在干扰素信号通路中应用

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生物技术 2024年第2期34卷 144-149页

作者：姬红董云霞那睿思李玉军程德春黑龙江省医学科学院黑龙江哈尔滨150081 哈尔滨医科大学寄生虫学教研室黑龙江哈尔滨150081 深圳湾实验室广东深圳518000

[目的]通过CRISPR/Cas9技术构建线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)基因敲除的HeLa细胞系,并对细胞系的生长特性、及其对干扰素信号通路的影响进行初步鉴定。[方法]针对MAVS外显子设计构建靶向MAVS基因的guide ... 详细信息

[目的]通过CRISPR/Cas9技术构建线粒体抗病毒信号(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)基因敲除的HeLa细胞系,并对细胞系的生长特性、及其对干扰素信号通路的影响进行初步鉴定。[方法]针对MAVS外显子设计构建靶向MAVS基因的guide RNA,并克隆至LentiCRISPR v2载体后包装成慢病毒,感染HeLa细胞后经嘌呤霉素筛选获得MAVS基因敲除的HeLa细胞,Western Blotting验证敲除效果,MTT法检测细胞生长活力,应用聚肌胞苷酸(Poly(I:C))刺激并检测细胞内干扰素-β(IFN-β)mRNA水平的变化。[结果]测序结果表明成功构建CRISPR-MAVS-gR质粒,包装成慢病毒并感染HeLa细胞,经筛选获得的细胞内MAVS mRNA及蛋白均不表达,生长速度及活性与野生型HeLa相同,Poly(I:C)刺激后,细胞内IFN-β变化不明显。[结论]通过CRISPR/Cas9技术获得MAVS基因敲除的MAVS^(-/-)HeLa细胞系,Poly(I:C)诱导剂不能在该细胞内激活干扰素信号通路,为后续研究MAVS相关的抗病毒天然免疫信号通路奠定了基础。

关键词：线粒体抗病毒信号蛋白 CRISPR/Cas9 HeLa 基因敲除天然免疫干扰素嘌呤霉素聚肌胞苷酸

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贵州省蜱种调查及遗传进化分析

黑龙江畜牧兽医 2024年第11期 72-77页

作者：李容庭李威仪刘志豪唐小敏吴家红贵州医科大学公共卫生与健康学院环境污染与疾病监控教育部重点实验室贵州贵安550025 贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室贵州贵安550025 贵州医科大学基础医学院寄生虫学教研室贵州贵安550025

为了调查贵州省蜱虫的物种多样性及分布特征,阐明不同地理株蜱虫间的遗传进化关系,试验采用动物体表采集法与布旗法采集寄生蜱及游离蜱;使用超景深显微镜对蜱虫进行形态学鉴定。选取不同地域、种类及不能准确识别的蜱虫提取组织DNA,采用... 详细信息

为了调查贵州省蜱虫的物种多样性及分布特征,阐明不同地理株蜱虫间的遗传进化关系,试验采用动物体表采集法与布旗法采集寄生蜱及游离蜱;使用超景深显微镜对蜱虫进行形态学鉴定。选取不同地域、种类及不能准确识别的蜱虫提取组织DNA,采用PCR法扩增蜱虫16S rDNA和COI基因片段并测序,通过BioEdit 7.0软件进行多序列比对确认蜱虫物种;使用MEGA 11.0软件对序列信息进行分析,构建基于16S rDNA和COI基因的系统进化树,对不同地理株蜱虫进行遗传进化分析。结果表明:在贵州省8个市州23个区县共采集到蜱虫2 420只,其中牛寄生蜱2 193只,羊寄生蜱92只,犬寄生蜱36只,游离蜱99只。形态学和分子生物学方法共鉴定出2种蜱虫,其中微小扇头蜱1 560只,长角血蜱860只。在系统发育进化中,微小扇头蜱、长角血蜱的16S rDNA和COI基因都分别与对应的参考基因序列聚集成一簇,贵州省大部分微小扇头蜱序列总体上聚于一个分支,只有黔东南州QDNZ1株在两个进化树中都形成了独立分支;多数长角血蜱序列也聚于同一分支,仅基于COI基因构建的系统进化树中毕节市BJS1株与其他省地理株聚在另一分支。说明贵州省家畜常见蜱种为微小扇头蜱和长角血蜱;在贵州省黔东南州存在一株微小扇头蜱特有株系,且在毕节市的长角血蜱存在省外输入的情况,这可能会增加蜱媒疾病在贵州省传播的风险。

关键词：蜱线粒体16S rDNA基因细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因分子鉴定系统发育分析

长角血蜱天冬氨酸蛋白水解酶8基因的鉴定及其抵抗田鼠巴贝虫感染作用的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2024年

作者：朱昊天周勇志曹杰王亚楠张厚双徐前明周金林安徽农业大学动物科技学院中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室

目的对长角血蜱天冬氨酸蛋白水解酶8 (hlcas8)基因进行鉴定，探究其在长角血蜱抵抗田鼠巴贝虫感染中的作用，为田鼠巴贝虫传播阻断疫苗的研究奠定基础。方法提取长角血蜱RNA，逆转录为cDNA,PCR扩增hlcas8，测序后在GenBank中进行BLAS... 详细信息

目的对长角血蜱天冬氨酸蛋白水解酶8 (hlcas8)基因进行鉴定，探究其在长角血蜱抵抗田鼠巴贝虫感染中的作用，为田鼠巴贝虫传播阻断疫苗的研究奠定基础。方法提取长角血蜱RNA，逆转录为cDNA,PCR扩增hlcas8，测序后在GenBank中进行BLAST比对。用MEGA软件，采取邻接法构建基于cas基因的系统进化树。以叮咬田鼠巴贝虫感染小鼠的长角血蜱的若蜱为感染组，以叮咬正常小鼠的同批次若蜱为对照组。感染组与对照组各取9只蜱，提取RNA并逆转录为cDNA，采用定量PCR (qPCR)方法分析感染组与对照组蜱hlcas8基因相对转录水平差异；提取感染组和对照组长角血蜱的若蜱总蛋白，蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测HLCAS8的相对表达量。合成hlcas8基因和荧光素酶基因的双链RNA (dsRNA)，显微注射至长角血蜱若蜱体内进行RNA干扰，12～24 h后，取活性良好的蜱吸食田鼠巴贝虫感染小鼠血，饱血后立即收集蜱，用探针法，实时PCR检测长角血蜱体内田鼠巴贝虫的18S rRNA基因，根据标准曲线计算对应含虫量。感染组和对照组hlcas8基因相对转录水平和蛋白相对表达水平的比较采用t检验。结果 PCR扩增获得的hlcas8基因长1 377 bp，序列提交GenBank获得的登录号为PP407944，其预测的氨基酸序列与长角血蜱CAS8 (GenBank:ABG48761.1)、镰形扇头蜱CAS8(GenBank:ALQ43547.1)的氨基酸序列一致性分别为21.26%和61.24%。系统进化树分析结果显示，hlcas8基因与长角血蜱cas基因均不在同一分支上，且亲缘关系较远；与镰形扇头蜱cas8基因（GenBank:ALQ43547.1）的亲缘关系较近，在同一分支上。qPCR分析结果显示，感染组长角血蜱hlcas8基因的相对转录水平为0.562±0.036，高于对照组的0.198±0.071 (t=7.91,P <0.01)。Western blotting结果显示，感染组长角血蜱HLCAS8蛋白的相对表达水平为0.460±0.013，高于对照组的0.346±0.007 (t=9.368,P <0.01)。RNA干扰沉默hlcas8后，长角血蜱若蜱体内hlcas8基因的相对表达水平为0.036±0.003，低于对照组的0.081±0.006 (t=10.68,P <0.01)。沉默hlcas8基因的蜱体内田鼠巴贝虫含虫量为3.35×10～6 copies/μl，高于对照组的1.35×10～6 copies/μl (t=4.570,P <0.05)。结论 HLCAS8是长角血蜱的凋亡相关分子，能够抵御田鼠巴贝虫感染长角血蜱，可以作为田鼠巴贝虫传播阻断疫苗的候选靶向分子。

关键词：长角血蜱人兽共患病田鼠巴贝虫天冬氨酸蛋白水解酶8 RNA干扰