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Fgl2对小鼠急性肾损伤中巨噬细胞极化的作用

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陆军军医大学学报 2024年第13期46卷 1467-1476页

作者：朱琳许桂莲谢攀彭侃夫陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院肾内科重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院免疫学教研室重庆400038

目的探讨纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein2,Fgl2)对顺铂诱导的急性肾损伤(cisplatin-induced acute kidney injury,Cis-AKI)中巨噬细胞极化的作用。方法选取24只8~10周龄(体质量20~25 g)的雄性野生型(Fgl2^(+/+))小鼠和Fgl2基因敲除(Fgl2^(-/-))小鼠各12只。单次腹腔注射生理盐水(saline)或顺铂(cisplatin,Cis)处理3 d,按随机数字表法分成4组(n=6):Fgl2^(+/+)Saline组、Fgl2^(+/+)Cis组、Fgl2^(-/-)Saline组和Fgl2^(-/-)Cis组。3 d后,检测肾功能相关指标血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)的水平,HE染色评估肾损伤程度;Western blot检测肾组织中Fgl2和肾损伤分子1(kidney injury molecule 1,Kim-1)的表达;RT-qPCR检测Fgl2、Kim-1、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)、IL-6、IL-12p40、IL-1β、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、TNF-α的表达;免疫组化检测肾脏Fgl2和巨噬细胞(F4/80^(+))的表达;免疫荧光检测肾组织中巨噬细胞(F4/80^(+))和M1型巨噬细胞(F4/80^(+)CD86^(+))的表达;流式细胞术检测肾组织中巨噬细胞(F4/80^(+))及M1型巨噬细胞(F4/80^(+)MHCⅡ+)、M2型巨噬细胞(F4/80^(+)CD206^(+))的表达。结果与Fgl2^(+/+)Saline组比较,Fgl2^(+/+)Cis组小鼠肾功能显著下降(P<0.05),肾小管损伤病理评分显著升高(P<0.05),肾组织Fgl2表达显著上调(P<0.05);与Fgl2^(+/+)Cis组相比,Fgl2^(-/-)Cis组小鼠肾功能显著下降(P<0.05),肾损伤相关分子Kim-1、NGAL表达显著升高(P<0.05),肾小管损伤病理评分显著升高(P<0.05),巨噬细胞浸润显著增加(P<0.05),M1型巨噬细胞相关分子IL-6、IL-1β、TNF-α和iNOS表达显著上升(P<0.05),流式细胞术结果显示M1型巨噬细胞百分比显著升高(P<0.05),M2型巨噬细胞百分比无明显变化,且M1型占比显著高于M2型(P<0.05)。结论Fgl2基因敲除可通过促进巨噬细胞向M1型转化加重Cis-AKI。

关键词：顺铂急性肾损伤纤维蛋白原样蛋白2 巨噬细胞

Siglec-E影响小白菊内酯靶向MAPK/NF-κB通路抑制小胶质细胞M1极化

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陆军军医大学学报 2024年第7期46卷 651-660页

作者：付文莹王鹏博唐翔宇冯力元黄钰婷李鹏陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系生药学与中药学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系药剂学教研室重庆400038

目的探讨唾液酸结合样凝集素E(sialic acid binding lectin E,Siglec-E)对小白菊内酯(parthenolide,PTL)抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠小胶质细胞(BV2)M1极化作用的影响。方法①从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)获取Siglece相关小鼠脑组织单细胞测序数据,分为野生型组(WT,n=3)和敲除型组(Siglece^(-/-),n=4)。从中筛选出小胶质细胞并分析相关差异基因及通路富集。通过shRNA干扰技术构建BV2细胞株模型,得到NC-shRNA BV2和Siglece-shRNA BV2细胞并检测Siglec-E(Siglece)表达水平。②将NC-shRNA和Siglece-shRNA细胞分别分为Control组、LPS组、PTL组和PTL+LPS组(n=3),采用RT-qPCR检测小胶质细胞M1极化标志物iNOS、IL-1β和IL-6的mRNA水平。将Siglece^(fl/fl)和Cx3cr1^(cre)小鼠交配,获得小胶质细胞特异性Siglec-E缺失(Siglece^(fl/fl)×Cx3cr1^(cre))小鼠,并建立LPS诱导的神经炎症模型。③将出生4 d的各9只WT和Siglece^(fl/fl)×Cx3cr1^(cre)雄鼠分成Control组、LPS组和PTL+LPS组(n=3)。采用RT-qPCR、免疫荧光技术和Western blot验证敲除效果以及极化相关通路,研究Siglec-E影响PTL抑制小胶质细胞M1极化的机制。结果与NC-shRNA组比较,Siglece-shRNA组中Siglec-E表达显著降低(P<0.01),说明SiglecE敲除细胞模型建立成功。在LPS刺激的条件下,与Control组比较,NC-shRNA细胞和Siglece-shRNA细胞的iNOS、IL-1β和IL-6的mRNA水平均显著上调(P<0.01)。PTL与LPS共同作用下,NC-shRNA细胞中上述M1极化的标志物均明显下降(P<0.05)。而对于Siglece-shRNA细胞,上述M1极化的标志物无显著下调。PTL对BV2细胞JNK、IκB蛋白的磷酸化具有抑制作用(P<0.01),也可抑制NF-κB核转位,而下调Siglec-E则会减弱该作用。与WT组小鼠比较,Siglece^(fl/fl)×Cx3cr1^(cre)小鼠小胶质细胞Siglec-E表达显著降低(P<0.01),PTL对Siglece^(fl/fl)×Cx3cr1^(cre)小鼠小胶质细胞NF-κB磷酸化水平的抑制作用也降低。结论小胶质细胞Siglec-E缺失会减弱PTL靶向MAPK/NF-κB通路对其M1极化的抑制作用。

关键词：唾液酸结合样凝集素E 小胶质细胞小白菊内酯 M1极化

水蛭素-草酸二维生素E酯脂质体的构建及其体外抗凝作用评价

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陆军军医大学学报 2024年第21期46卷 2475-2484页

作者：杨清华张建祥周振华陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院神经内科重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系药剂学教研室重庆400038

目的基于维生素E,构建同时具有过氧化氢清除功能和抗凝作用的脂质体,探讨其是否可以作为急性缺血性脑卒中的治疗方式并评价其体外抗凝作用。方法利用过氧草酸酯键将两分子维生素E(生育酚,VE)化学键合,得到目标化合物草酸二维生素E酯(oxa... 详细信息

目的基于维生素E,构建同时具有过氧化氢清除功能和抗凝作用的脂质体,探讨其是否可以作为急性缺血性脑卒中的治疗方式并评价其体外抗凝作用。方法利用过氧草酸酯键将两分子维生素E(生育酚,VE)化学键合,得到目标化合物草酸二维生素E酯(oxalate vitamin E,OVE);通过酰胺化反应将抗凝药物水蛭素(hirudin)连接到亚油酸(linoleic acid,LA)得到抗凝目标单元亚油酸-水蛭素(LA-hirudin,LH);并通过红外光谱、核磁等手段对所合成的产物进行结构表征。采用薄膜分散法制备水蛭素-草酸二维生素E酯脂质体(hirudin-OVE liposome,HOL),采用激光粒度仪(DLS)和透射电子显微镜(TEM)等方法对脂质体进行表征。选取小鼠脑微血管内皮细胞(mouse brain-derived endothelial cells,bEnd3)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)进行细胞实验。通过ELISA测定过氧化氢以及细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平,以评价脂质体对细胞氧化应激和炎症水平的影响。采用细胞计数实验(CCK-8)和细胞增殖检测实验(Edu)考察脂质体对细胞数目和细胞增殖情况的影响。取小鼠全血,考察所制备脂质体的抗凝作用。结果核磁结果表明成功合成了OVE,红外谱图结果表明水蛭素和亚油酸成功键合得到亚油酸-水蛭素。透射电镜和激光粒度仪结果表明所制备的脂质体形状为类球形,且粒径分布均匀,平均粒径为161 nm。细胞实验表明,脂质体能够显著抑制模型细胞分泌过氧化氢和炎症因子,具有明显的抗氧化、抗炎作用(P<0.05)。细胞计数实验和细胞增殖检测实验结果证明脂质体能够抑制炎症导致的细胞数目减少、缓解LPS刺激所引起的细胞增殖抑制(P<0.01)。抗凝实验结果表明,脂质体能够显著抑制CaCl 2诱导的凝血反应(P<0.01)。结论基于维生素E成功合成过氧化氢清除性材料OVE,并以抗凝药物水蛭素和OVE制备OVE抗凝脂质体(HOL),该脂质体在细胞层面上具有良好的抗氧化、抗炎效果,并具有显著的抗凝作用。

关键词：过氧化氢清除性脂质体抗炎抗氧化抗凝作用草酸二维生素E酯水蛭素

HES5对肾小管上皮细胞转分化和凋亡的影响及其机制研究

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陆军军医大学学报 2024年第11期46卷 1214-1225页

作者：张羽寒衡雪朱琳谢攀许桂莲彭侃夫陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院肾科重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院烧伤科重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院免疫学教研室重庆400038

目的探讨HES5(hairy and enhancer of split 5)对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和凋亡的作用及其潜在机制。方法分析和筛选GSE66494数据中的差异表达基因。建立小鼠的输尿管梗阻模型(unilateral uretera obstruction,UUO),检测肾... 详细信息

目的探讨HES5(hairy and enhancer of split 5)对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和凋亡的作用及其潜在机制。方法分析和筛选GSE66494数据中的差异表达基因。建立小鼠的输尿管梗阻模型(unilateral uretera obstruction,UUO),检测肾组织中HES5的表达水平。TGF-β1(10 ng/mL)处理HK-2细胞24 h建立肾小管上皮-间质转化模型后,通过qRT-PCR和Western blot检测HES5的表达水平。用过表达HES5的质粒转染HK-2细胞,24 h后检测其纤连蛋白(Fibronectin,FN)、胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和波形蛋白(Vimentin)及凋亡相关标志物(Bax、Bcl2)等蛋白表达;然后,将HK-2细胞分为4组:Control组、siHES5组、TGF-β1组、siHES5+TGF-β1组,检测各组的纤维化及凋亡标志物的表达情况。运用TUNEL及流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。Western blot检测各组AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的蛋白表达。通过加入PI3K抑制剂(LY294002)处理过表达HES5的HK-2细胞后,检测Vimentin的表达。结果HES5的表达在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)和小鼠纤维化肾组织中均显著上调;过表达HES5可以促进HK-2细胞中FN、CollagenⅠ、Vimentin、Bax的合成,抑制Bcl2的表达(P<0.05);敲低HES5不仅下调纤维化标志物的表达,还抑制了肾小管上皮细胞凋亡;此外,HES5基因敲低使TGF-β1诱导的HK-2细胞内PI3K/AKT信号通路的激活程度降低(P<0.05);PI3K/AKT信号通路抑制剂减弱了HES5对Vimentin的诱导作用。结论敲低HES5可以抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和凋亡,这可能与PI3K/AKT信号通路活性降低有关。

关键词： HES5 上皮-间质转分化细胞凋亡 PI3K/AKT信号通路 TGF-β1

热刺激后小胶质细胞细胞外囊泡对神经元的损伤作用

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陆军军医大学学报 2024年第18期46卷 2029-2035页

作者：李萍罗雪罗珍何根林王泽泽申婷婷刘晓倩谭雨龙杨学森陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系热带医学教研室重庆400038

目的探究热刺激后小胶质细胞细胞外囊泡对神经元损伤的影响。方法热刺激BV2小胶质细胞后收集上清,通过不同的超速离心速度获取细胞外大囊泡和小囊泡。利用纳米粒度分析仪检测粒径,利用Western blot检测囊泡上TSG101、CD63和flotillin-1... 详细信息

目的探究热刺激后小胶质细胞细胞外囊泡对神经元损伤的影响。方法热刺激BV2小胶质细胞后收集上清,通过不同的超速离心速度获取细胞外大囊泡和小囊泡。利用纳米粒度分析仪检测粒径,利用Western blot检测囊泡上TSG101、CD63和flotillin-1的表达。PKH67标记BV2来源的囊泡后与N2a细胞共孵育,检测神经元对小胶质细胞细胞外囊泡的摄取情况。分别将热刺激后BV2来源的大囊泡和小囊泡与N2a共孵育,通过CCK-8、细胞外乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、台盼蓝染色和TUNEL染色法评价热刺激后N2a的损伤情况。结果小囊泡粒径介于30~120 nm,高表达TSG101和CD63,大囊泡粒径介于90~1000 nm,高表达flotillin-1;BV2来源的细胞外囊泡可被N2a细胞摄取并参与热刺激对N2a细胞损伤的调节,其中CCK-8检测结果表明小胶质细胞来源的大小囊泡均能降低热刺激后N2a细胞的活力(P<0.05)。LDH检测、台盼蓝染色及TUNEL检测结果表明大囊泡(P<0.05)和小囊泡(P<0.01)均能显著提高热刺激后N2a细胞LDH的释放水平、N2a细胞的蓝染水平及凋亡程度,且小囊泡处理组中N2a细胞的LDH释放水平、蓝染和凋亡水平高于大囊泡处理组。结论热刺激后小胶质细胞通过细胞外囊泡加剧了神经元的损伤。

关键词：小胶质细胞细胞外囊泡热刺激神经元损伤

新兵知觉压力与认知灵活性、生活满意度的关系及正念认知干预研究

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陆军军医大学学报 2024年第10期46卷 1180-1186页

作者：张一苇彭李许辰李敏陆军军医大学(第三军医大学)医学心理系军事心理学教研室重庆400038

目的探讨认知灵活性在新兵知觉压力与生活满意度中的关系,构建正念认知干预方案,研究该方案对新兵认知灵活性和生活满意度的影响作用。方法采用整群抽样法对某部965名新兵进行问卷调查。评估工具包括中文版知觉压力量表(Chinese Perceiv... 详细信息

目的探讨认知灵活性在新兵知觉压力与生活满意度中的关系,构建正念认知干预方案,研究该方案对新兵认知灵活性和生活满意度的影响作用。方法采用整群抽样法对某部965名新兵进行问卷调查。评估工具包括中文版知觉压力量表(Chinese Perceived Stress Scale,CPSS)、认知灵活性量表(Cognitive flexibility Inventory,CFI)和生活满意度量表(Satisfaction Life Scale,SWLS)。其中61名新兵,以排为单位分为训练组(n=31)和对照组(n=30),训练组接受6周正念认知干预,对照组每周仅接受心理健康教育。采用问卷以及行为学实验(线索任务转换范式)对训练效果进行评估。结果①知觉压力和认知灵活性、生活满意度均呈显著负相关(r=-0.78,P学意义。结论正念认知干预能有效提升新兵认知灵活性水平,提升新兵的生活满意度水平。

关键词：知觉压力认知灵活性生活满意度线索任务转换

Humanin对鱼藤酮诱导的多巴胺神经元毒性的保护作用研究

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陆军军医大学学报 2024年第7期46卷 670-677页

作者：单耀辉张启夫程晋叶枫张玺余文珮王晓刚赵远鹏但国蓉陈明亮赛燕陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系防化医学教研室重庆400038

目的探讨Humanin(HN)对鱼藤酮(rotenone,Rot)诱导的多巴胺神经元毒性损伤的保护作用和机制。方法构建Rot染毒PC12细胞模型,实验设对照组、Rot染毒组、HN预处理Rot染毒组、单独HN处理组。采用ELISA检测Rot染毒细胞内外HN的含量,CCK-8法... 详细信息

目的探讨Humanin(HN)对鱼藤酮(rotenone,Rot)诱导的多巴胺神经元毒性损伤的保护作用和机制。方法构建Rot染毒PC12细胞模型,实验设对照组、Rot染毒组、HN预处理Rot染毒组、单独HN处理组。采用ELISA检测Rot染毒细胞内外HN的含量,CCK-8法检测细胞活性,ATP检测试剂盒检测细胞内ATP含量,DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平,Western blot分别检测线粒体自噬调控蛋白Pink1、Parkin、p-Parkin、p62、LC3,线粒体生物发生调控蛋白PGC1α和分裂/融合调控蛋白OPA1、MFN2、DRP1、p-DRP1以及抗氧化应激调控蛋白Keap1、Nrf2的表达。采用HBAD-mcherry-EGFP-LC3腺病毒转染细胞观察自噬体和自噬溶酶体的数量。结果Rot染毒组PC12细胞内HN浓度显著高于对照组(P<0.05);与对照组比较,Rot染毒组PC12细胞活性下降,ATP含量下降,ROS的生成增加,Rot染毒后PC12细胞内Pink1、p-Parkin表达升高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,p62表达下降,细胞线粒体生物发生蛋白PGC1α和线粒体融合蛋白MFN2、OPA1表达下降,而线粒体分裂蛋白p-DRP1表达升高,抗氧化应激蛋白Keap1和Nrf2表达下降(P均<0.05);与对照组比较,Rot染毒组PC12细胞中自噬体和自噬溶酶体数量增多(P<0.05),而20μmol/L HN预处理可以改善Rot染毒引起的上述变化(P<0.05)。结论HN通过抑制线粒体自噬和线粒体分裂、促进线粒体生物发生和融合以及抗氧化应激,改善Rot诱导的多巴胺神经元毒性损伤。

关键词： Humanin 鱼藤酮多巴胺神经元线粒体

类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统的Hcp1蛋白转位介导多核巨细胞形成

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陆军军医大学学报 2024年第15期46卷 1721-1728页

作者：吴潘饶承龙南栋琪陈建高张子元刘文正王民洋闫晶敏李倩毛旭虎陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)创伤与化学中毒全国重点实验室重庆400038

目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulatory protein 1,Hcp1)在感染宿主细胞引起多核巨细胞(multinucleated giant cells,MNGC)形成的作用及机制。方法分别采用同源重组和质粒回补技术构建类鼻疽... 详细信息

目的探讨类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白1(hemolysin coregulatory protein 1,Hcp1)在感染宿主细胞引起多核巨细胞(multinucleated giant cells,MNGC)形成的作用及机制。方法分别采用同源重组和质粒回补技术构建类鼻疽菌hcp1基因缺失株(BPC006Δhcp1)和缺失回补株(BPC006Δhcp1::hcp1);分别用类鼻疽菌BPC006野生株、BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1感染RAW264.7细胞,通过激光共聚焦分析Hcp1蛋白的定位情况;在293T细胞中转染Hcp1真核表达载体后进行细胞质膜分离进一步验证定位情况;在细胞感染模型上,通过吉姆萨染色检测抗Hcp1多克隆抗体封闭对MNGC形成的影响,探究Hcp1在类鼻疽菌感染导致的MNGC形成中的作用和生物学意义。结果Western blot检测结果显示BPC006Δhcp1不表达Hcp1蛋白,而BPC006Δhcp1::hcp1能恢复Hcp1蛋白的表达,成功构建类鼻疽菌BPC006Δhcp1和BPC006Δhcp1::hcp1。细胞免疫荧光共定位实验和质膜分离实验都表明Hcp1可以定位在宿主细胞膜上,且相较于对照组抗Hcp1多克隆抗体能抑制类鼻疽菌感染所诱导的MNGC形成(P<0.01)。结论类鼻疽菌感染RAW264.7细胞时Hcp1可转位至细胞膜,并在MNGC形成中发挥重要作用。

关键词：类鼻疽伯克霍尔德菌 Hcp1 多核巨细胞基因缺失与回补

类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白的重组表达及其免疫学特性研究

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陆军军医大学学报 2024年第15期46卷 1713-1720页

作者：南栋琪文远陈建高饶承龙吴潘张子元王施韦闫晶敏李倩毛旭虎陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)创伤与化学中毒全国重点实验室重庆400038

目的重组表达类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白,制备多克隆抗体并鉴定其免疫学性质。方法利用pET-28a表达系统在Eschericahia coli(***)BL21(DE3)中重组表达BipD蛋白,通过His Trap亲和层析纯化获得rBipD蛋白,免疫BALB/c小鼠获得rBipD多克... 详细信息

目的重组表达类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统BipD蛋白,制备多克隆抗体并鉴定其免疫学性质。方法利用pET-28a表达系统在Eschericahia coli(***)BL21(DE3)中重组表达BipD蛋白,通过His Trap亲和层析纯化获得rBipD蛋白,免疫BALB/c小鼠获得rBipD多克隆抗体;分别用兔抗类鼻疽菌血清和类鼻疽菌感染阳性患者血清进行Western blot实验检测rBipD的免疫反应性;通过Western blot及免疫荧光染色检测鉴定rBipD的免疫原性;以rBipD建立间接ELISA检测临床类鼻疽患者血清抗体。结果成功构建pET-28a-BipD重组质粒并转化至*** BL21(DE3)中诱导表达、纯化获得了相对分子质量约为36×10^(3)的rBipD蛋白,纯度约为95.4%。rBipD蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。免疫小鼠可产生特异性抗体,制备鼠抗rBipD多克隆抗体,效价达1∶512000。5.0μg/mL rBipD蛋白可与类鼻疽患者血清发生免疫反应,而不与结核患者血清发生免疫反应,差异有统计学意义(P免疫学活性的rBipD蛋白及其多克隆抗体,为其用于临床免疫学诊断和类鼻疽菌感染免疫机制研究提供了良好的工具。

关键词：类鼻疽伯克霍尔德菌 BipD蛋白重组表达抗体制备