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南方医科大学学报 2024年第10期44卷 1866-1873页

作者：郗雪艳邓婷杜伯雨湖北医药学院基础医学院免疫教研室湖北十堰442000

目的探究人结直肠成纤维细胞(CCD18-Co)条件培养基对结直肠癌(CRC)细胞恶性进展的影响,为CRC治疗提供思路。方法利用RTCA、克隆形成和创伤愈合实验测定CRC细胞增殖、克隆形成和迁移能力;Western blotting检测CCD18-Co-CM激活的CRC细胞AT... 详细信息

目的探究人结直肠成纤维细胞(CCD18-Co)条件培养基对结直肠癌(CRC)细胞恶性进展的影响,为CRC治疗提供思路。方法利用RTCA、克隆形成和创伤愈合实验测定CRC细胞增殖、克隆形成和迁移能力;Western blotting检测CCD18-Co-CM激活的CRC细胞ATK、ERK和STAT3信号通路,同时检测相应信号通路阻断后CRC细胞增殖、克隆形成和迁移能力;肿瘤球形成实验检测CCD18-Co-CM对CRC细胞成球能力的影响;RT-PCR方法检测CRC细胞干性标志物的表达情况。结果CCD-18Co-CM能够促进CRC细胞的增殖、克隆形成和迁移能力(P<0.05)。CCD-18Co-CM能够增强CRC细胞的成球能力及干性标志物的表达(P<0.05)。CCD-18Co-CM能够激活CRC细胞ERK信号通路(P<0.05),ERK信号通路抑制剂SCH772984能够降低CRC细胞增殖、克隆形成和迁移能力及成球能力和干性标志物的表达(P<0.05)。结论人正常结直肠成纤维细胞可通过激活ERK通路促进CRC细胞的恶性进展。

关键词：结直肠成纤维细胞结直肠癌干性 ERK

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白血病抑制因子通过调控CD44的表达增强结直肠癌细胞干性特征

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中国病理生理杂志 2024年第10期40卷 1826-1833页

作者：邱芬郗雪艳杜伯雨湖北医药学院基础医学院免疫教研室湖北十堰442000

目的:探讨白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)通过调控肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)分子标志物CD44的表达增强结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞干性特征的分子机制。方法:利用TCGA公共数据库和RNAscope原位杂交方法分析LIF基因在CRC组织中的表达情况;应用慢病毒感染系统构建稳定敲减LIF的CRC细胞系(HCT116和Caco2细胞);实验分CRC细胞对照组、CRC细胞添加LIF组、CRC细胞敲减LIF对照组和CRC细胞敲减LIF组;应用干细胞成球实验、MTT、RTCA、平板集落及迁移实验检测LIF对CRC细胞的影响;应用RT-qPCR和Western blot检测LIF对CRC肿瘤球细胞干性相关标志物CD44和转录因子ELF3表达的影响;应用RT-qPCR检测敲减LIF后CD44剪接变异体的表达变化。结果:CRC组织中LIF的表达水平高于癌旁组织(P<0.01),且LIF高表达的CRC患者无病生存期缩短(P<0.05),外源性LIF可增强CRC细胞的成球、增殖和迁移能力(P<0.05),敲减LIF可抑制CRC细胞的增殖和迁移(P<0.05)。外源性LIF可上调CRC肿瘤球细胞CD44的表达(P<0.05),而敲减LIF可抑制CD44的表达(P<0.01),同时CD44剪接变异体的转录水平降低。外源性添加LIF和敲减LIF可分别增强和降低转录因子ELF3的表达水平(P<0.05)。结论:LIF通过上调转录因子ELF3,增强CRC细胞CD44的表达,进而增强CRC细胞的干性特征,促进CRC细胞的恶性进展。

关键词：白血病抑制因子结直肠癌干性 CD44 ELF3

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结直肠成纤维细胞通过激活ERK信号通路促进结直肠癌细胞的恶性生物学行为

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南方医科大学学报 2024年

作者：郗雪艳邓婷杜伯雨湖北医药学院基础医学院免疫教研室

目的探究人结直肠成纤维细胞（CCD18-Co）条件培养基对结直肠癌（CRC）细胞恶性进展的影响，为CRC治疗提供思路。方法利用RTCA、克隆形成和创伤愈合实验测定CRC细胞增殖、克隆形成和迁移能力；Western blotting检测CCD18-Co-CM激活的... 详细信息

目的探究人结直肠成纤维细胞（CCD18-Co）条件培养基对结直肠癌（CRC）细胞恶性进展的影响，为CRC治疗提供思路。方法利用RTCA、克隆形成和创伤愈合实验测定CRC细胞增殖、克隆形成和迁移能力；Western blotting检测CCD18-Co-CM激活的CRC细胞ATK、ERK和STAT3信号通路，同时检测相应信号通路阻断后CRC细胞增殖、克隆形成和迁移能力；肿瘤球形成实验检测CCD18-Co-CM对CRC细胞成球能力的影响；RT-PCR方法检测CRC细胞干性标志物的表达情况。结果 CCD-18CoCM能够促进CRC细胞的增殖、克隆形成和迁移能力（P<0.05）。CCD-18Co-CM能够增强CRC细胞的成球能力及干性标志物的表达（P<0.05）。CCD-18Co-CM能够激活CRC细胞ERK信号通路（P<0.05）,ERK信号通路抑制剂SCH772984能够降低CRC细胞增殖、克隆形成和迁移能力及成球能力和干性标志物的表达（P<0.05）。结论人正常结直肠成纤维细胞可通过激活ERK通路促进CRC细胞的恶性进展。

关键词：结直肠成纤维细胞结直肠癌干性 ERK

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PIM1调节氧化低密度脂蛋白诱导的ApoE^(-/-)小鼠血管平滑肌细胞表型转化

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中国病理生理杂志 2024年第10期40卷 1854-1863页

作者：付萌萌钟耕瑞徐梦琪王小波王汉琴湖北医药学院附属随州医院转化医学研究中心湖北随州441300 湖北医药学院基础医学院解剖学教研室湖北十堰442000

目的:探讨莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒整合位点1(PIM1)在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的ApoE^(-/-)小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化中的作用及机制。方法:8周龄ApoE^(-/-)雄性小鼠18只随机分为普通饮食组和高脂饮食组,每组9只。16周... 详细信息

目的:探讨莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒整合位点1(PIM1)在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的ApoE^(-/-)小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化中的作用及机制。方法:8周龄ApoE^(-/-)雄性小鼠18只随机分为普通饮食组和高脂饮食组,每组9只。16周后取主动脉,HE染色观察内膜变化,Western blot法和免疫荧光法检测PIM1、VSMC表型相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌蛋白22α(SM22α)、骨桥蛋白(OPN)和CD68表达。体外用oxLDL(50 mg/L)诱导原代培养的ApoE^(-/-)小鼠主动脉平滑肌细胞表型转化,分别用PIM1特异性抑制剂SMI-4a、PIM1小干扰RNA(siPIM1)、糖酵解小分子抑制剂3-(3-吡啶基)-1-(4-吡啶基)-2-丙烯-1-酮(3PO)进行干预。用Western blot法和免疫荧光法检测PIM1和平滑肌表型相关蛋白的表达;用Western blot法检测糖酵解酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)和己糖激酶2(HK2)表达,用乳酸测试盒检测VSMC上清乳酸分泌变化。结果:高脂饮食ApoE^(-/-)小鼠主动脉HE染色可见动脉粥样斑块形成。免疫荧光可见PIM1蛋白和合成表型蛋白OPN高表达在内膜下斑块组织内,收缩表型蛋白α-SMA主要分布在血管壁中膜层。主动脉壁Western blot结果显示,与普通饮食组相比,高脂饮食组PIM1蛋白表达显著增加(P<0.01),同时收缩表型蛋白(α-SMA和SM22a)表达显著减少,合成表型蛋白(OPN和CD68)表达显著增加(P<0.01)。体外细胞实验结果显示,oxLDL显著减少VSMC中α-SMA和SM22a表达,增加OPN和CD68表达(P<0.05或P<0.01),同时显著上调PIM1蛋白表达(P<0.01),增加糖酵解酶PFKFB3和HK2表达(P<0.05),伴随VSMC乳酸分泌水平升高(P<0.01)。SMI-4a处理和siPIM1转染VSMC,显著减弱了oxLDL以上诱导效果(P<0.05或P<0.01)。3PO显著抑制了oxLDL上调的糖酵解水平,同时抑制VSMC向合成表型的转化(P<0.05或P<0.01)。结论:PIM1高表达在ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块中。VSMC表型转化与PIM1表达水平有关。oxLDL增加PIM1表达诱导VSMC由收缩表型向合成表型转化。糖酵解参与了这一过程。

关键词： PIM1蛋白血管平滑肌细胞表型氧化低密度脂蛋白

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钩毛茜草素C靶向cathepsin D诱导自噬体积累抑制胃癌的作用研究

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中国中药杂志 2024年

作者：张亮陈俊杰顾曼香钟一帆司渊刘莹湖北医药学院基础医学院湖北医药学院武当特色中药研究湖北省重点实验室湖北医药学院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室

探讨钩毛茜草素C（RuC）抑制胃癌的分子机制。选取AGS和MGC803细胞株作为细胞模型。用不同浓度的RuC处理细胞后，通过CCK-8法、实时无标记细胞分析技术（RTCA）和克隆形成实验检测RuC对胃癌细胞增殖能力的影响；透射电镜检测亚细胞结构... 详细信息

探讨钩毛茜草素C（RuC）抑制胃癌的分子机制。选取AGS和MGC803细胞株作为细胞模型。用不同浓度的RuC处理细胞后，通过CCK-8法、实时无标记细胞分析技术（RTCA）和克隆形成实验检测RuC对胃癌细胞增殖能力的影响；透射电镜检测亚细胞结构变化；免疫荧光技术检测LC3荧光聚点；吖啶橙染色法检测细胞内溶酶体状态；蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3II、P62的表达及溶酶体组织蛋白酶D（CTSD）的表达；SuperPred在线预测与RuC结合的靶点蛋白；通过分子对接分析RuC与CTSD的作用位点；采用靶点稳定性药物亲和反应实验检测RuC与CTSD的直接结合作用。结果发现，RuC在低浓度剂量下能够显著抑制胃癌细胞的增殖及克隆形成，RuC对AGS和MGC803细胞24 h半数抑制浓度分别为3.422、2.697 μmol·L-1。1.0、2.0、3.0 μmol·L-1RuC处理24 h后，AGS细胞克隆形成率分别为61.0%±1.5%、28%±0.5%、18.2%±0.5%，MGC803细胞克隆形成率分别为56.0%±0.5%、23.3%±1.0%、11.8%±1.0%，均明显减少。透射电镜检测显示RuC促进胃癌细胞自噬体增加；免疫荧光检测显示胃癌细胞LC3荧光聚点随RuC剂量增加。RuC上调胃癌细胞自噬相关蛋白LC3II、P62的表达。吖啶橙染色表明RuC可致溶酶体酸性环境改变。SuperPred在线预测发现CTSD是RuC的潜在靶点蛋白。蛋白免疫印迹分析发现RuC诱导胃癌细胞中CTSD的非活性前体表达上调。CTSD活性检测表明RuC可降低CTSD的活性。分子对接模拟发现RuC与CTSD的底物结合区域结合，与其中的Tyr205、Asp231氨基酸残基形成氢键。微量热泳动实验、靶点稳定性的药物亲和反应实验进一步确证RuC与CTSD具有直接结合作用。综上表明，RuC通过靶向结合下调CTSD表达而抑制溶酶体活性，进而诱导胃癌细胞自噬体积累。

关键词：钩毛茜草素C 胃癌 cathepsin D 自噬体自噬

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CaMK4对狼疮性肾炎患者外周血中γδT细胞功能的影响

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中国免疫学杂志 2024年第10期40卷 2158-2162页

作者：王钟毓王洋彬雷飞飞李刚郗雪艳李方舟湖北医药学院第一临床医学院十堰442000 湖北医药学院附属人民医院十堰442000 湖北医药学院基础医学院十堰442000 湖北医药学院生物医药研究院十堰442000

目的:本文探讨钙/钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK4)对LN患者外周血中γδT细胞功能的影响。方法:流式细胞术比较LN患者及健康对照组外周血中γδT细胞的比例,磁珠分选LN患者和健康对照组外周血中的γδT细胞,RNA-SEQ分析两组中γδT细胞的... 详细信息

目的:本文探讨钙/钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK4)对LN患者外周血中γδT细胞功能的影响。方法:流式细胞术比较LN患者及健康对照组外周血中γδT细胞的比例,磁珠分选LN患者和健康对照组外周血中的γδT细胞,RNA-SEQ分析两组中γδT细胞的差异基因。Real-time PCR和Western blot验证差异基因CaMK4的表达水平,流式细胞术检测CaMK4抑制剂处理后γδT细胞表面CD80,CD86和CD40L的表达水平,ELISA检测CaMK4抑制剂处理后γδT细胞分泌IL-17的水平。结果:LN患者外周血中γδT细胞的比例低于健康对照组(P<0.05)。RNA-SEQ测序共筛选出28个与LN有关的差异基因,其中CaMK4在LN患者和健康对照者间差异显著。LN患者外周血中γδT细胞经过CaMK4阻断剂KN-93处理后,表面共刺激分子CD80、CD86和CD40L的表达下降、分泌的IL-17水平也下降(P<0.01)。结论:CaMK4通过调控γδT细胞分泌IL-17和共刺激分子表达参与LN发病,抑制CaMK4或可成为治疗LN的新靶点。

关键词： γδT细胞狼疮性肾炎 CaMK4 IL-17

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青蒿素及其纳米制剂抗肺癌研究进展

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中药药理与临床 2024年

作者：李童斐韩文雅任涛王骁唐以军王梅芳湖北医药学院附属十堰市太和医院呼吸与危重症医学科湖北医药学院基础医学院药理教研室湖北医药学院天然药物纳米制剂研究十堰市重点实验室

肺癌的治疗策略主要包括手术切除、化疗及免疫治疗。化疗是重要手段，其在早期干预及术后辅助治疗中都有重要的临床意义。天然药物来源广，其中一些有强效的抗肿瘤活性，但机制未明。提取于黄花蒿的青蒿素因其特有的氧桥结构被应用在抗... 详细信息

肺癌的治疗策略主要包括手术切除、化疗及免疫治疗。化疗是重要手段，其在早期干预及术后辅助治疗中都有重要的临床意义。天然药物来源广，其中一些有强效的抗肿瘤活性，但机制未明。提取于黄花蒿的青蒿素因其特有的氧桥结构被应用在抗疟疾及抗肺癌中。部分学者也尝试解析青蒿素及其纳米制剂的作用靶标和机制，这成为近年的研究热点。本文从天然药物青蒿素及其衍生药物在抗肺癌中的研究切入，总结了青蒿素类药物主要通过促进铁内流、激活胞内ROS以杀伤肺癌细胞。此外，本文还进一步对现有的青蒿素类药物的纳米剂型进行了归纳，分析了青蒿素纳米药剂的主要类型及其在治疗肺癌中的优势。青蒿素及其衍生物和纳米制剂抗肺癌涉及的机制较为复杂，主要与调控细胞凋亡、促进DNA损伤、激活细胞自噬、诱导铁死亡等有关。此外，药物还参与调控肺癌微环境中免疫细胞的表型及功能，但其作用靶标及分子机制仍未被完全揭示。本文旨在为青蒿素类药物及其纳米剂型介导的抗肺癌治疗提供系统性的理论支持。

关键词：肺癌青蒿素纳米制剂化疗免疫微环境

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微管相关蛋白1轻链3β在胃癌中的作用及相关机制研究

微管相关蛋白1轻链3β在胃癌中的作用及相关机制研究

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作者：邢文凤湖北医药学院

学位级别：硕士

背景:胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一,全球范围内其发病率和死亡率在所有癌症中分别位居第五位和第四位,在我国癌症死亡率排名中更是高居第三。尽管以手术、放疗和化疗为主的综合治疗手段已取得一定疗效,但胃癌患者的预后仍然堪忧。... 详细信息

背景:胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一,全球范围内其发病率和死亡率在所有癌症中分别位居第五位和第四位,在我国癌症死亡率排名中更是高居第三。尽管以手术、放疗和化疗为主的综合治疗手段已取得一定疗效,但胃癌患者的预后仍然堪忧。深入探究胃癌可能的发病机制,寻找生物标志物用于评估预后和指导治疗,已成为一项紧迫的任务。微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)是一种自噬标志物。研究发现其与多种肿瘤进展相关,但确切作用和功能仍存在争议。LC3B不仅能作为促癌因子参与肿瘤进展,还可能在某些肿瘤中发挥抑癌作用。同时LC3B在胃癌中的表达情况尚未有定论,且具体作用机制至今仍不明确。因此,研究LC3B在胃癌中的表达及其对胃癌增殖、迁移、侵袭的作用,探索相关机制,为LC3B成为可能的分子靶点提供一定的理论基础。目的:基于单细胞测序技术解析LC3B在胃癌中的表达及其与患者预后的关系,并探究LC3B对胃癌细胞生物学行为的影响及LC3B促进胃癌发展的机制。方法:选用3对胃癌及配对的癌旁组织样本行单细胞转录组测序(sc RNA-seq)。Cell Typist对过滤后的单细胞表达数据进行亚群分类。使用Wilcoxon rank-sum对测序数据进行拟时序分析,探究不同细胞簇中LC3B的差异表达。通过癌症基因组图谱(TCGA)及免疫组织化学技术(IHC)分析LC3B在胃癌组织中的表达。采用Kaplan-Meier法行生存分析。采用Cox比例风险回归模型确定影响胃癌患者预后的独立因素。采用实时定量反转录聚合酶链(RT-q PCR)技术分析胃癌细胞系中LC3B的表达水平。构建LC3B过表达和敲低后的胃癌细胞模型,利用此模型,采用细胞活性实验(CCK-8)、Transwell实验、划痕实验、克隆形成实验检测LC3B表达改变后,胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的变化。采用LC3B过表达后的细胞进行免疫共沉淀(Co-IP)及银染实验。利用质谱分析(MS)筛选与LC3B相互作用的蛋白,并确定差异表达的下游基因。采用RT-q PCR及蛋白印迹(WB)检测LC3B基因过表达或敲减后对下游靶基因——核糖体蛋白S7(RPS7)表达水平的影响。采用基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对LC3B的功能及相关通路行富集分析。结果:Sc RNA-seq分析结果显示,LC3B在胃癌组织中的表达量高于癌旁组织且LC3B在内皮细胞中表达量高于其余细胞亚群(P<0.001)。TCGA和IHC分别从转录和蛋白表达层面证明了胃癌组织中LC3B高表达(P<0.01)。生存分析表明,LC3B高表达的胃癌患者总体生存时间短于LC3B低表达的患者[风险比(HR)=4.143,95%可信区间(CI):2.352～7.298,P<0.05]。多因素Cox回归分析显示,LC3B为总生存期相关的危险因素(HR=4.966,95%CI:2.241～11.005,P<0.01)。CCK8、Transwell迁移及侵袭实验、划痕实验、克隆形成实验检测分析发现,过表达LC3B后胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力高于空载体组,抑制LC3B表达后,胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力低于空载体组(P<0.05)。通过Co-IP、银染,联合MS筛选出LC3B的下游基因RPS7。在胃癌细胞HGC-27中过表达LC3B后,通过RT-q PCR和WB实验分析结果显示,RPS7的m RNA和蛋白水平明显增加(P<0.05);在胃癌细胞NUGC-3中敲低LC3B后,RPS7的m RNA和蛋白水平明显降低(P<0.05)。富集分析结果显示LC3B基因的功能和通路富集在核糖体相关的信号通路中(P<0.001)。结论:LC3B在胃癌中高表达并促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制可能是通过上调RPS7干预核糖体相关功能。综上,LC3B是胃癌潜在的诊断及干预治疗靶点。

关键词：胃癌单细胞测序自噬微管相关蛋白1轻链3β 核糖体蛋白S7

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H3K18la乳酸化修饰调控PDL1在艾司氯胺酮促进小鼠乳腺癌生长机制中的研究

H3K18la乳酸化修饰调控PDL1在艾司氯胺酮促进小鼠乳腺癌生长机制...

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作者：徐顺虎湖北医药学院

学位级别：硕士

背景:乳腺癌（Breast cancer,BC）已成为全球第一大癌症,手术是主要的治疗方法,但围术期手术和麻醉因素可影响免疫功能,从而对肿瘤细胞生长及转移产生影响。关于麻醉药的免疫调节作用其机制涉及多个免疫调节分子,其中程序性死亡配体1（P... 详细信息

背景:乳腺癌（Breast cancer,BC）已成为全球第一大癌症,手术是主要的治疗方法,但围术期手术和麻醉因素可影响免疫功能,从而对肿瘤细胞生长及转移产生影响。关于麻醉药的免疫调节作用其机制涉及多个免疫调节分子,其中程序性死亡配体1（Programmed cell death 1 ligand 1,PDL1）是一种重要的免疫检查点蛋白,近年来已受到重视。它表达于肿瘤细胞表面,可与T细胞上的程序性死亡受体1（PD1）相结合,通过减少T细胞的增殖和活性来抑制T细胞杀死肿瘤细胞,从而发挥免疫逃避作用,与肿瘤生长与转移密切相关。组蛋白乳酸化修饰（Histone lactylation,Kla）是一种新的蛋白质翻译后修饰方式,其H3K18la修饰位点已被证明参与多种肿瘤生长增殖等恶性生物学行为,但与PDL1之间关系尚不清楚。艾司氯胺酮（Esketamine,ES）是氯胺酮的右旋异构体,其对N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）的亲和力较氯胺酮更强,已代替氯胺酮成为临床静脉麻醉药物,然而关于艾司氯胺酮对肿瘤细胞PDL1以及生长、转移等免疫调节的影响鲜有报道。目的:探究艾司氯胺酮对乳腺癌细胞PDL1是否具有调节作用及其可能的机制。方法:体外实验:选取BALB/c小鼠表达萤火虫荧光素酶基因的乳腺癌4T1-LUC细胞进行体外细胞实验。首先在体外培养4T1-LUC细胞,使用CCK-8法检测不同浓度的艾司氯胺酮对4T1-LUC细胞干预48h的细胞活性影响,探究艾司氯胺酮对细胞毒性IC50,以找到最佳药物干预浓度;使用乳酸检测试剂盒检测艾司氯胺酮、鱼藤酮（氧化呼吸链抑制剂）、草氨酸钠（LDHi）干预下4T1-LUC细胞胞内乳酸浓度;使用不同浓度艾司氯胺酮、外源性乳酸干预4T1-LUC细胞;使用鱼藤酮（升高乳酸）、草氨酸钠（降低乳酸）以及P300抑制剂A485干预4T1-LUC细胞;通过West ern Blot实验、免疫荧光实验检测肿瘤细胞PDL1蛋白表达量,检测乳酸化修饰蛋白H3K18la蛋白表达量,检测m6A修饰调节因子METTL14、IGF2BP3蛋白表达量;使用si RNA沉默4T1-LUC细胞METTL14、IGF2BP3基因,检测肿瘤细胞PDL1蛋白表达量。体内实验:选取SPF（specific pathogen-free）级健康雌性BALB/c小鼠,5-6周龄,体重16-18g。将BALB/c小鼠同源性4T1-LUC细胞接种到小鼠乳腺上构建肿瘤移植模型,待成瘤一周后将小鼠分为CON组、ES组、ES+LDHi组,ES组小鼠每日腹腔注射100mg/kg艾司氯胺酮模拟围术期麻醉用药,CON组每日腹腔注射等量生理盐水,ES+LDHi组在每日腹腔注射艾司氯胺酮基础上腹腔注射草氨酸钠750mg/kg。连续给药14天,每两天使用数字游标卡尺和电子秤测量并记录小鼠肿瘤大小与体重,在第14天对小鼠进行生物发光活体成像监测肿瘤生长与转移。成像完成后处死小鼠并收集外周静脉血、乳腺原位瘤。使用乳酸检测试剂盒检测小鼠血清、肿瘤组织内乳酸浓度,使用Western Blot检测肿瘤组织PDL1、H3K18a、METTL14、IGF2BP3蛋白表达量。结果:***-8实验结果显示,ES 0.1组、ES 1组、ES 10组对4T1-LUC细胞的活性均无明显影响（P>0.05）,ES对细胞毒性IC50浓度在200-400μg/m L之间。2.乳酸检测、Western Blot及免疫荧光结果显示,IC50以下浓度的ES可以剂量依赖性升高细胞内乳酸浓度（P<0.01）、PDL1（P<0.05）以及H3K18la蛋白量（P<0.0001）,ES+LDHi干预后乳酸浓度（P<0.01）、PDL1（P<0.0001）以及H3K18la（P<0.05）蛋白量显著下降。3.乳酸检测、Western Blot结果显示,与CON组相比,外源性乳酸Lac组PDL1（P<0.0001）、H3K18la（P<0.05）蛋白表达量以剂量依赖性显著升高;Rotenone组的胞内乳酸水平（P<0.0001）、PDL1（P<0.0001）、H3K18la（P<0.0001）蛋白的表达量显著升高;Oxamate组的胞内乳酸水平（P<0.001）、PDL1（P<0.0001）、H3K18la（P<0.0001）蛋白的表达量则显著降低;Lac 1+A485组PDL1（P<0.0001）、H3K18la（P<0.0001）蛋白水平显著下降。*** Blot结果显示,与CON组相比,外源性乳酸Lac组METTL14、IGF2BP3蛋白的表达量以剂量依赖性显著升高;Lac 1+A485组METTL1

关键词：乳腺癌艾司氯胺酮 PDL1 乳酸组蛋白乳酸化修饰

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PPP2CB通过LOX-1/MAPK/ERK轴促进动脉粥样硬化中的肝脂累积

PPP2CB通过LOX-1/MAPK/ERK轴促进动脉粥样硬化中的肝脂累积

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作者：安贺湖北医药学院

学位级别：硕士

背景:心血管疾病是全球范围内死亡率最高的疾病,动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)斑块引起的血管阻塞是心血管疾病发作的常见原因,其中血脂异常是AS斑块形成的物质基础;血脂异常包括总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇增加以及高... 详细信息

背景:心血管疾病是全球范围内死亡率最高的疾病,动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)斑块引起的血管阻塞是心血管疾病发作的常见原因,其中血脂异常是AS斑块形成的物质基础;血脂异常包括总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇增加以及高密度脂蛋白胆固醇减少,是AS的独立危险因素。蛋白磷酸酶2(Protein phosphatase 2A,PP2A)是一种丝氨酸-苏氨酸磷酸酶,通过调节脂质代谢抑制内皮损伤及泡沫细胞形成,被视为AS的保护因子。蛋白磷酸酶2催化亚基β(Protein phosphatase 2 catalytic subunit beta,PPP2CB)作为PP2A催化亚基的重要亚型,既往研究显示其在阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD),膀胱癌以及胰腺癌等疾病的发展进程的发挥重要作用,目前在AS中的作用尚不明确。目的:探讨PPP2CB在AS脂质代谢中的作用及其分子机制。方法:(1)转录组差异基因的筛选:5例冠脉造影狭窄的患者及3例正常冠脉患者外周血转录组测序,筛选差异表达m RNA。(2)差异表达基因在外周血白细胞中验证:2019年6月-2023年1月在十堰市太和医院收集AS患者(308例)及健康志愿者(302例)外周血,归纳整理患者病历资料,记录患者的血脂水平,使用皮尔逊检测法对差异表达基因和血脂水平做相关性分析;通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)方法检测差异表达基因在外周血中差异表达情况。(3)体外研究:收集高脂血症患者外周血清,将血清样品混合在一起并通过22 nm过滤器过滤后作为混合高脂血清(Hyperlipidemic Serum,HS)使用。q RT-PCR及蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测HepG2,Huh7,LO2细胞受到HS刺激24h后PPP2CB的差异表达情况;构建PPP2CB过表达及敲低模型,油红-O及低密度脂蛋白吸收试验(LDL-uptake assay)检测细胞内脂质累积;Western Blot检测凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(Lectin-Like Oxidized Low-Density Lipoprotein Receptor 1,LOX-1)的表达情况;Western Blot检测改变PPP2CB和LOX-1表达后MAPK/ERK信号通路的激活情况;免疫荧光检测PPP2CB与LOX-1在细胞内的定位情况;免疫共沉淀(co-Inmunoprecipitation,co-IP)实验检测PPP2CB与LOX-1之间相互作用情况。结果:(1)疾病组(5例冠脉造影狭窄的患者)和对照组(3例正常冠脉患者)筛选出194个差异表达的基因,其中173个基因表达上调,21个基因表达下调(|log FC(fold change)|>0.5,P免疫荧光显示PPP2CB与LOX-1在细胞内的定位相同;co-IP证明PPP2CB与LOX-1二者之间存在相互作用。结论:PPP2CB通过与LOX-1相互作用,激活MAPK/ERK信号通路,促进肝细胞内的脂质累积及LDL摄取。PPP2CB有望成为AS疾病进程中有价值的生物标志物和有前景的治疗靶点,以改善当前AS的诊断和治疗策略。

关键词： PPP2CB LOX-1 脂质代谢 AS 肝细胞

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