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病毒感染与宿主抗感染免疫之间“博弈”——凋亡、坏死和焦亡分子机制

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 59-70页

作者：陈松彪刘飞飞尚珂余祖华何雷魏颖陈建张春杰程相朝丁轲洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室洛阳471003 河南科技大学功能微生物与畜禽健康实验室洛阳471003 动物病原与生物安全教育部重点实验室郑州450000

细胞死亡是宿主抗病毒感染免疫的重要组成部分,病毒感染可引起不同形式宿主细胞死亡,包括溶解性和非溶解性两种细胞死亡类型。这两种细胞死亡类型不仅能够消除病毒感染细胞,而且还能够利用炎症因子释放进一步促进宿主先天和适应性免疫... 详细信息

细胞死亡是宿主抗病毒感染免疫的重要组成部分,病毒感染可引起不同形式宿主细胞死亡,包括溶解性和非溶解性两种细胞死亡类型。这两种细胞死亡类型不仅能够消除病毒感染细胞,而且还能够利用炎症因子释放进一步促进宿主先天和适应性免疫进程。反之,病毒也发展出不同规避机制来抑制宿主细胞死亡进而促进自身感染。本文就病毒感染与宿主抗病毒感染免疫之间的“博弈”——凋亡、坏死和焦亡调控机制研究进展进行综述,旨在为深入理解病毒的分子致病机制以及开发新的抗病毒策略提供参考资料。

关键词：病毒宿主博弈凋亡坏死焦亡

mdv1-miR-M4-5p对MDCC-MSB1细胞增殖和凋亡的影响

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畜牧兽医学报 2024年

作者：余祖华高梦茹何雷魏颖陈建陈松彪丁轲河南科技大学动物科技学院功能微生物与畜禽健康实验室/动物疫病与公共卫生重点实验室洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南科技学院动物科技学院

为研究马立克病病毒(Marek 's disease virus， MDV)编码的mdv1-miR-M4-5p对MDCC-MSB1细胞增殖和凋亡的影响，将mdv1-miR-M4-5p模拟物、抑制物及其阴性对照转染MDCC-MSB1细胞后48 h，采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测细胞中mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2以及caspase-9、caspase-3、cyt-c、cyclinD1、Bcl-2等增殖和凋亡相关分子的转录；CCK-8检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果显示：与对照组相比，mdv1-miR-M4-5p模拟物转染显著上调了MDCC-MSB1细胞中mdv1-miR-M4-5p、cyclinD1、Bcl-2的转录水平，下调了TGF-β1、Smad2、cyt-c、caspase-9和caspase-3的表达，促进了细胞的增殖，减少了G1期细胞，增加了S和G2细胞，降低了细胞凋亡率。与对照组相比，mdv1-miR-M4-5p抑制物转染后MDCC-MSB1细胞的增殖、凋亡及其相关分子转录的结果与mdv1-miR-M4-5p模拟物转染后的结果相反。综上，Mdv1-miR-M4-5p可促进MDCC-MSB1细胞增殖，抑制其凋亡，这可能是通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路来实现的。

关键词： Mdv1-miR-M4-5p MDV 增殖凋亡 TGF-β1/Smad2

单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失对小鼠毒力和肠道菌群的影响

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浙江农林大学学报 2024年第1期41卷 161-168页

作者：牛俊辉李琦毛福超钱满贾艳艳丁轲张春杰程相朝廖成水河南科技大学动物科技学院功能微生物与畜禽健康实验室河南洛阳471023 河南科技大学洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南洛阳471023 河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室河南洛阳471023

【目的】探究单核细胞增生性李斯特氏菌Listeria monocytogenes tatD基因缺失对小鼠Mus musculus毒力和肠道菌群的影响,为tatD在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的作用及减毒疫苗研究提供参考。【方法】采用Bliss法将亲本菌株(LM1... 详细信息

【目的】探究单核细胞增生性李斯特氏菌Listeria monocytogenes tatD基因缺失对小鼠Mus musculus毒力和肠道菌群的影响,为tatD在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的作用及减毒疫苗研究提供参考。【方法】采用Bliss法将亲本菌株(LM10403s)、缺失菌株(LM10403sΔtatD)和互补菌株(LM10403sCΔtatD)口服感染小鼠,确定菌株对小鼠的半数致死量(LD_(50))。LM10403sΔtatD以1.00×10^(5) CFU口服免疫小鼠观察其免疫保护效果。将40只6周龄雌鼠随机平均分为对照即磷酸缓冲盐溶液组(PBS)、LM10403s组、LM10403sΔtatD组和LM10403sCΔtatD组,PBS组小鼠灌胃200μL无菌PBS,实验组分别灌胃200μL含1.00×10^(6) CFU的菌液。灌胃24 h后剖杀各组小鼠,收集肠道内容物,采用Illumina Hiseq测序技术测定各处理小鼠盲肠样品微生物16S rRNA V3-V4区序列,并比较分析其微生物群落结构、多样性和信号通路富集。【结果】LM10403sΔtatD的LD_(50)为8.11×10^(7) CFU,毒力低于LM10403s。同时LM10403sΔtatD口服免疫小鼠后对单核细胞增生性李斯特氏菌亲本菌株的攻毒能提供80%保护率。Chao1和Observed species指数显示:PBS与LM10403sΔtatD处理组差异不显著,但LM10403s组和LM10403sCΔtatD处理组相比于PBS处理组显著下降(P<0.05)。在门水平上,LM10403sΔtatD处理组的厚壁菌门Firmicutes相对丰度高于LM10403s和LM10403sCΔtatD处理组,而在属水平上,乳杆菌属Lactobacillus相对丰度高于LM10403s和LM10403sCΔtatD处理组。功能预测分析显示:LM10403s处理组在细胞过程、环境信息处理和新陈代谢等信号通路的富集程度高于LM10403sΔtatD处理组。【结论】tatD基因缺失后单核细胞增生性李斯特氏菌的毒力降低,并具有一定的免疫保护效果。tatD基因缺失菌株感染小鼠对肠道菌群失调影响减小,且有益菌增多。

关键词： tatD基因单核细胞增生性李斯特氏菌毒力 16S rRNA 肠道菌群

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鸡FGL2基因的克隆分析及原核表达

西北农林科技大学学报（自然科学版） 2024年第3期52卷 11-18,39页

作者：郭亚格刘佳隆齐志颖何雷贾艳艳陈建陈松彪廖成水丁轲余祖华洛阳市活载体生物材料与动物疫病重点实验室河南洛阳471003 河南科技大学动物科技学院功能微生物与畜禽健康实验室河南洛阳471003

【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-... 详细信息

【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2221)H_(3451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。

关键词：鸡 FGL2基因生物信息学分析原核表达

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细菌外膜囊泡结构、分泌特性及致病机制

畜牧兽医学报 2024年第3期55卷 971-983页

作者：高远集刘畅陈淼陈松彪张俊峰李静贾艳艳廖成水郭荣显丁轲余祖华尚珂河南科技大学动物科技学院/功能微生物与畜禽健康实验室洛阳471003 洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室洛阳471003 河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室洛阳471003 河南科技大学医学技术与工程学院洛阳471003

外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是革兰阴性菌在生长过程中释放到胞外的囊泡状结构,被认为是细菌的“远程武器”,其功能主要是攻击宿主组织并帮助细菌定植、损害宿主细胞功能、调节宿主的防御,因此OMVs在细菌致病过程中发挥着... 详细信息

外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是革兰阴性菌在生长过程中释放到胞外的囊泡状结构,被认为是细菌的“远程武器”,其功能主要是攻击宿主组织并帮助细菌定植、损害宿主细胞功能、调节宿主的防御,因此OMVs在细菌致病过程中发挥着重要作用。囊泡中的物质通过与细菌释放出的自诱导物化学信号分子结合,可以驱使细菌或者囊泡在内环境中发挥特殊功能,如群体感应、生物膜形成、获取营养、抗生素抗性、应激反应、对抗其它微生物的竞争或防御、微生物群落状态、核酸转移、水平基因转移、毒素和毒力因子的递送等,且在细菌生长周期发挥着不可或缺的作用。本文主要综述OMVs结构、分泌特性及其致病机制的最新研究进展,为深入研究细菌的致病机制以及开发新的抗菌策略提供理论指导。

关键词：细菌外膜囊泡结构分泌特性致病机制

抗菌肽PMAP-24KK水凝胶的制备及抗菌活性研究

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中国药学杂志 2024年第13期 1219-1225页

作者：毛付康范文琦路思阳王君辉王恩典崔靖靖王晓利牛明福廖成水河南科技大学功能微生物与畜禽健康实验室洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室河南科技大学基础医学与法医学院河南科技大学食品与生物工程学院

目的制备含猪源抗菌肽-24KK(porcine myeloid antimicrobial peptide-24KK,PMAP-24KK)的水凝胶，评价其理化性能和抗菌活性。方法将PMAP-24KK与海藻酸钠、碳酸钙和葡萄糖酸内酯结合得到PMAP-24KK水凝胶，首先分析PMAP-24KK水凝胶的形... 详细信息

目的制备含猪源抗菌肽-24KK(porcine myeloid antimicrobial peptide-24KK,PMAP-24KK)的水凝胶，评价其理化性能和抗菌活性。方法将PMAP-24KK与海藻酸钠、碳酸钙和葡萄糖酸内酯结合得到PMAP-24KK水凝胶，首先分析PMAP-24KK水凝胶的形成时间、溶胀率、含水率、保水率和释放率等理化性质，然后进行药敏试验测定其对细菌的体外抗菌活性、缓释和抗菌屏障以及对小鼠皮肤创伤愈合的效果。结果 PMAP-24KK水凝胶在2 min左右可以形成具有网状结构的凝胶态，溶胀率和含水率均在10 h达到平衡状态，分别为(158.83±3.26)%和(61.01±2.41)%,24 h的保水率和释放率约为55%和81%。PMAP-24KK水凝胶对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、猪霍乱沙门菌和鼠伤寒沙门菌表现出抑菌效果。PMAP-24KK水凝胶18 h内的缓释作用没有明显区别，18 h后开始逐渐下降至36 h无抗菌活性。PMAP-24KK水凝胶能有效地起到抗菌屏障作用，且有助于小鼠创伤模型皮肤伤口的愈合。结论本研究成功制备获得具有良好理化特性和抗菌活性的PMAP-24KK水凝胶，且具有较好的缓释和抗菌屏障以及促进伤口愈合的作用，为抗菌肽水凝胶应用的进一步研究奠定基础。

关键词：抗菌肽猪源抗菌肽-24KK 海藻酸钠水凝胶抗菌活性

口蹄疫病毒O型全自动磁微粒CLIA抗体定量检测方法的建立

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中国农业科学 2024年第4期57卷 810-819页

作者：包艳芳蒋韬何莉吕律李涛善李昕孙燕燕杨光魏婷潘晓乐林密兰州兽研生物科技有限公司中国农业科学院兰州兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室/国家口蹄疫参考实验室

【背景】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、烈性传染病，疫苗接种是预防临床口蹄疫的有效措施。免疫抗体水平监测则是评估疫苗免疫效果、制定免疫程序的重要依据，是免疫工作和疫情防控必不可少... 详细信息

【背景】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、烈性传染病，疫苗接种是预防临床口蹄疫的有效措施。免疫抗体水平监测则是评估疫苗免疫效果、制定免疫程序的重要依据，是免疫工作和疫情防控必不可少的关键环节，因此建立高效、快速、全自动的抗体检测方法具有重要意义。【目的】基于磁微粒(micromagnetic particles,MPs)化学发光免疫分析技术(CLIA)，建立一种新型、全自动、可定量的口蹄疫病毒O型抗体检测方法，为口蹄疫免疫监测和疫情防控提供技术支撑。【方法】使用纳米材料磁微粒为固相载体和分离载体包被捕获抗体，用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)标记检测抗体，经过条件优化建立了一种新型磁微粒CLIA检测方法(magnetic particle chemiluminescence immunoassay,MP-CLIA)。本方法首先加入磁微粒-兔抗偶联物(magnetic particle-polyclonal antibodies,MPs-p Abs)、待测样本、口蹄疫病毒O型抗原，37℃孵育；再加入适量酶标抗体(ALP-p Abs),37℃孵育；最后加入化学发光底物AMPPD，检测相对发光强度(relative light unit,RLU)。研究通过检测标准品拟合标准曲线，并应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)确定检测方法的判定标准；利用质控样本进行方法学评价，同时检测田间样本，并和液相阻断ELISA(LPB-ELISA)比对，验证临床检测效果。【结果】优化后最佳反应条件为磁微粒浓度0.25 mg·m L-1、口蹄疫病毒O型抗原1﹕1 000稀释、酶标抗体1﹕2 000稀释、加样量20μL。整个检测过程均在全自动化学发光免疫分析仪中完成，反应时间20 min，在抗体含量0—1 280 U(效价0—1﹕2 048)范围内标准曲线R2>0.99，可进行定量检测。该方法敏感性为94.66%；特异性为97.10%，检测口蹄疫A型、Asia I型血清型特异性为97.14%，与塞内卡病毒(SVV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、牛流行热病毒(BEFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、羊痘病毒(QRFV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体阳性血清无交叉反应；重复检测变异系数CV值疫病毒O型抗体定量检测方法，本方法对应的试剂盒已经完成中试生产和临床检测试验，在全国不同区域试用效果较好，具有较高的临床应用价值。

关键词：磁微粒化学发光免疫分析法口蹄疫磁微粒全自动化

IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响

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中国农业科学 2024年第7期57卷 1407-1416页

作者：张晓战董轩志吕楠楠刘懿雯马新甜王林青夏艳勋蒋增海郭运泽赵攀登宋予震杨德成边传周河南牧业经济学院动物医药学院郑州师范学院/分子生物学郑州市重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

【背景】塞内卡病毒（senecavirus A, SVA）是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区（untranslated region, UTR）中的内部核糖体进入位点（IRES）元件在病毒复制过程中发挥重要作用。... 详细信息

【背景】塞内卡病毒（senecavirus A, SVA）是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区（untranslated region, UTR）中的内部核糖体进入位点（IRES）元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年我国出现IRES核心区Domain II 12个碱基非连续插入的自然突变SVA毒株，在病毒复制和致病性方面存在明显改变。【目的】探讨IRES Domain II区域发生的突变对SVA的复制及细胞嗜性的影响，为进一步了解SVA致病机制奠定基础。【方法】以实验室前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础，通过定点突变的方式，逐步将其IRES Domain II核心区域308—317 nt的9个碱基（ACTCAAGCG）替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基（CACGCCTGCCGATAGACGATT），构建重组载体pHeN-1/2018-i12并进行了病毒拯救。随后，利用病毒基因组克隆测序、间接免疫荧光试验和Western blot试验对所拯救病毒进行鉴定，同时验证了IRES核心区12个碱基插入突变对SVA病毒体外复制能力和细胞嗜性的影响。【结果】将构建完成的重组载体pHeN-1/2018-i12转染细胞，盲传至P2代，获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的IRES突变病毒rHeN-1/2018-i12。病毒连续传代后测序结果表明rHeN-1/2018-i12遗传稳定，P5代病毒基因组序列未发生碱基突变，P10代病毒IRES区域没有出现突变现象。用低代次的突变病毒rHeN-1/2018-i12体外感染本体动物猪源细胞系PK-15和IBRS-2，及仓鼠源细胞系BHK-21，进行细胞感染试验，结果表明rHeN-1/2018-i12与亲本毒株rHeN-1/2018在PK-15、IBRS-2和BHK-21中均能导致明显的细胞病变，表现出相似的生长曲线趋势，表明IRES核心区Domain II 12个碱基突变不能够改变对上述细胞的嗜性；但SVA突变病毒和亲本株在不同细胞中的病变时间及病毒滴度上存在较大的差异，rHeN-1/2018-i12株在细胞中生长能力较其亲本株rHeN-1/2018差，诱使细胞病变的时间较晚，在感染24 hpi，两者病毒滴度相差可达10倍。【结论】本研究基于SVA反向遗传操作系统构建并拯救SVA IRES突变毒株，确定了IRES突变对SVA生物学特性的影响，有助于我们更好地了解SVA致病机制，拓宽我们对病毒IV型IRES功能的认识。

关键词：塞内卡病毒内部核糖体进入位点反向遗传操作系统病毒复制细胞嗜性

猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立

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中国畜牧兽医 2024年第7期51卷 3056-3066页

作者：欧云文潘琴汪洋代军飞任绍科张洋翟佳佳张杰开江县动物疫病预防控制中心达州636250 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室兰州730046 河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室秦皇岛066004

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段... 详细信息

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均材料。

关键词：猪圆环病毒3型(PCV3) Cap蛋白截短表达 ELISA