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PEG介导的广东虫草原生质体遗传转化体系建立及其应用

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广东农业科学 2024年第2期51卷 16-28页

作者：张成花黄虹程慧娇王刚正陈香女钟国瑞李泰辉邓旺秋广东省科学院微生物研究所/华南应用微生物国家重点实验室/广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070

【目的】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌,其营养成分丰富、活性功效显著,已获批新资源食品,产业化应用前景广阔。建立广东虫草原生质体制备及遗传转化方法,可为广东虫草新品种选育及基因功能研究提供参考依据。【方法】以广东虫草菌丝... 详细信息

【目的】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌,其营养成分丰富、活性功效显著,已获批新资源食品,产业化应用前景广阔。建立广东虫草原生质体制备及遗传转化方法,可为广东虫草新品种选育及基因功能研究提供参考依据。【方法】以广东虫草菌丝体为材料,采用单因素分析方法对原生质体制备过程中酶解组合、酶解时间、酶解温度、复苏培养基及抗性标记进行筛选。同时以潮霉素抗性标记质粒pCAMBIA1300为转化片段,采用单因素分析方法对PEG介导的原生质体转化过程中亚精胺浓度、PEG加入间隔时间、抗生素添加时间进行筛选。并以广东虫草中的锌指半胱氨酸转录因子CgPro1敲除片段为目的转化片段,对转化系统进行验证。【结果】广东虫草原生质体制备的最佳组合条件为:采用含有裂解酶+崩溃酶的混合酶体系(1∶1)对广东虫草的菌丝体进行酶解,且酶解温度28℃、酶解时间为5.5 h时原生质体得率最高;原生质体复苏过程中,TB3复苏培养基对广东虫草原生质体的复苏效果最好、其次为0.6mol/L KCl-PDA;PEG介导原生质体转化过程中,加入5 mmol/L亚精胺、PEG加入间隔时间10 min、原生质体复苏3 d后添加250μg/mL潮霉素抗性标记进行筛选,转化效率最高。此外,通过建立的转化系统获得3个CgPro1敲除突变株及3个杂合子,表型分析结果显示,该基因参与广东虫草子实体发育过程。【结论】建立了成熟的广东虫草原生质体制备及PEG介导的遗传转化体系,可为今后广东虫草基因功能、蛋白定位等遗传操作研究奠定良好基础,同时为广东虫草遗传育种提供重要应用参考。

关键词：广东虫草原生质体 PEG介导遗传转化基因敲除

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中国鬼笔属真菌的物种多样性与资源

菌物学报 2024年第3期43卷 60-69页

作者：李挺李泰辉邓旺秋广东省科学院微生物研究所、华南应用微生物国家重点实验室、广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070 西藏大学生态环境学院西藏拉萨850011

鬼笔属真菌是大型真菌的一个重要类群,具有重要的经济价值和分类学地位。我国是鬼笔类真菌物种多样性的中心区域之一,分布了约占世界已知鬼笔物种数量的1/4,但鬼笔属真菌的分类一直存在诸多问题。我国过去报道的鬼笔属物种32种,有些分... 详细信息

鬼笔属真菌是大型真菌的一个重要类群,具有重要的经济价值和分类学地位。我国是鬼笔类真菌物种多样性的中心区域之一,分布了约占世界已知鬼笔物种数量的1/4,但鬼笔属真菌的分类一直存在诸多问题。我国过去报道的鬼笔属物种32种,有些分类单元是存在争议的。本研究基于前人的研究和凭证标本,确定我国分布的鬼笔属真菌25种,其中17种有ITS分子序列,15种有LSU分子序列。有7种属于无分布种或待定种。本研究为鬼笔属真菌的分类学研究、栽培和鉴定提供参考。

关键词：竹荪属分类学食用菌栽培

Phomopsis tersa FS441聚酮杂萜类化合物生物合成基因启动子的鉴定

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生物技术通报 2024年

作者：刘玉萍张维阳章卫民叶伟李冬利五邑大学药学与食品工程学院广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室

【目的】Phomeroids为分离自海洋真菌Phomopsis tersa FS441的聚酮杂萜类新骨架化合物，具有良好的抗肿瘤活性。为便于后期对phomeroids生物合成关键基因萜类环化酶编码基因ctg1509和P450单加氧酶编码基因ctg1511进行转录调控，对其启... 详细信息

【目的】Phomeroids为分离自海洋真菌Phomopsis tersa FS441的聚酮杂萜类新骨架化合物，具有良好的抗肿瘤活性。为便于后期对phomeroids生物合成关键基因萜类环化酶编码基因ctg1509和P450单加氧酶编码基因ctg1511进行转录调控，对其启动子功能进行鉴定。【方法】对海洋真菌P. tersa FS441中ctg1509、ctg1511基因启动子p1509、p1511进行克隆，用荧光素酶报告基因载体分析启动子的转录活性，并进一步采用点板实验和生长曲线鉴定其在大肠杆菌中启动氨苄青霉素抗性基因转录的功能，采用PlantCARE数据库分析启动子的调控元件。【结果】p1509的启动子转录活性最强，其活性远强于阳性对照PgpdA启动子，p1509和p1511能在大肠杆菌中启动氨苄青霉素抗性基因的转录。p1509、p1511启动子区域除了含有CAAT-box、TATA-box核心元件，还有参与低温响应、光响应等顺式调控元件。【结论】验证了启动子p1509和p1511的功能。发掘了一个转录活性强于阳性对照的新型强启动子p1509，该启动子含有丰富的调控元件。

关键词：生物合成基因启动子转录活性 Phomopsis tersa 聚酮杂萜元件分析

黑曲霉RAF106 sakA基因的敲除及功能分析

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微生物学报 2024年第8期64卷 2684-2701页

作者：朱韵琦周刚刘通王颖思李素娟彭如群彭红施庆珊王洁谢小保广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室、广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070 华南农业大学食品学院广东广州510642

【目的】黑曲霉(Aspergillus niger)sakA基因是应激丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的重要成员,然而,在黑曲霉中,关于SakA的分子功能研究很少。本研究通过构建黑曲霉sakA缺失突变株探究SakA在黑曲霉中... 详细信息

【目的】黑曲霉(Aspergillus niger)sakA基因是应激丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的重要成员,然而,在黑曲霉中,关于SakA的分子功能研究很少。本研究通过构建黑曲霉sakA缺失突变株探究SakA在黑曲霉中的功能。【方法】以黑曲霉RAF106为出发菌株,通过农杆菌介导法构建突变株ΔsakA菌株。监测ΔsakA菌株与野生菌株在3种不同培养基上生长与产孢情况;研究ΔsakA菌株对不同逆境胁迫的敏感性变化;测定ΔsakA菌株的胞内外淀粉酶、果胶酶和纤维素酶酶活差异;qRT-PCR分析ΔsakA菌株产孢相关基因、淀粉酶相关基因、果胶酶相关基因、纤维素酶相关基因及高渗调节相关基因的相对转录水平。【结果】成功获得3株sakA缺失突变株ΔsakA菌株;发现ΔsakA菌株较野生菌株生长缓慢、产孢延迟及分生孢子梗分化延迟;ΔsakA菌株在0.6 mol/L KCl、0.8 mol/L NaCl和1.2 mol/L NaCl胁迫条件下,菌落生长均比野生型缓慢;ΔsakA菌株胞外淀粉酶产量提高20.68%-21.43%,胞内淀粉酶产量显著下降19.18%-20.26%;胞外果胶酶产量显著下降36.71%-38.30%,胞内果胶酶产量显著上升35.68%-36.53%;与野生菌株相比,ΔsakA菌株胞外纤维素酶产量显著下降28.04%-33.82%,而胞内纤维素酶产量显著上升15.28%-18.19%;产孢相关基因(fluG、sfgA、flbA、flbB、flbD、laeA、brlA、abaA、vosA、stuA和velB)的转录水平相较于野生菌株下调8.53%-90.87%;淀粉酶相关基因(amyC、amyD、amyE、amyF、amyG和amyH)及转录因子(amyR)下调8.87%-87.50%,果胶酶相关基因(aglB、lacA、pexB、pecA、pecC、pecB、endA、endC和poly)下调23.23%-84.01%,纤维素酶相关基因(xlnR、chbA、chbB和eglB)下调3.75%-81.02%,高渗调节相关基因(ena1、ena2、sho1、nik1、ypdl、pkA和hAD)下调5.27%-94.36%。【结论】sakA基因正向调控黑曲霉RAF106的产孢能力,是产孢过程中的重要基因,其缺失影响黑曲霉分生孢子的产生;在参与渗透压胁迫应答的同时对淀粉酶、果胶酶与纤维素酶的合成与分泌有重要作用。

关键词：黑曲霉 sakA基因丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路产孢渗透压代谢

废水急性毒性测定及评价中的不确定性研究及其改进方法

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生态毒理学报 2024年第1期19卷 262-274页

作者：林健辉吴欣颖赖伟李建威范雪滢卢嘉慧梅承芳杨旭楠广东省科学院微生物研究所广州510070 广东省微生物分析检测中心广州510070 华南应用微生物国家重点实验室广州510070 广东省菌种保藏与应用重点实验室广州510070

目前,我国针对废水处理及排放的环境影响评估体系逐渐向生物毒性综合指标完善,然而传统的评价方法可能存在错误的接受和错误的拒绝2种风险,根据“检测和校准实验室能力认可准则”(CNAS-CL01:2018)的要求,实验室在进行合格判定时,应考虑... 详细信息

目前,我国针对废水处理及排放的环境影响评估体系逐渐向生物毒性综合指标完善,然而传统的评价方法可能存在错误的接受和错误的拒绝2种风险,根据“检测和校准实验室能力认可准则”(CNAS-CL01:2018)的要求,实验室在进行合格判定时,应考虑相关的风险水平。为研究分析废水急性毒性评价中存在的风险,采用发光细菌法测试废水急性毒性,选取接近排放限值的制药废水样品,进行测量不确定度评定,并依据“产品几何量技术规范(GPS)工件的测量检验和测量设备第1部分:按规范检验一致性或不一致性的判定规则”(ISO 14253-1:2017)有关合格判定的思路,对废水急性毒性评价中的合格区、不确定区和不合格区进行研究。结果表明,废水急性毒性评价中,合格区、不确定区及不合格区会随着标准曲线|r|值和测量精密度的变化而变化,随着|r|值的降低或精密度的降低,合格区会变小,不确定区会变大,这导致了无法通过设置“保护带”的方法降低误判风险,对废水急性毒性评价的准确性造成了极大的影响。为准确开展废水急性毒性的测试与评价,可采用双样本t检验,通过比较废水样品的相对发光度与0.07 mg·L^(-1)氯化汞溶液的相对发光度来判断废水急性毒性是否合格,当废水样品的相对发光度≥0.07 mg·L^(-1)氯化汞溶液的相对发光度时,废水急性毒性合格,否则不合格。本研究通过开展方法的不确定度研究,阐明了现行国标分析方法及废水急性毒性评价方法存在的局限性,并提出了改进方案,为废水急性毒性的科学评判提供了重要依据。

关键词：废水急性毒性评价发光细菌法氯化汞毒性当量不确定区

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基于元素分析的污泥焚烧处置综合性评估

中国无机分析化学 2024年第4期14卷 418-428页

作者：范雪滢卢嘉慧林健辉杨旭楠梁嘉慧曾国驱广东省科学院微生物研究所广州510070 广东省微生物分析检测中心广州510070 华南应用微生物国家重点实验室广州510070 广东省菌种保藏与应用重点实验室广州510070

污泥的无害化处置和资源化利用是目前社会关注的重点,对污泥泥质的综合性评估是污泥处置和利用的前提。采用8个地区的出厂污泥,基于元素分析结果,综合考虑其碳排放量和风险性,对污泥“焚烧+灰渣利用”处置方式进行综合性评估。污泥的工... 详细信息

污泥的无害化处置和资源化利用是目前社会关注的重点,对污泥泥质的综合性评估是污泥处置和利用的前提。采用8个地区的出厂污泥,基于元素分析结果,综合考虑其碳排放量和风险性,对污泥“焚烧+灰渣利用”处置方式进行综合性评估。污泥的工业分析发现地区1、7、8污泥中的干基低位发热量均值分别为11.60、10.39和12.04 MJ/kg,有机物含量均值为53.98%、51.23%和54.97%,发热量和有机成分含量较高,发热量和有机成分存在显著正相关关系(P所占比例较大,3种元素之和约为总体的90%。从碳排放和风险性分析可得,地区1、7、8的碳补偿量分别为958.59、909.08和963.39 kgCO 2/t,碳补偿量较大,总碳排放量较小,但地区1污泥在采用制砖、水泥熟料处置时综合污染指数分别为0.72和0.71,在污染警戒范围(0.7~1.0)内。结果表明,地区1、7、8的出厂污泥宜采用“焚烧+灰渣利用”处置方式,但地区1污泥处置时需关注重金属污染风险。污泥的元素分析能为污泥的焚烧处置提供科学性指导。

关键词：元素分析污泥处置焚烧碳排放风险性分析

Gordonia sp.H52对合成孕激素左炔诺孕酮的降解特性

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微生物学通报 2024年第6期51卷 2127-2140页

作者：赖思华张晋娜邓通初王安国陈乐天许玫英华南农业大学生命科学学院广东广州510642 广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070 广东省环境保护微生物与区域生态安全重点实验室广东广州510070

【背景】合成孕激素左炔诺孕酮因其具有内分泌干扰效应而受到广泛关注,微生物在污染物降解和环境修复方面具有广泛的应用潜力,但目前对左炔诺孕酮在微生物降解中的特性和机理认识仍然有限。【目的】加速左炔诺孕酮污染的治理,亟须分离... 详细信息

【背景】合成孕激素左炔诺孕酮因其具有内分泌干扰效应而受到广泛关注,微生物在污染物降解和环境修复方面具有广泛的应用潜力,但目前对左炔诺孕酮在微生物降解中的特性和机理认识仍然有限。【目的】加速左炔诺孕酮污染的治理,亟须分离获取左炔诺孕酮的高效降解菌并探究其降解机制。【方法】以养殖场的废水为接种物,选育出对左炔诺孕酮具有高效降解功能的菌株;基于菌株形态特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析,确定菌株所属的分类层级;进而通过对左炔诺孕酮的降解动力学进行探究,同时结合菌株全基因组分析及降解产物谱图,确定菌株对左炔诺孕酮的降解特性。【结果】分离获得与Gordonia cholesterolivorans Chol-3的16S rRNA基因序列相似性达99.0%的Gordoniasp.H52,该菌株在18h内可以实现对0.5mg/L左炔诺孕酮的100%去除。液相色谱与串联质谱联用分析结果发现,菌株H52降解左炔诺孕酮后产生5种代谢产物,侧链炔基的裂解及脱羟基是该菌降解左炔诺孕酮的主要途径。该菌株还可以同时促进水体中多种合成孕激素的去除,使左炔诺孕酮的去除率由0%提高到91.06%、醋酸炔诺酮的去除率由37%提高到100%、孕二烯酮的去除率由0%提高到88.87%。【结论】Gordonia sp. H52对合成孕激素左炔诺孕酮表现出高效的降解特性,为合成孕激素污染水体的治理与修复提供了宝贵的菌种资源和理论参考。

关键词：合成孕激素左炔诺孕酮 Gordonia sp.H52 降解特性

土壤金属元素测量结果的不确定性与其关键影响因素

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环境工程学报 2024年

作者：林健辉卢嘉慧梁诗捷吴欣颖杨旭楠戴文举叶芳曾国驱广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省农业环境与耕地质量保护中心(广东省农业农村投资项目中心)

土壤检测是第三次全国土壤普查数据的核心来源，而由于测量误差的存在，导致测量结果具有不确定性，并影响结果的可靠性。为提高检测结果的质量水平，选取普查中的总铬、全锰、全铜、全锌、全镍、全钼、总镉和总铅指标开展不确定度评定... 详细信息

土壤检测是第三次全国土壤普查数据的核心来源，而由于测量误差的存在，导致测量结果具有不确定性，并影响结果的可靠性。为提高检测结果的质量水平，选取普查中的总铬、全锰、全铜、全锌、全镍、全钼、总镉和总铅指标开展不确定度评定，研究影响不确定度大小的关键因素。结果表明，土壤金属元素测量的关键不确定度分量来源于消解液的质量浓度ρ和测量重复性R。减小ρ引入的不确定度可通过设置合理的标准曲线线性范围，使ρ尽可能接近曲线最高点；使用相关系数r值高的标准曲线；使用更多的质量浓度点建立标准曲线和增加仪器信号采集次数等方法。减小R引入的不确定度可通过提高测量精密度。通过优化，土壤总镉的不确定度范围由（0.365±0.126） mg·kg-1（k=2）降低至（0.365±0.030） mg·kg-1（k=2），对于0.4 mg·kg-1的筛选值，不确定度的减小使土壤总镉在进行合格评价时得到更准确可靠的结果。该研究结果阐明了影响土壤金属元素测量的关键不确定度分量，为实验室有效控制土壤金属元素的测量不确定度，减小检测结果的分散性，提高检测结果的质量水平提供了理论参考。

关键词：土壤金属元素关键不确定度分量标准曲线校正测量重复性合格评价

产碱杆菌在水产养殖体系中的分布及其异养氨氧化特性

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微生物学通报 2024年第8期51卷 2870-2887页

作者：蒋天慧贾伟彬邓文芳黄友达杨山麦智源吴海珍许玫英华南理工大学生物科学与工程学院广东广州510006 广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070 广东省环境保护微生物与区域生态安全重点实验室广东广州510070

【背景】随着水产养殖集约化程度的不断提高,养殖水体环境中氮素污染及富营养化问题日益加剧,严重抑制自养型氨氧化菌的功能活性,因此深入解析产碱杆菌这类潜在的异养型氨氧化功能微生物在水产养殖系统中的分布特点及其氨氧化功能特性... 详细信息

【背景】随着水产养殖集约化程度的不断提高,养殖水体环境中氮素污染及富营养化问题日益加剧,严重抑制自养型氨氧化菌的功能活性,因此深入解析产碱杆菌这类潜在的异养型氨氧化功能微生物在水产养殖系统中的分布特点及其氨氧化功能特性对于解决氮素污染问题具有重要意义。【目的】调查研究水产养殖区域中产碱杆菌的分布情况,分离选育具有高效氮转化能力的产碱杆菌(Alcaligenes sp.),明确其氨氧化功能特性,为养殖尾水高效脱氮提供菌种资源和理论指导。【方法】通过16S rRNA基因高通量测序技术分析产碱杆菌在广东沿海四大水产养殖主产区中的分布情况,并从养殖鱼塘底泥样品中分离获得一株具有较强异养氨氧化能力的产碱杆菌CHO6,采用单因素分析法,探究菌株CHO6的异养氨氧化特性及其关键影响因素。【结果】广东沿海四大水产养殖主产区中广泛分布着产碱杆菌;从广州市养殖鱼塘底泥样品中分离得到的产碱杆菌CHO6能够在48 h内将10 mmol/L氨氮完全去除,其氨氧化能力优异且受到碳源、温度、pH、C/N、溶解氧、初始氨氮浓度等因素的影响。【结论】产碱杆菌的普遍存在表明其对水产养殖环境具有较强的适应性,产碱杆菌CHO6具有较强的氨氧化能力,能够耐受较高浓度的氨氮,可为水产养殖水体中的氮素去除提供功能菌种资源支持,对水产养殖尾水治理具有重要意义。

关键词：水产养殖异养氨氧化产碱杆菌 16S rRNA基因高通量测序