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PEG介导的广东虫草原生质体遗传转化体系建立及其应用

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广东农业科学 2024年第2期51卷 16-28页

作者：张成花黄虹程慧娇王刚正陈香女钟国瑞李泰辉邓旺秋广东省科学院微生物研究所/华南应用微生物国家重点实验室/广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070

【目的】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌,其营养成分丰富、活性功效显著,已获批新资源食品,产业化应用前景广阔。建立广东虫草原生质体制备及遗传转化方法,可为广东虫草新品种选育及基因功能研究提供参考依据。【方法】以广东虫草菌丝... 详细信息

【目的】广东虫草是我国特有珍稀食药用菌,其营养成分丰富、活性功效显著,已获批新资源食品,产业化应用前景广阔。建立广东虫草原生质体制备及遗传转化方法,可为广东虫草新品种选育及基因功能研究提供参考依据。【方法】以广东虫草菌丝体为材料,采用单因素分析方法对原生质体制备过程中酶解组合、酶解时间、酶解温度、复苏培养基及抗性标记进行筛选。同时以潮霉素抗性标记质粒pCAMBIA1300为转化片段,采用单因素分析方法对PEG介导的原生质体转化过程中亚精胺浓度、PEG加入间隔时间、抗生素添加时间进行筛选。并以广东虫草中的锌指半胱氨酸转录因子CgPro1敲除片段为目的转化片段,对转化系统进行验证。【结果】广东虫草原生质体制备的最佳组合条件为:采用含有裂解酶+崩溃酶的混合酶体系(1∶1)对广东虫草的菌丝体进行酶解,且酶解温度28℃、酶解时间为5.5 h时原生质体得率最高;原生质体复苏过程中,TB3复苏培养基对广东虫草原生质体的复苏效果最好、其次为0.6mol/L KCl-PDA;PEG介导原生质体转化过程中,加入5 mmol/L亚精胺、PEG加入间隔时间10 min、原生质体复苏3 d后添加250μg/mL潮霉素抗性标记进行筛选,转化效率最高。此外,通过建立的转化系统获得3个CgPro1敲除突变株及3个杂合子,表型分析结果显示,该基因参与广东虫草子实体发育过程。【结论】建立了成熟的广东虫草原生质体制备及PEG介导的遗传转化体系,可为今后广东虫草基因功能、蛋白定位等遗传操作研究奠定良好基础,同时为广东虫草遗传育种提供重要应用参考。

关键词：广东虫草原生质体 PEG介导遗传转化基因敲除

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中国鬼笔属真菌的物种多样性与资源

菌物学报 2024年第3期43卷 60-69页

作者：李挺李泰辉邓旺秋广东省科学院微生物研究所、华南应用微生物国家重点实验室、广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070 西藏大学生态环境学院西藏拉萨850011

鬼笔属真菌是大型真菌的一个重要类群,具有重要的经济价值和分类学地位。我国是鬼笔类真菌物种多样性的中心区域之一,分布了约占世界已知鬼笔物种数量的1/4,但鬼笔属真菌的分类一直存在诸多问题。我国过去报道的鬼笔属物种32种,有些分... 详细信息

鬼笔属真菌是大型真菌的一个重要类群,具有重要的经济价值和分类学地位。我国是鬼笔类真菌物种多样性的中心区域之一,分布了约占世界已知鬼笔物种数量的1/4,但鬼笔属真菌的分类一直存在诸多问题。我国过去报道的鬼笔属物种32种,有些分类单元是存在争议的。本研究基于前人的研究和凭证标本,确定我国分布的鬼笔属真菌25种,其中17种有ITS分子序列,15种有LSU分子序列。有7种属于无分布种或待定种。本研究为鬼笔属真菌的分类学研究、栽培和鉴定提供参考。

关键词：竹荪属分类学食用菌栽培

Phomopsis tersa FS441聚酮杂萜类化合物生物合成基因启动子的鉴定

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生物技术通报 2024年

作者：刘玉萍张维阳章卫民叶伟李冬利五邑大学药学与食品工程学院广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室

【目的】Phomeroids为分离自海洋真菌Phomopsis tersa FS441的聚酮杂萜类新骨架化合物，具有良好的抗肿瘤活性。为便于后期对phomeroids生物合成关键基因萜类环化酶编码基因ctg1509和P450单加氧酶编码基因ctg1511进行转录调控，对其启... 详细信息

【目的】Phomeroids为分离自海洋真菌Phomopsis tersa FS441的聚酮杂萜类新骨架化合物，具有良好的抗肿瘤活性。为便于后期对phomeroids生物合成关键基因萜类环化酶编码基因ctg1509和P450单加氧酶编码基因ctg1511进行转录调控，对其启动子功能进行鉴定。【方法】对海洋真菌P. tersa FS441中ctg1509、ctg1511基因启动子p1509、p1511进行克隆，用荧光素酶报告基因载体分析启动子的转录活性，并进一步采用点板实验和生长曲线鉴定其在大肠杆菌中启动氨苄青霉素抗性基因转录的功能，采用PlantCARE数据库分析启动子的调控元件。【结果】p1509的启动子转录活性最强，其活性远强于阳性对照PgpdA启动子，p1509和p1511能在大肠杆菌中启动氨苄青霉素抗性基因的转录。p1509、p1511启动子区域除了含有CAAT-box、TATA-box核心元件，还有参与低温响应、光响应等顺式调控元件。【结论】验证了启动子p1509和p1511的功能。发掘了一个转录活性强于阳性对照的新型强启动子p1509，该启动子含有丰富的调控元件。

关键词：生物合成基因启动子转录活性 Phomopsis tersa 聚酮杂萜元件分析

黑曲霉RAF106 sakA基因的敲除及功能分析

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微生物学报 2024年第8期64卷 2684-2701页

作者：朱韵琦周刚刘通王颖思李素娟彭如群彭红施庆珊王洁谢小保广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室、广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070 华南农业大学食品学院广东广州510642

【目的】黑曲霉(Aspergillus niger)sakA基因是应激丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的重要成员,然而,在黑曲霉中,关于SakA的分子功能研究很少。本研究通过构建黑曲霉sakA缺失突变株探究SakA在黑曲霉中... 详细信息

【目的】黑曲霉(Aspergillus niger)sakA基因是应激丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的重要成员,然而,在黑曲霉中,关于SakA的分子功能研究很少。本研究通过构建黑曲霉sakA缺失突变株探究SakA在黑曲霉中的功能。【方法】以黑曲霉RAF106为出发菌株,通过农杆菌介导法构建突变株ΔsakA菌株。监测ΔsakA菌株与野生菌株在3种不同培养基上生长与产孢情况;研究ΔsakA菌株对不同逆境胁迫的敏感性变化;测定ΔsakA菌株的胞内外淀粉酶、果胶酶和纤维素酶酶活差异;qRT-PCR分析ΔsakA菌株产孢相关基因、淀粉酶相关基因、果胶酶相关基因、纤维素酶相关基因及高渗调节相关基因的相对转录水平。【结果】成功获得3株sakA缺失突变株ΔsakA菌株;发现ΔsakA菌株较野生菌株生长缓慢、产孢延迟及分生孢子梗分化延迟;ΔsakA菌株在0.6 mol/L KCl、0.8 mol/L NaCl和1.2 mol/L NaCl胁迫条件下,菌落生长均比野生型缓慢;ΔsakA菌株胞外淀粉酶产量提高20.68%-21.43%,胞内淀粉酶产量显著下降19.18%-20.26%;胞外果胶酶产量显著下降36.71%-38.30%,胞内果胶酶产量显著上升35.68%-36.53%;与野生菌株相比,ΔsakA菌株胞外纤维素酶产量显著下降28.04%-33.82%,而胞内纤维素酶产量显著上升15.28%-18.19%;产孢相关基因(fluG、sfgA、flbA、flbB、flbD、laeA、brlA、abaA、vosA、stuA和velB)的转录水平相较于野生菌株下调8.53%-90.87%;淀粉酶相关基因(amyC、amyD、amyE、amyF、amyG和amyH)及转录因子(amyR)下调8.87%-87.50%,果胶酶相关基因(aglB、lacA、pexB、pecA、pecC、pecB、endA、endC和poly)下调23.23%-84.01%,纤维素酶相关基因(xlnR、chbA、chbB和eglB)下调3.75%-81.02%,高渗调节相关基因(ena1、ena2、sho1、nik1、ypdl、pkA和hAD)下调5.27%-94.36%。【结论】sakA基因正向调控黑曲霉RAF106的产孢能力,是产孢过程中的重要基因,其缺失影响黑曲霉分生孢子的产生;在参与渗透压胁迫应答的同时对淀粉酶、果胶酶与纤维素酶的合成与分泌有重要作用。

关键词：黑曲霉 sakA基因丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路产孢渗透压代谢

基于免疫蛋白质组学的单增李斯特菌强免疫原性蛋白挖掘

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现代食品科技 2024年第3期40卷 301-308页

作者：张颖吴诗古其会叶青华张菊梅陈谋通吴清平华南农业大学食品学院广东广州510642 广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省微生物安全与健康重点实验室农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室广东广州510070

该研究采用高毒力持留基因型单增李斯特菌819-2菌株全菌蛋白免疫SPF级Balb/C小鼠制备抗血清,利用免疫蛋白质组学对菌株胞外蛋白质组进行分析,旨在挖掘筛选单增李斯特菌强免疫原性蛋白作为特异性抗体制备的候选抗原。超声法提取819-2菌... 详细信息

该研究采用高毒力持留基因型单增李斯特菌819-2菌株全菌蛋白免疫SPF级Balb/C小鼠制备抗血清,利用免疫蛋白质组学对菌株胞外蛋白质组进行分析,旨在挖掘筛选单增李斯特菌强免疫原性蛋白作为特异性抗体制备的候选抗原。超声法提取819-2菌株全菌蛋白免疫SPF级Balb/C小鼠制备抗血清,四次免疫后经间接ELISA测定效价达1:512000。脱氧胆酸钠(DOC)-10%(m/V)TCA沉淀法提取单增李斯特菌819-2菌株胞外蛋白,利用免疫蛋白质组学和LC-MS/MS技术挖掘并鉴定具有强免疫反应的蛋白点,结果表明双向电泳图谱成功获得85个蛋白点,并成功鉴定了P60、InlC、MltG、Enolase和假定蛋白YxeA family protein等5个强免疫原性蛋白,研究结果为基于强免疫原性蛋白制备特异性抗体用于食品及其加工环境中单增李斯特菌富集及快速检测技术研制提供了数据基础。

关键词：单增李斯特菌免疫蛋白质组学抗血清免疫印迹

高效噬菌体防控食品源单增李斯特菌的研究进展

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现代食品科技 2024年第1期40卷 304-311页

作者：梁馨文刘振杰张菊梅陈谋通吴清平华南农业大学食品学院广东广州510642 广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省微生物安全与健康重点实验室农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室广东广州510070

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性致病菌,因其具有耐高盐度、宽pH值和宽温度等特点,对食品安全构成了重大威胁。近年来,由于细菌的耐药进化速度惊人,检测与控制食品中的单增李斯特菌... 详细信息

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性致病菌,因其具有耐高盐度、宽pH值和宽温度等特点,对食品安全构成了重大威胁。近年来,由于细菌的耐药进化速度惊人,检测与控制食品中的单增李斯特菌是食品行业和公共卫生部门面临的一项重要挑战。而噬菌体(Bacteriophage,Phage)因其特异性强、安全性好、繁殖速度快等特点,在食品有害微生物防控应用中显示出巨大的潜力。大量的研究报道表明噬菌体作为一种天然、绿色的杀菌剂,在不同种类食品致病微生物防控中具有很好的前景。尽管噬菌体生物防治仍存在宿主谱窄及宿主易产生抗性菌等挑战,但其作为一种安全有效的方法,将在防控食品中的单增李斯特菌发挥重要作用。本文综述了食品中单增李斯特菌噬菌体分离、快速检测与高效防控方面的研究现状,为开发基于噬菌体的高效防控新技术提供参考。

关键词：单增李斯特菌噬菌体食品安全防控检测

代谢工程改造大肠杆菌合成L-苏氨酸研究进展

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微生物学报 2024年第8期64卷 2648-2660页

作者：罗筱萍苏卜利邓名荣徐晓龙朱红惠五邑大学环境与化学工程学院广东江门529020 广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室农业农村部农业微生物组学重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070

L-苏氨酸是一种人体自身无法合成,必须从食物中摄取的8种必需氨基酸之一,是蛋白质合成的重要组成成分,广泛应用于食品、饲料、医药等多个领域。目前,利用大肠杆菌发酵可获得更理想的苏氨酸产量,是工业上用于苏氨酸生产的主要菌株。随着... 详细信息

L-苏氨酸是一种人体自身无法合成,必须从食物中摄取的8种必需氨基酸之一,是蛋白质合成的重要组成成分,广泛应用于食品、饲料、医药等多个领域。目前,利用大肠杆菌发酵可获得更理想的苏氨酸产量,是工业上用于苏氨酸生产的主要菌株。随着代谢工程技术的发展,对菌株的改造不再局限于传统诱变育种,菌株的定向改造极大地提高了菌株L-苏氨酸的合成能力,促进了L-苏氨酸工业的发展。本文主要从L-苏氨酸的理化性质、合成途径以及利用代谢工程技术在提高L-苏氨酸产量研究中取得的一系列成果进行综述,旨在为改造大肠杆菌高效合成苏氨酸的研究提供更全面的认识。

关键词： L-苏氨酸大肠杆菌代谢调控前体辅因子

鹤山地区健康和失管茶园土壤真菌群落结构差异及其驱动因子分析

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微生物学报 2024年第5期64卷 1417-1435页

作者：王星董义杰冯广达姚青柳陈坚朱红惠昆明理工大学生命科学与技术学院云南昆明650500 广东省科学院微生物研究所、华南应用微生物国家重点实验室、农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室、农业农村部农业微生物组学重点实验室、广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070 华南农业大学园艺学院、广东省荔枝工程技术研究中心广东广州510642

【目的】以鹤山红茶产地生态系统为研究对象,探究健康和失管茶园中土壤真菌群落结构的差异以及土壤理化性质对真菌群落结构的影响。【方法】在鹤山地区健康茶园和管理不善的失管茶园中采集了49份根围土壤样品,采用高通量测序技术分析茶... 详细信息

【目的】以鹤山红茶产地生态系统为研究对象,探究健康和失管茶园中土壤真菌群落结构的差异以及土壤理化性质对真菌群落结构的影响。【方法】在鹤山地区健康茶园和管理不善的失管茶园中采集了49份根围土壤样品,采用高通量测序技术分析茶树根围土壤真菌的群落组成;利用冗余分析研究土壤理化性质对真菌群落结构的影响;进一步通过Wilcoxon秩和检验法分析健康和失管茶园中差异的真菌类群;通过FUNGuild软件对土壤真菌的功能类群进行预测。【结果】研究发现担子菌门、被孢霉门和子囊菌门是茶树根围土壤的优势门;失管茶园中担子菌门的相对丰度显著升高,而被孢霉门则显著降低;根围土壤真菌的丰富度指数、Chao1指数和ACE指数显著低于健康茶园。研究发现总氮、总磷、有效磷、有机质和水解性氮是真菌β多样性差异的主要环境驱动因子;pH、总磷、交换性镁、交换性钙、有效磷和有效钾等与真菌类群间存在显著的相关性。健康和失管茶园中共有的核心操作分类单元(operational taxonomic units,OTUs)是10个,失管茶园中核心类群的相对丰度降低,而中间类群和稀有类群的相对丰度则增加。健康茶园根围土壤核心OTUs中出现了茶轮斑病菌茶拟盘多毛孢和国槐根腐病菌角化可塑镰孢菌(Fusarium keratoplasticum),失管茶园根围土壤核心OTUs中生防菌螺旋木霉(Trichoderma spirale)、深绿木霉(***)的丰度显著较高。失管茶园中病原营养型、病原-腐生-共生过渡型和共生营养型真菌的相对丰度明显增加;而腐生-共生过渡型的真菌则显著降低。【结论】本研究揭示了鹤山地区茶园管理方式与真菌群落结构和土壤理化性质间的关系,为鹤山红茶的病害防治及生防菌筛选指明了方向。

关键词：茶树鹤山地区根围土壤真菌土壤元素含量相关性

Gordonia sp.H52对合成孕激素左炔诺孕酮的降解特性

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微生物学通报 2024年第6期51卷 2127-2140页

作者：赖思华张晋娜邓通初王安国陈乐天许玫英华南农业大学生命科学学院广东广州510642 广东省科学院微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室广东广州510070 广东省环境保护微生物与区域生态安全重点实验室广东广州510070

【背景】合成孕激素左炔诺孕酮因其具有内分泌干扰效应而受到广泛关注,微生物在污染物降解和环境修复方面具有广泛的应用潜力,但目前对左炔诺孕酮在微生物降解中的特性和机理认识仍然有限。【目的】加速左炔诺孕酮污染的治理,亟须分离... 详细信息

【背景】合成孕激素左炔诺孕酮因其具有内分泌干扰效应而受到广泛关注,微生物在污染物降解和环境修复方面具有广泛的应用潜力,但目前对左炔诺孕酮在微生物降解中的特性和机理认识仍然有限。【目的】加速左炔诺孕酮污染的治理,亟须分离获取左炔诺孕酮的高效降解菌并探究其降解机制。【方法】以养殖场的废水为接种物,选育出对左炔诺孕酮具有高效降解功能的菌株;基于菌株形态特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析,确定菌株所属的分类层级;进而通过对左炔诺孕酮的降解动力学进行探究,同时结合菌株全基因组分析及降解产物谱图,确定菌株对左炔诺孕酮的降解特性。【结果】分离获得与Gordonia cholesterolivorans Chol-3的16S rRNA基因序列相似性达99.0%的Gordoniasp.H52,该菌株在18h内可以实现对0.5mg/L左炔诺孕酮的100%去除。液相色谱与串联质谱联用分析结果发现,菌株H52降解左炔诺孕酮后产生5种代谢产物,侧链炔基的裂解及脱羟基是该菌降解左炔诺孕酮的主要途径。该菌株还可以同时促进水体中多种合成孕激素的去除,使左炔诺孕酮的去除率由0%提高到91.06%、醋酸炔诺酮的去除率由37%提高到100%、孕二烯酮的去除率由0%提高到88.87%。【结论】Gordonia sp. H52对合成孕激素左炔诺孕酮表现出高效的降解特性,为合成孕激素污染水体的治理与修复提供了宝贵的菌种资源和理论参考。

关键词：合成孕激素左炔诺孕酮 Gordonia sp.H52 降解特性