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EIF4A3 shRNA慢病毒载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

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吉林大学学报（医学版） 2024年第3期50卷 831-839页

作者：何嘉文李友廖科棋李胜男广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524002 广东医科大学附属医院神经病学研究所广东湛江524002

目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和... 详细信息

目的:构建真核细胞翻译起始因子4A3(EIF4A3)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系。方法:通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库检索EIF4A3基因序列,设计并合成PCR鉴定引物,并将其连接至经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒GV493载体,构建GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒质粒,PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。将GV493空载质粒和GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,分别为GV493对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为空白组、GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组,空白组不作处理,GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组分别采用相应慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,使用10 mg·L-1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞的生长状态和绿色荧光表达情况;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中EIF4A3 mRNA及蛋白表达水平。结果:PCR测序结果显示GV493-EIF4A3-shRNA重组质粒基因序列与设计合成的EIF4A3-shRNA序列一致,成功构建GV493-EIF4A3慢病毒载体。荧光显微镜观察可见HEK293T细胞荧光表达强烈,生长状态良好,慢病毒包装成功。GV493-对照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒的滴度均为2×10~8 TU·mL^(-1),GV493对照组和GV493-EIF4A3 shRNA组Neuro-2a细胞生长状态良好且表达绿色荧光,表明慢病毒感染稳定细胞系构建成功。RT-qPCR法,与空白组和GV493对照组比较,GV493-EIF4A3shRNA组Neuro-2a细胞EIF4A3mRNA表达水平明显降低(P病毒载体,建立了Neuro-2a-EIF4A3-shRNA稳定转染细胞系,为EIF4A3在颅内动脉粥样硬化的作用机制研究提供了参考。

关键词：真核细胞翻译起始因子4A3 短发夹RNA 慢病毒稳定转染细胞系 Neuro-2a细胞

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胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

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吉林大学学报（医学版） 2024年第5期50卷 1322-1329页

作者：李胜男何嘉文廖科棋李友广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524002 广东医科大学附属医院神经病学研究所广东湛江524002

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限... 详细信息

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。

关键词：胞质分裂作用因子4 过表达慢病毒载体 Neuro-2a细胞稳定转染过表达慢病毒

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APOE多态性在炎症因子诱导的神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用

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吉林大学学报（医学版） 2024年第1期50卷 33-41页

作者：王岩李晓慧季瑶崔理立蔡玉洁广东医科大学附属医院广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524001

目的:探讨载脂蛋白E(APOE)基因多态性在神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用,为阿尔茨海默病(AD)发病机制的研究提供理论依据。方法:体外分离培养APOE基因敲除小鼠(APOE^(-/-))原代皮层星形胶质细胞,免疫荧光染色法鉴定细胞纯度。... 详细信息

目的:探讨载脂蛋白E(APOE)基因多态性在神经毒性反应性星形胶质细胞中的差异作用,为阿尔茨海默病(AD)发病机制的研究提供理论依据。方法:体外分离培养APOE基因敲除小鼠(APOE^(-/-))原代皮层星形胶质细胞,免疫荧光染色法鉴定细胞纯度。构建人APOE3和APOE4重组过表达质粒,分别转染至原代APOE^(-/-)星形胶质细胞中,以APOE^(-/-)原代细胞为对照,采用Western blotting法检测细胞中APOE和神经胶质酸性蛋白(GFAP)蛋白表达水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养上清中APOE水平。采用白细胞介素1α(IL-1α)、肿瘤坏死因子(TNF)和补体C1q联合刺激转染APOE3和转染APOE4的原代星形胶质细胞制备炎症模型,分为APOE3+PBS组、APOE4+PBS组、APOE3+IL-1α+TNF+CC1q组和APOE4+IL-1α+TNF+C1q组,采用细胞免疫荧光染色法观察各组细胞形态表现,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(Gpc4)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖6(Gpc6)、血小板反应蛋白1(Thbs1)、血小板反应蛋白2(Thbs2)、酸性分泌蛋白类似蛋白1(Sparcl1)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、C3和S100钙结合蛋白B(S100B)mRNA表达水平,微球吞噬实验检测各组细胞吞噬能力,Western blotting法检测各组细胞中B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)蛋白表达水平。结果:与APOE^(-/-)组比较,转染APOE3和APOE4组细胞中APOE和GFAP蛋白表达水平及细胞培养上清中APOE水平明显升高(P神经毒性反应性星形胶质细胞表型,增加神经毒性,影响星形胶质细胞凋亡,从而加剧神经元损伤。

关键词：阿尔茨海默病星形胶质细胞载脂蛋白E 基因多态性细胞凋亡神经毒性

小胶质细胞介导的神经炎症和突触修剪参与自闭症谱系障碍的研究进展

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厦门大学学报（自然科学版） 2024年第5期63卷 841-849页

作者：孟健张云武厦门大学附属第一医院厦门市脑科中心重点实验室厦门大学医学院神经科学研究所福建省神经退行性疾病及衰老研究重点实验室福建厦门361102

[背景]自闭症谱系障碍(ASD)是一类以社会交往缺陷和重复刻板行为为特征的神经发育障碍.许多遗传因素和环境因素可导致ASD的发生,但ASD明确的致病机制仍不清楚.[进展]近年来,小胶质细胞在ASD中的作用受到越来越多的关注,大量证据表明小... 详细信息

[背景]自闭症谱系障碍(ASD)是一类以社会交往缺陷和重复刻板行为为特征的神经发育障碍.许多遗传因素和环境因素可导致ASD的发生,但ASD明确的致病机制仍不清楚.[进展]近年来,小胶质细胞在ASD中的作用受到越来越多的关注,大量证据表明小胶质细胞在突触形成和ASD疾病发展过程中发挥重要作用.本文根据ASD患者临床样本和ASD动物模型中关于小胶质细胞的研究进展,详细综述了ASD中小胶质细胞介导的神经炎症反应和对突触功能的调控作用.[展望]ASD中小胶质细胞功能为何发生异常以及小胶质细胞如何参与ASD的发生发展仍需进一步探究.小胶质细胞中参与ASD的风险因子有待鉴定,小胶质细胞功能异常影响ASD进程的分子机制也急需阐释.这些将有助于更深入了解小胶质细胞功能异常与ASD之间的联系,从而为ASD的临床诊断和治疗策略提供依据.

关键词：自闭症谱系障碍小胶质细胞神经炎症突触修剪

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阿尔茨海默病治疗药物的突破

科学通报 2024年第17期69卷 2351-2359页

作者：高心怡张娟刘强中国科学技术大学生命科学与医学部合肥微尺度物质科学国家研究中心合肥230027 中国科学技术大学第一附属医院脑衰老与脑疾病研究中心合肥230027 中国科学技术大学衰老生物医学安徽省重点实验室合肥230027 中国科学技术大学中国科学技术大学第一附属医院神经内科合肥230027 中国科学技术大学安徽省生物医学与健康实验室合肥230027 中国科学技术大学生命科学与医学部前沿交叉科学与生物医学研究所合肥230027

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是发病率最高的神经退行性疾病,主要表现为记忆力下降,认知功能缺陷,目前尚无有效的治疗手段.随着人口老龄化加剧,AD发病率逐年上升,找到有效的AD药物刻不容缓.对AD发病机理的研究中,Aβ假说是普... 详细信息

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是发病率最高的神经退行性疾病,主要表现为记忆力下降,认知功能缺陷,目前尚无有效的治疗手段.随着人口老龄化加剧,AD发病率逐年上升,找到有效的AD药物刻不容缓.对AD发病机理的研究中,Aβ假说是普遍接受的致病机制:淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)沉积产生神经毒性,导致神经元死亡.针对该致病机理设计的Aβ单抗药物的研发却很曲折,在2023年7月,美国食品药品监督管理局(*** and Drug Administration,FDA)批准上市抗Aβ的单克隆抗体Lecanemab,在经过18个月的药物注射后,与安慰剂组相比,治疗组患者大脑中Aβ沉积发生明显减少,减缓疾病的进程.与此同时,另一个Aβ单抗Donanemab药物也表现出相似的治疗效果.这不仅证明Aβ假说的正确性,为大量的AD患者带来治疗的希望和曙光.因此,这两种药物被Science评为2023十大科学突破之一.但是,这两种药物仅对AD早期的病人有较好的治疗效果,且药物的使用可能会带来脑出血(amyloid-related imaging abnormalities-hemorrhage,ARIA-H)、脑水肿(amyloid-related imaging abnormalitiesedema or effusions,ARIA-E)等副作用,这些副作用在APOEε4纯和患者出现的比例更高.因此,寻求更安全有效的治疗药物仍需更进一步研究.

关键词：阿尔茨海默病 Aβ假说单抗类药物 Lecanemab Donanemab

帕金森病心血管系统自主神经功能与排尿症状相关性研究

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中国神经精神疾病杂志 2024年第8期 463-469页

作者：高子淇杨瑞黄文琳蔡梦飞张玉虎华南理工大学医学院南方医科大学附属广东省人民医院(广东省医学科学院)神经科(广东省神经科学研究所) 广州市神经退行性疾病诊治研究重点实验室

目的探讨帕金森病（Parkinson disease, PD）患者心血管系统自主神经功能与排尿症状之间的相关性。方法回顾性分析2020年11月至2023年7月就诊于广东省人民医院神经内科的PD患者临床资料。根据是否伴有夜间高血压（nocturnal hypertens... 详细信息

目的探讨帕金森病（Parkinson disease, PD）患者心血管系统自主神经功能与排尿症状之间的相关性。方法回顾性分析2020年11月至2023年7月就诊于广东省人民医院神经内科的PD患者临床资料。根据是否伴有夜间高血压（nocturnal hypertension, NH），将患者分为两组：有夜间高血压的PD患者（PD-NH组）和无夜间高血压的PD患者（PD-nNH组），对排尿指标进行组间比较。根据24 h动态血压监测（ambulatory blood pressure monitoring, ABPM）测量值计算血压平均真实变异性（average real variability, ARV），并使用广义线性模型分析其相关指标。结果87例PD患者中，46例（52.87%）存在NH。PD-NH组膀胱残余尿量（post void residual, PVR）[1.00(0.00, 21.25)mL]多于PD-nNH组[0.00(0.00,5.50)mL]，差异有统计学意义（U=1147.000,P神经功能障碍中，心血管系统与泌尿系统之间存在相关性。

关键词：帕金森病心血管系统自主神经功能障碍下尿路症状夜间高血压血压变异性膀胱残余尿量

精神分裂症患者氨磺必利血药浓度治疗参考范围的真实世界数据研究

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中国医院药学杂志 2024年

作者：甘桐营刘畅李琳李璐广州医科大学附属脑科医院药剂科广东省神经科学疾病研究重点实验室/神经致病基因与离子通道病省部共建重点实验室浙江大学医学院附属第一医院临床药学部浙江省药物临床研究与评价技术重点实验室

目的：基于临床总体印象量表（clinical global impression，CGI）疗效评分和不良反应评估，收集出院医嘱治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）数据，验证提高氨磺必利血药浓度治疗参考范围(320～600 ng·mL-1)在真实临床... 详细信息

目的：基于临床总体印象量表（clinical global impression，CGI）疗效评分和不良反应评估，收集出院医嘱治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）数据，验证提高氨磺必利血药浓度治疗参考范围(320～600 ng·mL-1)在真实临床应用中的合理性。方法：回顾分析2022年1月至2023年12月广州医科大学附属脑科医院精神分裂症患者氨磺必利TDM结果及剂量调整情况，比较调整前后血药浓度变化及与出院医嘱TDM结果的差异。结果：共纳入430例患者（103例中途停药、327例出院带药）TDM数据，其中269例患者氨磺必利出院医嘱TDM结果为（390.17±246.01）ng·mL-1，仅40.52%血药浓度集中在神经精神药理学与药物精神病学协会（Arbeitsgemeinschaft für Neuropsychopharmakologie und Pharmakopsychiatrie，AGNP）指南治疗参考范围(100～320 ng·mL-1)内，而100～600 ng·mL-1范围内血药浓度占76.21%。70例用药调整后复查TDM结果在320～600 ng·mL-1区间增加14.29%，剂量增加组（n=35）在>320 ng·mL-1区间有最大增幅（28.57%），减小组（n=34）在>600 ng·mL-1区间有最大降幅（29.41%）。结论：在真实世界临床应用中，氨磺必利血药浓度在320～600 ng·mL-1范围有良好的有效性和安全性，进一步验证了氨磺必利100～600 ng·mL-1的血药浓度参考范围在的合理性。

关键词：氨磺必利血药浓度治疗药物监测治疗参考范围

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腓骨肌萎缩症的诊治

中华神经科杂志 2024年第3期57卷 290-297页

作者：姚晓黎何若洁中山大学附属第一医院神经科(广东省重大神经疾病诊治研究重点实验室、国家临床重点专科和国家重点学科) 广州510080

腓骨肌萎缩症是最常见的一组遗传性周围神经病,临床特点包括对称性远端为主的肌无力伴萎缩、感觉减退以及弓形足、脊柱侧凸等骨骼畸形。临床上根据神经电生理、病理学和遗传学特点可分为多种亚型,基因检测手段有助于明确其致病基因。康... 详细信息

腓骨肌萎缩症是最常见的一组遗传性周围神经病,临床特点包括对称性远端为主的肌无力伴萎缩、感觉减退以及弓形足、脊柱侧凸等骨骼畸形。临床上根据神经电生理、病理学和遗传学特点可分为多种亚型,基因检测手段有助于明确其致病基因。康复治疗、外科矫形手术治疗和改善症状的药物治疗有助于缓解疾病症状,减轻骨骼畸形。部分针对病因和发病机制的特异性治疗药物已进入临床试验阶段,其疗效和安全性有待进一步明确。

关键词：夏科-马里-图斯病诊断治疗

孤独症儿童血浆中缬氨酸水平变化及其与发育商的关系

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北京大学学报(医学版) 2024年

作者：徐新杰蔡小娥孟凡超龙波尤欣张嵘中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院医学科学研究中心北京市海淀医院康复医学科首都医科大学附属北京安定医院国家精神心理疾病临床医学研究中心精神疾病诊断与治疗北京市重点实验室中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院免疫内科北京大学神经科学研究所北京大学基础医学院神经生物学系神经科学教育部重点实验室卫生部神经科学重点实验室北京大学医学部孤独症研究中心

目的：比较孤独症儿童与健康儿童血浆中缬氨酸水平的差异，并探究孤独症儿童血浆缬氨酸水平与其发育商评分的相关性。方法：共招募29例孤独症儿童作为病例组，同期招募30例同年龄段的正常儿童作为对照组。采用儿童孤独症评定量表（child... 详细信息

目的：比较孤独症儿童与健康儿童血浆中缬氨酸水平的差异，并探究孤独症儿童血浆缬氨酸水平与其发育商评分的相关性。方法：共招募29例孤独症儿童作为病例组，同期招募30例同年龄段的正常儿童作为对照组。采用儿童孤独症评定量表（childhood autism rating scale， CARS）对孤独症儿童的核心症状及其严重程度进行评估，采用Gesell发育量表（Gesell developmental schedules， GDS）评估儿童发育商，采用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆缬氨酸水平，并比较两组间差异，分析病例组儿童血浆缬氨酸水平与其发育商评分间的相关性。结果：与对照组相比，孤独症组血浆缬氨酸水平显著偏低，差异有统计学意义（P学意义（P相关，但与适应性、大运动和语言方面的评分无显著相关（P>0.05）。根据CARS量表评分标准，将孤独症组儿童根据病情严重程度分为轻中度和重度两个亚组，在亚组之间进行比较发现，重度孤独症儿童在GDS量表适应性、精细运动、语言以及个人-社交方面的评分均显著低于轻中度孤独症儿童（P学意义（P>0.05）。结论：孤独症儿童血浆中缬氨酸水平偏低，且与其精细运动和个人-社交功能之间存在一定关联。

关键词：孤独症缬氨酸发育商