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重组大肠杆菌全细胞催化制备假尿苷

生物工程学报 2024年第3期40卷 799-811页

作者：王倩倩刘亚琦屈琰刘欢高歌徐庆阳陈宁范晓光天津科技大学生物工程学院天津300457 天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,... 详细信息

假尿苷是非编码RNA中含量最多的修饰核苷,在生物和医药领域用途广泛。现有的假尿苷制备方法普遍存在步骤繁琐、生产效率低、生产成本高等缺点。本研究在大肠杆菌中设计了新颖的酶级联反应路线,并实现了全细胞催化尿苷制备假尿苷。首先,质粒过表达内源的假尿苷-5-磷酸糖苷酶、核糖激酶和核糖核苷水解酶,构建出尿苷到假尿苷的代谢途径,实现了假尿苷的积累;然后,筛选内源的高活性核糖核苷水解酶,促进了尿苷的水解,为假尿苷的合成提供了更多前体;接着,对底物与产物的转运途径进行改造,提升假尿苷产量的同时避免了副产物尿苷的积累。最终获得的重组菌株Ψ-7在24 h内可以全细胞催化30 g/L尿苷产生27.24 g/L假尿苷,转化率为90.8%,生产效率为1.135 g/(L·h),假尿苷产量和生产效率为现有酶催化法报道的最高值。

关键词：假尿苷大肠杆菌全细胞催化假尿苷-5-磷酸糖苷酶核糖激酶核糖核苷水解酶

核酸切除修复途径相关基因对酿酒酵母耐受性的影响

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食品与发酵工业 2024年第12期50卷 109-117页

作者：刘玲王玥琦刘治国王金晓林良才张翠英天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457 天津科技大学生物工程学院天津300457

酿酒酵母在工业发酵过程中会受到多种环境压力,包括氧化、高温、酸、乙醇及高渗等,因此选育高耐性酿酒酵母对工业生产具有重要意义。微生物中DNA重组酶、核酸修复酶等与核酸修复相关的蛋白与菌体对不良环境的耐受性有关。该实验基于核... 详细信息

酿酒酵母在工业发酵过程中会受到多种环境压力,包括氧化、高温、酸、乙醇及高渗等,因此选育高耐性酿酒酵母对工业生产具有重要意义。微生物中DNA重组酶、核酸修复酶等与核酸修复相关的蛋白与菌体对不良环境的耐受性有关。该实验基于核酸切除修复途径,通过基因工程手段,探究酿酒酵母内源核酸切除修复基因(RAD 16、RAD7、RAD23和RAD4)和外源基因(UVRA)对酿酒酵母耐受性的影响。结果表明,过表达酿酒酵母自身核酸切除修复基因RAD16、RAD7、RAD23及RAD4提高了酿酒酵母高渗耐受性。过表达UVRA基因可以提高菌株高渗耐受性,这意味着该元件在真核和原核细胞中存在功能上的保守性。这些结果有助于提高酿酒酵母对环境胁迫尤其是高渗透压环境的耐受性,并为研究酵母耐受性机制提供了新的思路。

关键词：酿酒酵母核酸切除修复基因菌株选育高渗耐受性基因编辑

木葡糖酸醋杆菌运动相关基因的敲除及对细菌纤维素合成的影响

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生物工程学报 2024年第6期40卷 1856-1867页

作者：刘嘉恒王旭彭昭君辛波钟成天津科技大学食品营养与安全国家重点实验室天津300457 天津科技大学教育部工业发酵微生物重点实验室天津300457

细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)是由细菌合成的高分子生物聚合物,具有持水性高、结晶度高、纯度高等优良特性,广泛应用于食品、医疗、化妆品和功能膜等领域。木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus)是BC合成研究的模式菌株。在... 详细信息

细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)是由细菌合成的高分子生物聚合物,具有持水性高、结晶度高、纯度高等优良特性,广泛应用于食品、医疗、化妆品和功能膜等领域。木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus)是BC合成研究的模式菌株。在细菌中,运动相关基因与BC合成有关,而在木葡糖酸醋杆菌CGMCC2955中,尚不清楚运动相关基因的功能及其对BC合成的影响。本研究利用λ-Red重组系统敲除细菌运动相关基因motA、motB、mot2A,以此构建了敲除菌株K.x-ΔmotA、K.x-ΔmotB、K.x-Δmot2A及双敲菌株K.x-ΔmotAB。结果表明:敲除菌K.x-ΔmotAB的BC产量最高,达到(5.05±0.26)g/L,与野生型菌株相比,提高24%左右;同时,该菌株合成的BC的孔隙率最低,达到了54.35%,并具有更优越的力学性能,杨氏模量可达5.21 GPa。在木葡糖酸醋杆菌CGMCC 2955中敲除运动相关基因之后,并未降低BC的产量,反而促进了BC的合成,进一步加深了醋酸菌中运动性与BC关系的认知;并且敲除motA和motB基因后,降低了BC的孔隙率并提升了BC的力学性能,为BC合成及膜结构调节改造提供了参考。

关键词：木葡糖酸醋杆菌细菌纤维素运动相关基因基因敲除

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大肠杆菌肌苷酸节点代谢优化高效合成肌苷

食品与发酵工业 2024年第4期50卷 44-50页

作者：刘铁重高志强侯德欣谢希贤吴鹤云天津科技大学生物工程学院天津300457 工业发酵微生物教育部重点实验室(天津科技大学) 天津300457

该研究以产肌苷的大肠杆菌INO4-5为出发菌,针对其发酵过程中副产物含量高、肌苷产量低以及需要额外添加腺嘌呤等问题,对肌苷酸节点代谢流进行了优化。首先使用不同启动子和核糖体结合位点对枯草芽孢杆菌来源的purA_(bsu)基因进行了表达... 详细信息

该研究以产肌苷的大肠杆菌INO4-5为出发菌,针对其发酵过程中副产物含量高、肌苷产量低以及需要额外添加腺嘌呤等问题,对肌苷酸节点代谢流进行了优化。首先使用不同启动子和核糖体结合位点对枯草芽孢杆菌来源的purA_(bsu)基因进行了表达,以强化腺苷合成支路,使菌株5 L发酵罐上的肌苷产量达到了29.5 g/L,且无需额外添加腺嘌呤。接着通过替换guaB基因的原有启动子以弱化鸟苷合成支路,并过表达guaC基因促使鸟苷酸回流至肌苷酸,使菌株副产物含量显著降低且肌苷产量提升至35.1 g/L;最后对不同5′-核苷酸酶进行了筛选和强化,发现引入来自酿酒酵母的特异性5′-核苷酸酶基因(introduction of specific 5′-nucleotidase gene,ISN1)可有效促进肌苷生产。最终所得菌株INO7-6在5 L发酵罐上发酵,肌苷产量为41.2 g/L,转化率为0.17 g/g葡萄糖,生产强度为0.86 g/(L·h),为目前报道的基因工程菌株的最高产量。

关键词：肌苷肌苷酸大肠杆菌代谢工程发酵

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低分子量透明质酸合成研究进展

生物工程学报 2024年

作者：狄靖宜裴旭娟刘浩高伟霞天津科技大学生物工程学院天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是d-葡萄糖醛酸与N-乙酰葡萄糖胺组成的高聚合线性多糖，不同分子量的透明质酸功能也大不相同。随着科学技术的进步，低分子量HA在医疗领域的应用日益增多，可作为靶向抗肿瘤药物的载体、生产各种伤口敷... 详细信息

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是d-葡萄糖醛酸与N-乙酰葡萄糖胺组成的高聚合线性多糖，不同分子量的透明质酸功能也大不相同。随着科学技术的进步，低分子量HA在医疗领域的应用日益增多，可作为靶向抗肿瘤药物的载体、生产各种伤口敷料、应用于药物传递系统等，有着良好的市场前景与广泛的应用价值。本文全面梳理了近年来关于低分子量透明质酸的研究进展，例如传统的物理、化学降解法制备低分子量透明质酸，诱变育种获得生产低分子量HA的新菌株等，并深入探讨了新兴的合成生物学策略在其生产中的应用，例如通过透明质酸合酶改造、合成代谢途径调控改变底物平衡等。通过总结与分析，本文旨在为低分子量透明质酸的高效生产提供新的思路和方法，同时指出了当前研究中的难点和挑战，以期为未来的研究提供帮助。

关键词：低分子量透明质酸合成生物学透明质酸合酶底物平衡

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骨化二醇及骨化三醇生物合成研究进展

生物工程学报 2024年第6期40卷 1601-1619页

作者：艾佳莹高吉凯殷子扬毛淑红工业发酵微生物教育部重点实验室天津300457 天津市工业微生物学重点实验室天津300457 天津科技大学生物工程学院天津300457

维生素D_(3)是对人体健康十分重要的维生素,可以促进肠道对钙的吸收、防止佝偻病等。骨化二醇[25(OH)VD_(3)]和骨化三醇[1α,25(OH)_(2)VD_(3)]是维生素D_(3)的两种活性衍生物,在防治骨质疏松及调节人的生理功能方面发挥着重要作用。目... 详细信息

维生素D_(3)是对人体健康十分重要的维生素,可以促进肠道对钙的吸收、防止佝偻病等。骨化二醇[25(OH)VD_(3)]和骨化三醇[1α,25(OH)_(2)VD_(3)]是维生素D_(3)的两种活性衍生物,在防治骨质疏松及调节人的生理功能方面发挥着重要作用。目前,骨化二醇及骨化三醇的生产以化学合成居多,但化学合成具有产物产量低、副产物多以及对环境不友好等缺点。因此开发一种绿色、安全、对环境友好的生物催化合成途径显得尤为重要。本文综述了骨化二醇及骨化三醇的生物催化合成途径,并介绍了该途径中的关键酶P450酶,包括P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases,CYPs)和P450过加氧酶(unspecific peroxygenases,UPOs)。其中研究较为广泛的是P450单加氧酶,通过解析其催化作用机制,分析不同氧化还原伴侣适配以及关键氨基酸残基对酶催化活性的重要影响。此外,对利用H2O2驱动的UPOs的催化机理、高效异源表达策略以及H2O2的原位再生等方面也进行了总结,UPOs优势在于既不需要昂贵的辅因子也不需要氧化还原伴侣的参与,是十分有前景的生物催化剂。本文为进一步开发或改造相关P450酶来高效生产VD_(3)活性衍生物提供了重要的参考。

关键词：骨化二醇骨化三醇 P450s 生物催化合成

一株彭氏变形杆菌噬菌体phiP4-3生物学特性及基因组学研究

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中国生物工程杂志 2024年第8期44卷 4-13页

作者：何洋李东航荆兆元杨洪江杰科(天津)生物医药有限公司工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院

背景：彭氏变形杆菌是重要的致病菌，其耐药菌株的出现给公共卫生和食品安全带来了严重威胁。噬菌体能杀死病原菌，具有替代抗生素的潜在能力。目的：以彭氏变形杆菌(Proteus penneri)为宿主菌，从淡水鱼肠道中分离得到一株烈性噬菌体ph... 详细信息

背景：彭氏变形杆菌是重要的致病菌，其耐药菌株的出现给公共卫生和食品安全带来了严重威胁。噬菌体能杀死病原菌，具有替代抗生素的潜在能力。目的：以彭氏变形杆菌(Proteus penneri)为宿主菌，从淡水鱼肠道中分离得到一株烈性噬菌体phiP4-3,并对其生物学特性、基因组学和分类学进行了研究。方法：使用透射电子显微镜观察噬菌体的形态；通过一步生长曲线和抑菌曲线，分析噬菌体的杀菌效果；通过基因组测序、注释和比较基因组学分析噬菌体的功能和分类。结果：通过透射电子显微镜观察，phiP4-3噬菌体头部直径为98.83 nm,可伸缩尾部长度为55.35 nm。一步生长曲线结果显示，该噬菌体的潜伏时间约为25 min,每个感染中心释放的噬菌体数量约为17 PFU。抑菌曲线结果显示，噬菌体phiP4-3能有效抑制宿主菌生长。基因组测序组装结果显示，噬菌体phiP4-3的基因组长度为167 849 bp, GC含量为31.5%。使用软件对基因组进行注释，发现噬菌体phiP4-3的基因组上共编码270个ORF和8个tRNA基因。综合比较基因组学、分类学及国际病毒分类委员会(ICTV)的分类结果，将其归类为Straboviridae科Bragavirus属病毒。结论：分离得到一株新彭氏变形杆菌噬菌体，并对其生物学特性和基因组进行了分析，为噬菌体在公共卫生和食品安全中的应用提供了理论依据。

关键词：彭氏变形杆菌噬菌体phiP4-3 基因组学比较基因组学分类学

基于转化相关重组克隆曲酸合成基因簇及其在黑曲霉中的异源整合表达

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微生物学通报 2024年

作者：赵宇欣谭宇洋高莹朱柏松张明怡曹威天津科技大学生物工程学院工业发酵微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间... 详细信息

【背景】黑曲霉是一种重要的丝状真菌底盘细胞，然而对其进行大片段DNA的遗传操作存在工具缺乏、效率低下的问题。海量基因组数据中存在大量未被鉴定的次级代谢产物合成基因簇，因相应DNA分子量大而难以克隆，大部分基因与产物分子之间的映射关系尚未被解析。【目的】开发一种适配黑曲霉的大片段DNA分子直接克隆的方法。以直接克隆米曲霉来源的曲酸合成基因簇(约30 kb)在黑曲霉底盘细胞中表达，实现曲酸的异源发酵。【方法】基于转化相关重组(transformation-associated recombination， TAR)克隆，构建适配黑曲霉转化的TAR捕获骨架载体pSEA-TAR；将曲酸合成基因簇上下游各1 kb同源DNA序列先后引入pSEA-TAR，中间以唯一的XhoⅠ相隔，得到曲酸合成基因簇捕获载体pSEA-KLR；随后，将NotⅠ/SbfⅠ消化后含有完整曲酸合成基因簇及上下游同源序列的米曲霉基因组与经XhoⅠ线性化的pSEA-KLR共同转化酿酒酵母VL6-48，通过营养缺陷筛选，获得成功捕获曲酸合成基因簇的重组子，提取质粒，电转化大肠杆菌扩增重组质粒；借助农杆菌介导黑曲霉转化，对获得的含有曲酸合成基因簇的黑曲霉转化子进行曲酸发酵，检测曲酸合成水平。【结果】获得了含有ARSH4/CEN6、TRP1、hph和LB/RB-T-DNA repeat的基于TAR克隆、适配黑曲霉表达的大片段DNA捕获载体pSEA-TAR。借助酿酒酵母高效的同源重组系统，通过同源重组获得含有曲酸合成基因簇的重组质粒pSEA-TAR-KA，捕获成功率为5.9%。对获得的含有曲酸合成基因簇的10株黑曲霉重组菌株KA1-KA10进行发酵分析发现均成功合成了曲酸，其中黑曲霉KA-2发酵7 d后曲酸水平最高，达到5.86 g/L。【结论】构建了适配黑曲霉的TAR克隆体系，用于大片段DNA高效捕获、重构和表达大型生物合成基因簇。以来源于米曲霉的曲酸合成基因簇捕获及在黑曲霉中成功实现曲酸合成验证了其有效性，进一步丰富了黑曲霉作为底盘细胞在重要化合物绿色生物制造中的作用。

关键词：转化相关重组(TAR)克隆大片段DNA 黑曲霉曲酸合成基因簇

基于转录调节因子PuuR的1，4-丁二胺生物传感器的构建与优化

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生物工程学报 2024年

作者：刘俊杰蒋敏敏孙彤孙祥祥赵咏灿顾明霞路福平黎明工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院

生物传感器已经成为实时监测特定小分子和精确控制生物系统中基因表达的强大工具。用于1，4-丁二胺生物合成的高通量传感器可以极大地提高1，4-丁二胺高产菌株的筛选效率。然而，调整生物传感器特性的策略仍然很少被研究，这限制了1，4... 详细信息

生物传感器已经成为实时监测特定小分子和精确控制生物系统中基因表达的强大工具。用于1，4-丁二胺生物合成的高通量传感器可以极大地提高1，4-丁二胺高产菌株的筛选效率。然而，调整生物传感器特性的策略仍然很少被研究，这限制了1，4-丁二胺生物传感器的广泛适用。本研究开发了一种以转录调节因子PuuR为基础的1，4-丁二胺生物传感器，其同源的操作子puuO被安装在大肠杆菌组成型启动子PgapA中，以控制下游的高能绿色荧光蛋白（superfolder green fluorescent protein， sfGFP）作为报告蛋白表达。采用大肠杆菌基因组中不同强度的启动子对1，4-丁二胺生物传感器进行分子改造，探究并改进基于PuuR的1，4-丁二胺生物传感器的功能性质，为高通量筛选高产1，4-丁二胺的工程菌株奠定基础。

关键词：大肠杆菌 1,4-丁二胺生物传感器转录调节因子PuuR